七种观察方式.ppt

显显微微观观察方式察方式奥林巴斯光学北京奥林巴斯光学北京办办事事处处齐齐冬冬1.观观察方式察方式1.明明场观场观察察2.暗暗场观场观察察(暗暗视视野野)3.相差相差观观察察(相相衬观衬观察察)4.偏光偏光观观察察5.DIC观观察察(微分干涉微分干涉)6.RC观观察察(浮雕相浮雕相衬衬)7.荧荧光光观观察察2.(一一)明明场观场观察方式察方式常常规观规观察方式察方式应应用用领领域：域：常规镜检、病理、染色标本优优点：点：视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察缺点：缺点：透明标本对比度低，标本没有立体感3.明明场观场观察察显显微微镜镜的的调节调节l l瞳距瞳距调节调节l l屈光度屈光度调节调节l l光路光路转换转换l l聚光聚光镜镜中心中心l l孔径光孔径光栏设栏设置置4.瞳距瞳距调节调节刻度指示刻度指示5.屈光度屈光度调节调节调节调节屈光度调节指示6.光光路路转转换换100%100%80%80%20%20%100%100%7.聚光聚光镜镜中心中心调节调节 光光光光轴轴轴轴中心中心中心中心调节调节调节调节螺螺螺螺钉钉钉钉 视场视场视场视场光光光光阑阑阑阑 孔径光孔径光孔径光孔径光阑阑阑阑10X10X10X10X物物物物镜镜镜镜 标标标标本本本本 聚光聚光聚光聚光镜镜镜镜升降旋升降旋升降旋升降旋钮钮钮钮8.孔径光孔径光栏调节栏调节N.A聚=(0 0.6-06-0.8 8)N.A物9.孔孔径径光光栏栏开开度度与与图图象象100%70%30%HRLCHCLRMRMC10.(二二)暗暗视视野野观观察方式察方式1 原理原理丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。2 特点特点观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 0.004 um(明场0.24um)”超显微“。3 缺点缺点只能观察到物体存在、运动和外部形态不方便调节标本要求高（灰尘、盖片、载片）11.4 4 应应应应用：用：用：用：微小粒子、微小粒子、细细菌形菌形态观态观察、察、细细菌菌记记数，透明数，透明标标本本观观察察等等(二二)暗暗视视野野观观察方式察方式12.（三）相差（三）相差观观察方式察方式1 原理原理利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共共轭轭面：吸收光面：吸收光线线，直射光通，直射光通过过补偿补偿面：相位推面：相位推迟迟，衍射光通，衍射光通过过物物镜镜相板相板 聚光聚光镜环镜环状光状光阑阑13.(三三)相差相差观观察方式察方式2 特点特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3 缺点缺点需要光强高切片不能太厚(210um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜14.(三三)相差相差观观察方式察方式4 应应用：用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)15.(三三)相差相差观观察方式察方式5 调节调节：苛勒照明调节将相差物镜及附件转入光路（物镜聚光镜相衬环型号匹配）对样品聚焦取下目镜，装上CT望远镜，调节CT焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合16.（四）偏光（四）偏光观观察方式察方式1 原理原理依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜自然光（多自然光（多振振动动面）面）偏振器偏振器1偏振器偏振器2偏振光（偏振光（单单一振一振动动面）面）各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等17.（四）偏光（四）偏光观观察方式察方式应应用：用：矿物质、化学物品鉴别鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体植物病理检验鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等18.（五）微分干涉（五）微分干涉（DIC）观观察方法察方法19.（五）微分干涉（五）微分干涉观观察方法察方法1 原理原理通过特制的棱镜将偏振光分解相互垂直，强度相等的光束，光束载极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。20.（五）微分干涉（五）微分干涉观观察方法察方法2 特点特点可以使被检物体产生三维立体感觉观察效果更直观无须特殊物镜，与荧光观察配合更好可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。21.（五）微分干涉（五）微分干涉观观察方法察方法3 缺点缺点需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂22.4 应应用：用：无色透明活体无色透明活体标标本的本的细细微微结结构，无构，无色色荧荧光光标标本，染色本，染色标标本，本，显显微操作微操作等等（五）微分干涉（五）微分干涉观观察方法察方法23.（六）浮雕相（六）浮雕相衬显衬显微微镜镜24.（六）浮雕相（六）浮雕相衬显衬显微微镜镜1 原理原理斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。25.2.历历史史1975年，Robert Hoffman 博士发明2002年，专利到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品3.特点特点提高未染色标本的可见性和对比度；图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕；可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头)；可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织；聚光镜的工作距离可以设计的更长；RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察（六）浮雕相（六）浮雕相衬显衬显微微镜镜26.4.缺点缺点观察效果与标本方向密切相关操作较复杂必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜观察荧光效果不如明场物镜5.应应用用所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作（六）浮雕相（六）浮雕相衬显衬显微微镜镜27.荧荧光光观观察察方方法法28.什么是什么是荧荧光光?l 物物质质中的中的电电子吸收光的能量由低能状子吸收光的能量由低能状态转变为态转变为高能状高能状态态，再回到低能状，再回到低能状态时释态时释放出的光，是非放出的光，是非温度温度辐辐射光射光冷光。即：物冷光。即：物质质吸收短波光，吸收短波光，发发射出的射出的长长波光。波光。l显显微微镜荧镜荧光利用光源激光利用光源激发发光化光化荧荧光光29.荧荧光的种光的种类类自自发发（固有）（固有）荧荧光光 二次二次荧荧光光30.荧光显微镜的作用原理宽谱线发宽谱线发射光射光（汞灯）（汞灯）滤滤掉其他光，透掉其他光，透过过激激发发光光激激发滤发滤色片色片吸收吸收滤滤色片色片滤滤掉激掉激发发光，透光，透过过荧荧光光标标本受激本受激发产发产生生荧荧光向四周光向四周发发散散激激发发光受反射、折射光受反射、折射或衍射向四周或衍射向四周发发散散31.荧荧光的性光的性质质l吸收光，必需有激吸收光，必需有激发发光源光源l荧荧光波光波长长激激发发波波长长（损损失失热热能）能）l荧荧光光强强度极小于激度极小于激发发光的光的强强度度l有不同程度的衰减有不同程度的衰减l荧荧光光强强度取决于激度取决于激发发光光强强度、被度、被检检物物浓浓度、度、荧荧光效率光效率32.荧荧光光显显微微镜镜的的优优点和用途点和用途优优点：点：l检检出能力高（放大作用）出能力高（放大作用）l对细对细胞的刺激小（可以活体染色）胞的刺激小（可以活体染色）l能能进进行多重染色行多重染色用途：用途：l物体构造的物体构造的观观察察荧荧光素光素l荧荧光的有无、色光的有无、色调调比比较进较进行物行物质质判判别别抗体抗体荧荧光等光等l发荧发荧光量的光量的测测定定对对物物质质定性、定量分析定性、定量分析33.荧荧光光显显微微镜镜的种的种类类 透射式透射式34.荧荧光光显显微微镜镜的种的种类类落射式落射式35.荧荧光光显显微微镜镜的主要部件的主要部件 透射式透射式l吸收吸收滤滤色色镜镜l暗暗场场聚光聚光镜镜l激激发滤发滤色色镜镜l汞灯光源汞灯光源 落射式落射式l吸收吸收滤滤色色镜镜l分光分光镜镜l激激发滤发滤色色镜镜l汞灯光源汞灯光源36.落射落射荧荧光光显显微微镜镜的构造的构造吸收吸收吸收吸收滤滤滤滤色色色色镜镜镜镜激激激激发滤发滤发滤发滤色色色色镜镜镜镜37.落射落射荧荧光光显显微微镜镜的构造的构造38.荧荧光光显显微微镜镜光源光源 汞灯光源汞灯光源:提供激提供激发发光光(U U、V V、B B、G)G)氙灯光源：氙灯光源：高峰高峰值值更更宽宽，更，更稳稳定定39.荧荧光光显显微微镜镜激激发发透透镜组镜组 激激发发滤滤色色镜镜:激激发发波波长选择长选择 激激发发透透镜组镜组（激（激发块发块）:T%nmBAND PASS入射光入射光发发射光射光激激发发 滤滤色色镜镜分光分光 滤滤色色镜镜吸收吸收 滤滤色色镜镜40.落射落射荧荧光光显显微微镜镜各部件特性和各部件特性和作用作用 吸收吸收滤滤色色镜镜:荧荧光透光透过过,阻阻挡杂挡杂光光 分色分色镜镜:反射激反射激发发光光,荧荧光透光透过过A 透透过过AA 反射反射BB 透透过过B 阻阻挡挡nmnmT%T%A41.落射落射荧荧光光显显微微镜镜各部件特性和各部件特性和作用作用 吸收吸收滤滤色色镜镜:荧荧光透光透过过,阻阻挡杂挡杂光光 分色分色镜镜:反射激反射激发发光光,荧荧光透光透过过A 透透过过AA 反射反射BB，C 透透过过nmnmT%T%AC42.滤滤色色镜镜的的选择选择荧荧荧荧光素的特性光素的特性光素的特性光素的特性滤滤滤滤色色色色镜镜镜镜的特性的特性的特性的特性激激激激发发发发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收43.带宽对图象的影响象的影响SWB:BP420-480SWB:BP420-480WB:BP450-480WB:BP450-480WIB:BP460-490WIB:BP460-490NB:BP470-490NB:BP470-490FITC+PIFITC+PI44.多重染色多重染色标标本的多色本的多色观观察察FITC+Texas Red+DAPIFITC+Texas Red+DAPI45.三色三色滤滤色色镜镜的特性曲的特性曲线线激激激激发发发发分色分色分色分色吸收吸收吸收吸收46.双重染色双重染色标标本的本的单单色和双色色和双色观观察察 WUWU WIBWIBDUALDUAL BANDBANDWIBAWIBAWIGWIGWIBWIBDAPI+FITCDAPI+FITCFITC+PIFITC+PI47.单单色色滤滤色色镜镜的特性曲的特性曲线线48.双色双色滤滤色色镜镜的特性曲的特性曲线线49.现现行行显显微微镜镜特点和各种特点和各种滤滤色色镜镜50.自由自由组组合合 激激发块发块吸收吸收吸收吸收滤滤滤滤色色色色镜镜镜镜激激激激发滤发滤发滤发滤色色色色镜镜镜镜分色分色分色分色镜镜镜镜51.油油镜镜应应使使用用荧荧光光油油52.物物镜镜光光栏栏的运用的运用光光栏栏全开启全开启光光栏栏适当关小适当关小减少减少杂杂散光干散光干扰扰53.荧荧光的衰减光的衰减 防衰减的方法防衰减的方法l使用抗衰减使用抗衰减剂剂l选择选择衰减小的衰减小的荧荧光素光素l降低激降低激发发光光强强度度l降低降低标标本中氧的本中氧的浓浓度度有衰减的有衰减的标标本本54.使用抗衰减使用抗衰减剂剂的效果的效果55.汞灯灯箱构造汞灯灯箱构造灯室，上下、左右旋灯室，上下、左右旋钮钮，聚光，聚光镜镜旋旋钮钮56.汞灯中心汞灯中心调节调节方法方法l l放置放置荧荧光光调调中板或一中板或一张张白白纸纸于于载载物台上物台上l l转转入入B或或G激激发滤发滤色色镜镜l l用用10X物物镜观镜观察并聚焦察并聚焦l l取下取下10X物物镜镜l l通通过过汞灯箱上聚焦旋汞灯箱上聚焦旋钮钮聚焦汞灯聚焦汞灯电电极于白极于白纸纸l l通通过过汞灯箱上下、左右旋汞灯箱上下、左右旋钮调钮调汞灯汞灯电电极中心极中心于白于白纸纸上上圆环圆环中心中心57.1.明明场观场观察察常常规规染色片（染色片（HE染色等）染色等）2.暗暗场观场观察察微粒外微粒外观观（细细菌菌记记数等）数等）3.相差相差观观察察活活细细胞胞标标本（本（细细胞培养、胞培养、膜片膜片钳钳等）等）4.偏光偏光观观察察双折射物双折射物质质（晶体（晶体检测检测）5.DIC观观察察活活细细胞等（胞等（细细胞培养，胞培养，显显微操作等）微操作等）6.RC观观察察 显显微操作微操作7.荧荧光光观观察察 物物质鉴质鉴定（抗体、抗原、定（抗体、抗原、荧荧光原位光原位杂杂交交等）等）58.59.