蛋白质与人类健康.ppt

蛋白质与人类健康蛋白质与人类健康报告内容报告内容蛋白蛋白质分子分子结构构蛋白蛋白质样品制品制备蛋白蛋白质结构构测定定蛋蛋白白质(protein)(protein)是是由由许多多氨氨基基酸酸(amino(amino acids)acids)通通过肽键(peptide(peptide bond)bond)相相连形成的高分子含氮化合物。形成的高分子含氮化合物。蛋白蛋白质是生物体重要是生物体重要组成成分成成分分分布布广广：所所有有器器官官、组织都都含含有有蛋蛋白白质；细胞的各个部分都含有蛋白胞的各个部分都含有蛋白质。含含量量高高：蛋蛋白白质是是细胞胞内内最最丰丰富富的的有有机机分分子子，占占人人体体干干重重的的45，某某些些组织含含量量更更高高，例如脾、肺及横例如脾、肺及横纹肌等高达肌等高达80。蛋白质是生命活动主要载体和功能执行者蛋白质是生命活动主要载体和功能执行者免疫防卫免疫防卫病毒感染病毒感染细胞生长细胞生长信号转导信号转导药理过程与药物设计药理过程与药物设计酶催化机制酶催化机制蛋白质的功能与其三维结构密切相关组成蛋白质的元素组成蛋白质的元素主要有主要有C C、H H、O O、N N和和S S。有些蛋白有些蛋白质含有少量磷或金属元素含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个，个别蛋白蛋白质还含含有有碘碘 。氨基酸是蛋白质组成基本单位氨基酸是蛋白质组成基本单位存存在在自自然然界界中中的的氨氨基基酸酸有有300300余余种种，但但组成成人人体体蛋蛋白白质的的氨氨基基酸酸仅有有2020种种，且均属且均属 L-L-氨基酸氨基酸（甘氨酸除外）。（甘氨酸除外）。H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式R依据侧链性质氨基酸分四类依据侧链性质氨基酸分四类非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸碱性氨基酸甘氨酸甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸脯氨酸 proline Pro P 6.301.非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸色氨酸色氨酸 tryptophan Try W 5.89丝氨酸丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65苏氨酸苏氨酸 threonine Thr T 5.602.极性中性氨基酸极性中性氨基酸天冬氨酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸组氨酸 histidine His H 7.593.酸性氨基酸酸性氨基酸4.碱性氨基酸碱性氨基酸半胱氨酸是蛋白质发生多聚原因之一半胱氨酸是蛋白质发生多聚原因之一+二硫键二硫键-HH半胱氨酸半胱氨酸分子间发生该反应导致蛋白质聚集；分子间发生该反应导致蛋白质聚集；分子内发生该反应会导致蛋白质构象发生变化；分子内发生该反应会导致蛋白质构象发生变化；紫外吸收用于测定蛋白质浓度紫外吸收用于测定蛋白质浓度大多数蛋白大多数蛋白质含有含有色氨酸、酪氨酸，色氨酸、酪氨酸，它它们最大吸收峰在最大吸收峰在A=280nm 附近。附近。所以所以测定蛋白定蛋白质溶溶液液280nm的光吸的光吸收收值是分析溶液中是分析溶液中蛋白蛋白质含量的快速含量的快速简便的方法。便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收A280=*c*L一级结构一级结构(primarystructure)二级结构二级结构(secondarystructure)三级结构三级结构(tertiarystructure)四级结构四级结构(quaternarystructure)高级结构高级结构(蛋白质构象蛋白质构象)蛋白质分子结构蛋白质分子结构多肽链是蛋白质分子的结构基础多肽链是蛋白质分子的结构基础*肽肽键键(peptidebond)是是由由一一个个氨氨基基酸酸的的-羧羧基基与与另另一一个个氨氨基基酸酸的的-氨氨基基脱脱水水缩缩合合而形成的化学键。而形成的化学键。氨基酸通过氨基酸通过肽键肽键相互连接构成多肽链相互连接构成多肽链+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键肽键多肽链有两端多肽链有两端:N末端与末端与C末端末端N N末端末端C C末端末端二二硫硫键键牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构定定义：蛋白蛋白质的一的一级结构指多构指多肽链中中氨基酸排列氨基酸排列顺序。序。主要的化学主要的化学键肽键，有些蛋白，有些蛋白质还包括二硫包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异一级结构是蛋白质空间构象和特异性生物学功能的基础性生物学功能的基础一级结构发生变异会导致一级结构发生变异会导致“分子病分子病”N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS肽链肽链HbA肽肽链链N-val his leu thr pro val glu C(146)血血红蛋白蛋白HbA序列序列变化化导致致镰刀形红细胞贫血镰刀形红细胞贫血蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构定定义:蛋白蛋白质分子中某一段分子中某一段肽链的局部空的局部空间规律性排列，即律性排列，即该段段肽链主主链骨架原子的骨架原子的相相对空空间位置，并不涉及氨基酸残基位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象的构象。主要的化学主要的化学键：氢键蛋白质二级结构主要表现形式蛋白质二级结构主要表现形式 -螺旋螺旋(-helix)-折叠折叠(-sheet)-转角角(-turn)无无规卷曲卷曲(randomcoil)-螺旋螺旋(-helix)-折叠（折叠（-sheet)-sheet)-转角和无规卷曲转角和无规卷曲-转角转角(-turn)无规卷曲无规卷曲(randomcoil)是用来阐述没有是用来阐述没有确定规律性的那部分确定规律性的那部分肽链结构。肽链结构。蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构定定义:整条整条肽链中全部氨基酸残基的相中全部氨基酸残基的相对空空间位置。即位置。即肽链中所有原子在三中所有原子在三维空空间的排布位置。的排布位置。主要的化学主要的化学键疏水疏水键、离子、离子键、氢键和和 Van der Waals力等。力等。模体与结构域模体与结构域它它们介于二、三介于二、三级结构之构之间，是蛋白，是蛋白质发挥生物活性的必需基本生物活性的必需基本结构。构。模体模体(motif)在在许多蛋白多蛋白质分子中，可分子中，可发现二个或三个具有二二个或三个具有二级结构的构的肽段，在空段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空上相互接近，形成一个特殊的空间构象。构象。钙结合蛋白中结钙结合蛋白中结合钙离子的模体合钙离子的模体 锌指结构锌指结构 结构域：构域：蛋白蛋白质三三级结构常可分割成一个构常可分割成一个或数个球状或或数个球状或纤维状的区域，折叠得状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称密，各行使其功能，称为结构域构域(domain)。纤连蛋白分子的结构域纤连蛋白分子的结构域 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构有些蛋白有些蛋白质分子含有分子含有二条或多条二条或多条多多肽链，每一条，每一条多多肽链都有完整的三都有完整的三级结构，称构，称为蛋白蛋白质的的亚基基(subunit)。蛋白蛋白质分子中各分子中各亚基的空基的空间排布及排布及亚基接触部位基接触部位的布局和相互作用，称的布局和相互作用，称为蛋白蛋白质的四的四级结构构。亚基之基之间的的结合力主要是疏水作用，其次是合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子和离子键。血血红蛋白四蛋白四级结构构蛋白质亚基蛋白质亚基组装方式丰组装方式丰富多样富多样蛋白质构象改变导致疾病产生蛋白质构象改变导致疾病产生 蛋蛋白白质构构象象疾疾病病：若若蛋蛋白白质的的折折叠叠发生生错误，尽尽管管其其一一级结构构不不变，但但蛋蛋白白质的的构构象象发生生改改变，仍仍可可影影响响其其功功能能，严重重时可可导致疾病致疾病发生。生。这类疾疾病病包包括括：人人纹状状体体脊脊髓髓变性性病病、老年痴呆症、亨停老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、舞蹈病、疯牛病等。牛病等。蛋白质构象改变导致疯牛病蛋白质构象改变导致疯牛病 疯牛病是由牛病是由朊病毒蛋白病毒蛋白(prion protein,PrP)引起的一引起的一组人和人和动物神物神经退行性病退行性病变。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，称螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白在某种未知蛋白质的作用下可的作用下可转变成全成全为-折叠的折叠的PrPsc，从而致病。，从而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折叠折叠正常正常疯牛病疯牛病正常正常疯牛病疯牛病疯牛病牛病药物物设计主要主要是阻断是阻断PrPsc的的产生生有些蛋白有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常折叠后相互聚集，常形形成抗蛋白水解成抗蛋白水解酶的淀粉的淀粉样纤维沉淀，沉淀，产生生毒性而致病毒性而致病，表，表现为蛋白蛋白质淀粉淀粉样纤维沉沉淀的病理改淀的病理改变。蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质构象改变导致疾病的机理蛋白质的变性蛋白质的变性(denaturation)定定义：在物理和化学因素作用下，蛋白在物理和化学因素作用下，蛋白质空空间构构象被破坏，即象被破坏，即有序的空有序的空间结构构变成成无序的空无序的空间结构构，导致其理化性致其理化性质改改变和生物活性和生物活性丧失。失。本本质：破坏非共价破坏非共价键和二硫和二硫键，不改，不改变蛋白蛋白质的的一一级结构。构。造成造成变性的因素：性的因素：如加如加热、乙醇等有机溶、乙醇等有机溶剂、强酸、酸、强碱、重金属离子及生物碱碱、重金属离子及生物碱试剂等等。应用举例应用举例临床医学上，床医学上，变性因素常被性因素常被应用来消用来消毒及毒及灭菌。菌。此外此外,防止蛋白防止蛋白质变性也是有效保存性也是有效保存蛋白蛋白质制制剂（如疫苗等）的必要条件。（如疫苗等）的必要条件。若蛋白若蛋白质变性程度性程度较轻，去除，去除变性因素后，蛋白性因素后，蛋白质仍可恢复或部分仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称恢复其原有的构象和功能，称为复复性性(renaturation)。蛋白质的复性蛋白质的复性(renaturation)蛋白质样品大量制备蛋白质样品大量制备蛋白质样蛋白质样品制备品制备体外：无细胞表达体系，用于对细胞体外：无细胞表达体系，用于对细胞 有毒性蛋白的表达有毒性蛋白的表达体内：体内：(E.Coli)可溶性表达：可溶性表达：3030 (根据根据CESG组织对组织对80388038个蛋白表达统计个蛋白表达统计)不可溶表达：不可溶表达：70%70%蛋白以沉淀形蛋白以沉淀形式表达；式表达；需进行蛋白质变性与需进行蛋白质变性与复性操作。复性操作。蛋白质蛋白质结构测定结构测定一般一般方法方法X X-射射线晶体学晶体学 (X-Ray)(X-Ray)核磁共振核磁共振 (NMR)(NMR)最终结构X-X-射线晶体学蛋白质结构解析流射线晶体学蛋白质结构解析流程程晶体生长晶体衍射母晶晶体重金属衍生物晶胞参数衍射强度和相位两套以上不同的衍射数据傅里叶合成电子密度图根据结构模型修正相位碳骨架走向氨基酸残基指认结构模型衍射强度修正后的相位如何制备蛋白质晶体？如何制备蛋白质晶体？利用蛋白质工程制备纯的蛋白质样品制备饱和的蛋白质溶液进行蛋白质结晶条件优化liguofu44X X射线晶体学结构原理射线晶体学结构原理This X-ray diffraction pattern of a DNA-cleaving enzyme was imaged at the facility by the Barry Stoddard group from the Fred Hutchinson Cancer Research Center 晶体质量与衍射仪决定数据分辨率晶体质量与衍射仪决定数据分辨率1.0：可分辩单个原子（N比C大）2.5：可分辨环状状结构3.0：不易可分辨环状状结构4.0：很难确定是否环状结构.1resolution6resolution6.0：可分辨 a-helix，不能分辨b sheet 8：只能分辨分子 1.02.53.04.0优点与缺点点与缺点X X射射线晶晶体体是是目目前前最最主主要要的的研研究究生生物物大大分分子子结构构的的手手段段,分分辨辨率率可可以以达达到到原原子子水水平平.但但它它只只能能给出研究出研究对象的一个静象的一个静态结构构.它它没没有有分分子子量量大大小小的的限限制制，但但太太大大的的分分子子复复合合体不易得到体不易得到结晶晶.样品品的的结晶晶是是一一个个瓶瓶颈,尤尤其其是是膜膜蛋蛋白白的的结晶晶很很难得到。得到。同步同步辐射光源射光源应用提高了用提高了X-rayX-ray的衍射的衍射质量量.我国蛋白质晶体结构研究现况我国蛋白质晶体结构研究现况1974：首次首次获得高分辨猪胰得高分辨猪胰岛素的三素的三维结构构2003：SARS相关蛋白相关蛋白结构的系构的系统研究研究2004：菠菜主要捕光复合物晶体菠菜主要捕光复合物晶体结构构2005：线粒体呼吸粒体呼吸链膜蛋白复合物膜蛋白复合物II的晶体的晶体结构构2003：北京高能所建成第一个蛋白北京高能所建成第一个蛋白质晶体学晶体学实验站站2009：上海同步上海同步辐射光源开始建射光源开始建设2010-现在：在：清清华大学大学施一公施一公教授研究教授研究团队等工作等工作但在规模和投入上与发达国家相比仍有较大差距但在规模和投入上与发达国家相比仍有较大差距SARS病毒蛋白病毒蛋白酶三三维结构构2002年冬到年冬到2003年春年春肆虐全球的肆虐全球的严重急性呼重急性呼吸吸综合征合征(SARS)爆爆发。中国科学院院士、前中国科学院院士、前南开大学校南开大学校长饶子和子和先先生解析了生解析了SARS病毒病毒发挥功能的主要蛋白功能的主要蛋白酶结构。构。针对针对SARSSARS病毒的药物设计主要以此为靶标进行病毒的药物设计主要以此为靶标进行上海同步上海同步辐射光源射光源中国最大的大科学装置，在浦中国最大的大科学装置，在浦东张江高科技园区建江高科技园区建成并投入使用，成并投入使用，总投投资约12亿元。元。核磁共振核磁共振(NMR)技技术用于蛋白用于蛋白质结构构测定定1.1.基因克隆基因克隆2.2.表达与纯化表达与纯化3.3.1313C C、1515N N和和/或或2 2H H同位素标记同位素标记4.4.三维及四维三维及四维NMRNMR图图谱采集与信号归属谱采集与信号归属5.5.溶液三维结构确定溶液三维结构确定fortheirdevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromoleculesTheNobelPrizeinChemistry2002“for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules”J.B.FennK.TanakaUSAJapanKurtWthrichETH,Switzerlandfor his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution抗抗HIV-1病毒感染的病毒感染的A3G蛋白蛋白结构构X-rayNMR优点与缺点点与缺点NMRNMR是目前是目前仅次于次于X X射射线晶体学的研究生物大晶体学的研究生物大分子分子结构的手段构的手段,也具有很高的分辨率也具有很高的分辨率.样品品为溶液状溶液状态,接近生理状接近生理状态，且能，且能测定定动态结构，蛋白构，蛋白质不需要不需要结晶晶,这是是优点点.生物大分子生物大分子NMRNMR图谱非常复非常复杂,需要提高外磁需要提高外磁场强度度,解解谱方法从一方法从一维发展到二展到二维和三和三维才能保才能保证分辨率得到提高。分辨率得到提高。NMRNMR受分子大小的限制受分子大小的限制,目前低分辨率下分子目前低分辨率下分子量可达量可达50kDa50kDa左右左右,高分辨率下分子量可达高分辨率下分子量可达30kDa30kDa左右左右.超超强磁磁场谱仪提高提高NMR信号灵敏度信号灵敏度2002：北京磁共振中心：北京磁共振中心(800兆兆)2007：中科院武汉磁共振中心：中科院武汉磁共振中心(800兆兆)2010:中科院合肥强磁场中心中科院合肥强磁场中心(850兆兆)2010:北京首都医大强磁场中心北京首都医大强磁场中心(800兆兆)2011:中科院上海有机所强磁场中心中科院上海有机所强磁场中心(800兆兆)2011:中科院武汉磁共振中心中科院武汉磁共振中心(850 兆兆)2011:上海蛋白质研究中心上海蛋白质研究中心 (900兆、兆、800兆兆)2011：中科院昆明植物所：中科院昆明植物所(800兆兆)2011:厦门大学厦门大学(850兆兆)2012：北京蛋白质研究中心：北京蛋白质研究中心(900兆、兆、800兆兆)大型科研设备的订购与国家大型科研设备的订购与国家的经济实力密切相关的经济实力密切相关.30KDa30KDa分子量以上的蛋白结分子量以上的蛋白结构解析需要构解析需要800800兆以上谱仪，兆以上谱仪，目前售价目前售价15001500万人民币。万人民币。真诚祝福同学们真诚祝福同学们身心健康，心想事成！身心健康，心想事成！谢谢大家！谢谢大家！