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高中生物选修一生物技术实践 知识点总结专题一 传统发酵技术的应用 课题1 果酒和果醋的制作1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵 3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 孢子生殖4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H12O66O26CO26H2O5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C6H12O62C2H5OH6CO26、20左右最适宜酵母菌繁殖 酒精发酵时一般将温度控制在18-25 7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。8、醋酸菌是单细胞细菌(原核生物),代谢类型是异养需氧型,生殖方式为二分裂9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C2H5OHO2CH3COOHH2O10、控制发酵条件的作用醋酸菌对氧含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。醋酸菌最适生长温度为3035，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。11、实验流程：挑选葡萄冲洗榨汁酒精发酵果酒（醋酸发酵果醋）12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2L，再滴入物质的量浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。13、应先冲洗，再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。14、你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。课题2 腐乳的制作1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。营腐生生活。2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。3、实验流程：让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。5、将豆腐切成3cm3cm1cm的若干块。豆腐的含水量为70左右，水分过多则腐乳不易成形。毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在1518，并保持一定的温度。来源：1.来自空气中的毛霉孢子，2. 直接接种优良毛霉菌种 时间：5天加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味食盐的作用：1.抑制微生物的生长，避免腐败变质2.析出水分，是豆腐变硬，在后期制作过程中不易酥烂3.调味作用，给腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。酒的作用：1.防止杂菌污染2.与有机酸结合形成酯，赋予腐乳风味3.酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。香辛料的作用：1.调味作用2.杀菌防腐作用3.参与并促进发酵过程防止杂菌污染：用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。6、豆腐生长的白毛是毛霉的白色菌丝。严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。7、腐乳外部有一层致密的“皮”。 “皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝（匍匐菌丝），对人体无害。它能形成腐乳的“体”，使腐乳成形。课题3 制作泡菜 反应式为：C6H12O62C3H6O3+能量 制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ，其代谢类型是异养厌氧型。分裂方式是二分裂。 含抗生素牛奶不能生产酸奶的原因是抗生素杀死乳酸菌。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。乳酸杆菌常用于生产酸奶。亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。亚硝酸盐含量发酵时间（d）一般在腌制 10 天后亚硝酸盐含量开始降低，故在10天之后食用最好*定亚硝酸盐含量的原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与 N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，与已知浓度的标准显色液目测比较，估算泡菜中亚硝酸盐含量。专题二 微生物的培养与应用 课题1 微生物的实验室培养培养基： 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。按照物理形态可分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基。在液体培养基中加入凝固剂琼脂后，制成琼脂固体培养基。微生物在固体培养基表面生长，可以形成肉眼可见的菌落。根据菌落的特征可以判断是哪一种菌。液体培养基应用于工业或生活生产，固体培养基应用于微生物的分离和鉴定，半固体培养基则常用于观察微生物的运动及菌种保藏等。按照成分培养基可分为人工合成培养基和天然培养基。合成培养基是用成分已知的化学物质配制而成，其中成分的种类比例明确，常用于微生物的分离鉴定。天然培养基是用化学成分不明的天然物质配制而成，常用于实际工业生产。按照培养基的用途，可将培养基分为选择培养基和鉴定培养基。选择培养基是指在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物生长，促进所需要的微生物的生长。鉴别培养基是根据微生物的特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成的，用以鉴别不同类别的微生物。培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。培养基还要满足微生物生长对PH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件无菌技术获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还能有效避免操作者自身被微生物感染。消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。灭菌方法：接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法； 玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ； 培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。 表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。制作牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）方法步骤：计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。（2）倒平板操作的步骤：将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。 (通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。)用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约1020mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。等待平板冷却凝固，大约需510min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。倒平板操作的讨论1.培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？可用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。纯化大肠杆菌（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。（2）平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。（5）平板划线法操作步骤：将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。将试管口通过火焰。将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。将试管通过火焰，并塞上棉塞。左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。将平板倒置放入培养箱中培养。平板划线操作的讨论1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。（6）涂布平板操作的步骤：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。取少量菌液，滴加到培养基表面。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却810s。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。菌种的保存（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。临时保藏方法（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。放在20的冷冻箱中保存。（2）确定培养基制作是否合格的方法将未接种的培养基在恒温箱中保温12天，无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数（1）选择性培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。（2）配制选择培养基的依据 根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。统计菌落数目（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置35个平板，选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。采用此方法的注意事项：1.一般选取菌落数在30300之间的平板进行计数设置对照设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。实验设计实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。（1）土壤取样铲去表层土，在距地表约38cm的土壤层取样。（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量，一般选用104 105 106 测定放线菌的数量，一般选用103 104 105 测定真菌的数量，一般选用102 103 104（3）微生物的培养与观察 不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌3037 12天 放线菌2528 57天 霉菌2528 34天课题3 分解纤维素的微生物的分离纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素分解菌的筛选（1）筛选方法：刚果红染色法。（2）原理 刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。分离分解纤维素的微生物的实验流程土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落（1）土壤采集 选择富含纤维素的环境。（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤 倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板（3）刚果红染色法种类一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。课题延伸对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选后，只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。专题三 植物的组织培养技术 课题1 菊花的组织培养植物组织培养的基本过程 基因的选择性表达 细胞全能性细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织使用顺序实验结果先生长素，后细胞分裂素有利于分裂但不分化先细胞分裂素，后生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率提高生长素 细胞分裂素比值与结果比值高时促根分化，抑芽形成比值低时促芽分化，抑根形成比值适中促进愈伤组织生长或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物细胞工程具有某种生物全套遗传信息的任何一个活细胞，都具有发育成完整个体的能力，即每个生物细胞都具有全能性。但在生物体的生长发育过程中并不表现出来，这是因为在特定的时间和空间条件下，通过基因的选择性表达，构成不同组织和器官。植物组织培养技术的应用有：实现优良品种的快速繁殖；培育脱毒作物；制作人工种子；培育作物新品种以及细胞产物的工厂化生产等。影响植物组织培养的条件材料：菊花组织培养一般选择未开花植物的茎上部新萌生的侧枝作材料。一般来说，容易进行无性繁殖的植物容易进行组织培养。选取生长旺盛嫩枝进行组培的是嫩枝生理状态好，容易诱导脱分化和再分化。营养：离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的培养基是MS培养基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg，微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co，有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。激素：植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强趋势。在培养基中需要添加生长素和细胞分裂素等植物激素，其浓度、使用的先后顺序、用量的比例等都影响结果。 环境条件：PH、温度、光等环境条件。 不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在1822，并且每日用日光灯照射12h. MS固体培养基中各种营养物质的作用是什么？与肉汤培养基相比，MS培养基有哪些特点？大量元素和微量元素提供植物细胞所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，维持细胞渗透压；甘氨酸、维生素等主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主，MS固体培养基则需提供大量无机营养。外植体的消毒 外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动23次，持续67s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中12min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。接种：接种过程中插入外植体时形态学上端朝上，每个锥形瓶接种78个外植体。外植体接种与细菌接种相似，操作步骤相同，而且都要求无菌操作。培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度（1822）和光照（12h）移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。专题2 月季的花药培养被子植物的花粉发育被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将在分裂一次，形成两个精子。产生花粉植株的两种途径通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。影响花药培养的因素诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素亲本的生理状况：花粉早期是的花药比后期的更容易产生花粉植株，选择月季的初花期。合适的花粉发育时期：一般来说，在单核靠边期期，花药培养成功率最高花蕾：选择完全未开放的花蕾亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响材料的选取：选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色材料的消毒接种和培养：灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，通常每瓶接种花药710个,培养温度控制在25左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般经过2030天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。还需要对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选。植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者的不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。专题五 和蛋白质技术 课题1的粗提取与鉴定在0.14mol/L时溶解度最小； DNA却不能溶于酒精（特别是95冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。实验操作制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放DNA 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内DNA 加入NaCl至2mol/L，同一方向缓慢搅拌DNA析出 加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，在溶解到2mol/L溶液中除去细胞质中的大部分物质。DNA初步纯化 与等体积95冷却酒精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。专题六植物有效成分的提取 课题1植物芳香油的提取天然香料的来源：植物、动物不同植物的根、茎、叶、花、果实、种子都可以提取芳香油。芳香油的提取方法：蒸馏、压榨、萃取等。芳香油的性质：挥发性强，成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。水蒸气蒸馏法：原理：水蒸汽可将挥发性较强的芳香油携带出来形成油水混合物，冷却后水油分层。方法：水中蒸馏：原料放在沸水中加热蒸馏。水上蒸馏：原料隔放在沸水上加热蒸馏。水汽蒸馏：利用外来高温水蒸气加热蒸馏。不足：有些原料不适宜于水中蒸馏，如柑橘、柠檬等易焦糊，有效成分容易水解。通常用压榨法（通过机械压缩力将液相物从液固两相混合物中分离出来的一种简单操作）萃取法：原理：芳香油易溶于有机溶剂，溶剂挥发后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。方法：原料浸泡在溶剂中得到浸泡液有机溶剂挥发芳香油。不足：有机溶剂中的杂质影响芳香油的品质蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、接液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮管。玫瑰精油的提取0.1g/mL氯化钠溶液：促使油水混合物（乳浊液）中油和水的分离。无水硫酸钠：吸收油层中的水分。实验步骤：采集玫瑰花：采集盛花期（5月中上旬）的玫瑰花，清水清洗沥干。装入蒸馏原料：称取50g玫瑰花放入蒸馏瓶，添加200mL蒸馏水。安装蒸馏装置：按照从左向右、自下到上次序安装水蒸气蒸馏装置。加热蒸馏：控制蒸馏时间和速度（12滴/秒），获得乳白色乳浊液；拆卸装置。分离油层：向乳浊液加入NaCl溶液后，利用分液漏斗分离出上面的油层。除去水分：向油层中加入无水硫酸钠，24h后过滤，得到玫瑰油。注意事项：蒸馏时间不能过短，温度不能过高。橘皮精油的提取橘皮精油的主要成分：柠檬烯，主要分布在橘皮中。石灰水：防止压榨时滑脱，提高出油率，降低压榨液黏稠度，过滤不堵塞筛眼。小苏打、硫酸钠：促进油和水的分离（用量分别为橘皮质量的0.25和5）。实验步骤：橘皮的处理：将新鲜橘皮用清水清洗沥干。石灰水浸泡：用78石灰水浸泡橘皮24h。清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水彻底漂洗干净，沥干。粉碎和压榨：将橘皮粉碎，加入小苏打和硫酸钠后，用压榨机压榨得到压榨液。过滤压榨液：用布袋过滤，滤液再高速离心处理，分离出上层橘皮油。静置处理：将橘皮油在510冰箱中静置57d，分离出上层澄清橘皮油。再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油。分析：静置处理目的：除去果蜡和水分。课题2胡萝卜素的提取胡萝卜素性质：橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。依据碳碳双键的数目划分为、 三类。其中最主要的组成成分为-胡萝卜素。作用：治疗夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等疾病；常用于食品色素；使癌变细胞恢复成正常细胞。提取方法主要有三种：从植物中提取从大面积养殖的岩藻中获得利用微生物的发酵生产实验步骤粉碎：使原料与有机溶剂充分接触，增大溶解度。干燥：脱水温度太高，干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。萃取、萃取剂的选择具有较高的沸点的石油醚，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。、影响萃取的因素主要因素：萃取剂的性质和使用量次要因素：原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等一般来说，原料颗粒小，萃取温度高，时间长，需要提取的物质就能够充分溶解，萃取效果就好。萃取前，要将胡萝卜进行粉碎和干燥、胡萝卜素提取装置的设计：萃取过程应该避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸。为了防止加热时有机溶剂挥发，还要在加热瓶口安装回流冷凝装置。萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。在浓缩之前，还要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。过滤：除去萃取液中的不溶物 浓缩：蒸发出有机溶剂鉴定：纸层析法基线：滤纸下端距底边2处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点。点样：用最细的注射器针头（毛细吸管）吸取样品进行点样。点样应该快速细致，在基线上形成直径左右的圆点，每次点样后，可用吹风机将溶剂吹干，注意保持滤纸干燥。等滤纸上的点样液自然挥发干后，将滤纸卷成圆筒状，至于装有深的石油醚的密封玻璃瓶中。等各种色素完全分开后，观察标准样品中位于展开剂前沿的胡萝卜素层析带。12