DB65∕T 4590-2022 重大动物疫病监测样品采集、送检技术规范(新疆维吾尔自治区).pdf

ICS 65.020.30CCS B41OH(5新疆维吾尔自治区地方标准DB 65/T 45902022重大动物疫病监测样品采集国送检技术规范Technical specifications for sample collection and inspection in surveillance of major animal epidemics2022-10-10 发布2022-12-09 实施新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发 布DB 65/T 45902022刖本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心提出。本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。本文件起草单位：新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心。本文件主要起草人：任娟、刘亚涛、惠志华、王文、李舵、薛文、秦菊、李彦芳、符玉涓、李琴、杨倩、孙倩、陆桂丽、邓强、苏晓慧、努尔麦麦提阿穆提、居马别克夏拉巴依、乌那尔汗吉斯汗、马晓艳、陈卫东、美热木古丽巴依待拉提、沙娜瓦尔塔希、阿依江0卡那提拜克、玛依拉艾尼瓦、丁剑。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心。对本文件的修改意见和建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市天山区新华南路 408号）、新疆维吾尔彦治区动物疾病预防控制中心（新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268 号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（新疆乌鲁木齐市天山区新华南路167号）。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局 联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830004新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心联系电话：[phone]；传真:[phone]；邮 编：830011新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：[phone]；传真：[phone]；邮编：830004IDB 65/T 45902022重大动物疫病监测样品采集,送检技术规范1 M本文件规定了重大动物疫病监测样品的采样原则、采样前准备和样品采集、送检、保存与包装。本文件适用于各级动物疫病预防控制机构及相关单位重大动物疫病监测样品采集工作。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。G3/T 18935 口蹄疫诊断技术NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 561动物炭疸诊断技术一、二、三类动物疫病病种名录农业部公告第1125号中华人民共和国动物防疫法中华人民共和国主席令第六十九号病原微生物实验室生物安全管理条例国务院令第424号，2018修订版兽医实验室生物安全技术管理规范农业部公告第302号高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范 农业部公告第503号3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1监测 surveillance长期地、连续地收集、核对、分析疾病的动态分布和影响因素的资料,并将信息及时上报和反馈,以便及时枭取干预措施C3.2采集 collection通过一定的方法，按照特定的程序和要求，对样品进行收集、处理及整理的过程。3.3溶血 hemolysis由于红细胞被破坏，胞内血红蛋白等物质进入血清。3.4样品sample取自动物或环境，拟通过检测反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。3.5动物疫疯 aninsal epidemic 勖物传染病、寄生虫病。1DB 65/T 459020223.6人畜共患病zoonosis由同一种病原体引起,流行病学上相互关联,在人类和动物之间自然传播的疫病。3.7重大动物疫情 major animal pandemic高致病性禽流感等发病率或者死亡率高的动物疫病突然发生，迅速传播，给养殖业生产安全造成严 重威胁、危害，以及可能对公众身体健康与生命安全造成危害的情形，包括特别重大动物疫情。3.8重大动物疫病范畴 categories of major animal diseases一、二、三类动物疫病病种名录规定的非洲猪瘟、高致病性禽流感、口蹄疫、小反刍兽疫、非 洲马瘟等一类动物疫病布鲁氏菌病、棘球蝇病、狂犬病、炭疽、牛结核病、马传染性贫血、牛结节性 皮肤病等二类动物疫病；我国尚未发现的及我国已消灭的动物疫病。3.90-P 液 oesophageal-pharyngeal fluids食道-咽部分泌物4采样原则4.1先排除炭疽后采样凡发现动物患病后表现为体温迅速升高、全身肌肉痉挛、天然孔流出黑红色的煤焦油状血液、凝血 不全、可视粘膜发维或者表面有针尖状出血点、突然死亡、尸僵不全症状，怀疑患有炭疽时，不应解剖。需解剖采样，应按照NY/T 561的规定，采集血液标本，进行细菌学检查，确定不是炭疽后方可解剖采样。4.2适时采样根据动物的实际情况和实验目的，选择适当的采样时机。对疫苗免疫动物进行抗体监测，免疫后2 周3周采血。采集死亡动物的病料，应在动物死亡后2 h内采集，无法完成时，夏天不超过6 h,冬天不 超过24 ho监测病原或需要分离病原时，应在发热期或症状明显期采样。4.3科学采样结合当地的地理条件和养殖情况，根据动物的饲养密度、年龄、品种、交通条件等因素，选择具有 代表性的采样地点，合理布局。4.4典型采样选取未经药物治疗、症状明显的动物，在病变明显的部位采样，采样部位不应用消毒剂处理。4.5无菌采样无菌采样前，采样工具、容器需进行无菌处理，防止外源性污染和样品交X污染。尸体剖检前需采 集样品的，应先采样后剖检，避免人为污染样品。4.6足量采样4.6.1样品数量2DB 65/T 45902022采集足够数量的样品，根据监测的疫病种类侧重采样，在不能确定是何种疫病的情况下，应全面采 样。4 6.2瞽酚品每份样品的体积应满足所有检测项目的需要，并有剩余样品。疑似阳性动物的样本应平行采集2份,i份送检，一份留样备检。4.7 臧少应激和伤害活体动物采样时，应考虑动物福利，避免过度刺激或伤害动物。4.8 生物安全防护采样人员加强个人防护，使用合格的医用防护用品（防护服、口罩、帽子、手套、鞋套等），避免 感染人畜共患病。做好环境消毒和病死动物、病料和污染物的无害化处理，避免污染环境，防止传播疫 病。繇樨前瀚酱5.1 枭样人贸5.1.1 采样人员经生物安全知识培训，熟悉样品采集方法，熟练掌握样品采集操作技术。5.1.2 采样人员做好生物安全防护，需佩戴防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴 套，防止感染人畜共患病和污染环境，造成动物疫病扩散。5.2 蠡具和容器5.2.1保温箱、探杯、开口器、采样枪、解剖刀、剪刀、镶子、酒精灯、酒精棉、棉签、注射器及针 头。5.2.2样品容器：离心管、封口袋、带螺帽的塑料离心管，盛放同批样品的容器类型、大小须统一。5.2.3试管架、铝饭盒、无菌聚丙烯纤维头塑料杆拭子或棉拭子、封口膜、封条、冰袋。5.2.4采样刀剪等器具和样品容器应洁净、干燥，并提前消毒。刀、翦、镜子应经103 kPa高压蒸汽 灭菌或者煮沸消毒30 min,使用前用酒精擦拭或者进行火焰灭菌处理。器皿（玻制、陶制等）应经103 kPa高压蒸汽灭菌或者160 C干烤2 h灭菌。5.2.5器具和容器使用后先消毒后清洗。5.3保存液根据监测目的和样品的种类准备保存试剂，并提前分装好。0.01 mol/L或0.（）4 mol/L磷酸盐缓冲 液（PBS,ph7.4）、30或50%甘油磷酸盐保存液（用于病毒检测时，应加入双抗）、。-P液保存液配置 方法见附录A。6祥品采鬣 6,1梯晶釉类DB 65/T 45902022根据监测目的和实验要求，确定样品的种类、采样部位，使样品具有代表性。样品采集方法应符合NY/T 541的规定。主要重大动物疫病监测采样部位见表1。表1主要重大动物疫病监测样品种类疫病名称样品种类高致病性禽流感/新城疫咽喉/泄殖腔拭子、气管分泌物、肺、新鲜粪便、血清等U蹄疫0/P液、水泡皮、水泡液、扁桃体、淋巴结、血清等高致病性猪蓝耳病扁桃体、淋巴结、血清等小反刍兽疫鼻腔/眼结膜拭子、淋巴结、脾脏、肺脏、肠粘膜、血清等非洲猪瘟/猪瘟抗凝血、脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓、蟀、血清等牛结节性皮肤病皮肤结痂、抗凝血、唾液、鼻拭子、血清等包虫病肝肺包囊、新鲜犬粪、血清等布鲁氏菌病组织样品、阴道冲洗液、精液、关节液、胃内容物、乳样血清等狂犬病脑组织、血清卷6.1.1全血样品采集6.1.1.1采血部位选择6.1.1.1.1 大型哺乳动物大型哺乳动物可通过颈静脉或尾静脉采血。6.1.1.1.2 猪猪可通过前腔静脉或耳静脉采血。6.1.1.1.3 禽类可通过翅静脉或心脏采血。6.1.1.1.4 兔可通过耳静脉、颈静脉或心脏采血。6.1.1.1.5其它动物少量采血可穿刺耳尖或者耳外侧静脉，也可划破脚垫剪短，多量采血可通过隐静脉采集。6.1.1.2皮肤消毒对采血部位的皮肤先剃毛，用1%2%碘酊消毒后，再用75%酒精棉球由内向外螺旋式擦拭，干燥后 方可采血。6.1.1.3血样处理6.1.1.3.1全血样品使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液样品3 mL4 mLo4DB 65/T 459020226.1.1.3.2淋巴细胞分离和培养外周血中淋巴细胞的样本，使用含有肝素抗凝剂的真空采血管采集血液。6.1.1.3.3 血浆分离血浆，将全血1500 rpm-2000 rpm离心10 min,收集血浆于离心管中。6.1.2 血清样品采集用一次性采血器或储血器采集血液样本3 mL4 mL（采血器体积的2/3）,不应暴晒，室温下倾斜 30。静置2 h4 h,待血液凝固有血清析出时，置4 冰箱过夜；或将盛放血液的容器放在恒温箱（37）中静置4 h6 h,待大部分血清析出后，无菌操作取出血清，必要口寸1000 rpm3000 rpm离心10 min,分 离出血清于离心管中。应避免采集过于肥胖的动物的血液用于分离血清。血清应无溶血、腐败现象，每 份样品的体积不少于LE mL。6.1.3 分泌物样品采集6.1.3.1眼结膜分泌物在眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液（也可使用等 渗盐溶液、组织培养液】的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。6.1.3,2鼻腔分泌物使用聚丙烯纤维头的塑料杆（或棉签）拭子，贴鼻孔进入，轻轻擦拭并缓慢旋转2圈或3圈，沾取鼻 腔分泌物，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液（也可使用等渗盐溶液、组织培养液）的 离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。6.1.3,3咽喉分泌物使用聚丙烯纤维头的塑料杆（或棉签）拭子，插入家禽口腔至咽的后部，轻轻擦拭并缓慢旋转2圈 或3圈，沾取咽喉分泌物后取出，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液（也可使用等渗盐 溶液、组织培养液）的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。6.1.3.4气管分泌物使用聚丙烯纤维头的塑料杆（或棉签）拭子，插入家禽口腔至咽的后部直达喉气管处，轻轻擦拭并 缓慢旋转2圈或3圈，沾取气管分泌物后取出，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液（也可 使用等渗盐溶液、组织培养液）的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。6.1.3.5 0-P 液反刍动物O-P液样品采集按照GB/T 18935第5章中5.3.4的规定操作。6.1.3.6水泡皮、水泡液样品采集采集发病动物（牛、羊或猪）未破裂的水泡皮和水泡液，样品采集部位可用清水清洗（不应使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭）。用灭菌注射器吸出水泡液置于灭菌容器（可加双抗）中送检。剪 取新鲜水泡皮3 g5 g放入灭菌容器中，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液中送检。5DB 65/T 459020226.1.4排泄物样品采集采集新鲜的粪便N10 g,保存于带螺帽的容器或灭菌塑料袋中送检，采集肠道内容物样品，可将病 变最明显的胃肠部分两端结扎，从两端剪断，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液中送检。6.1.5组织样品采集6.1.5.1 组织块组织样品应保持新鲜，避免接触消毒剂，抗菌、抗病毒等药物。组织块质量210 g,置于灭菌的3096 或50%甘油磷酸盐保存液中送检。6.1,5.2活体扁桃体活体采集猪扁桃体时,采样人员固定猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用 灭菌牙签挑至灭菌离心管中保存。采样器使用前用2%氢氧化钠消毒后清水冲洗。6.1.5.3同一动物的组织样品同一动物的不同组织样品应分别单独置于无菌容器中，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液中送 检。6.1.6环境样品采集6.1.6.1物体表面样品采集物体表面样品时，拭子充分浸润灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液后在表面重复涂抹，将拭 子放回采样管浸润，取出后再次涂抹采样,重复3次以上。6.1.6.2污水样品采集血槽、泄水等污水样品时，用拭子直接浸入吸附污水,应多点分布式采样。6.1.6.3同一动物的环境样品同一动物的环境样品可置于同一容器中，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液中送检。6.2样品编号样品采集后按照“动物畜别一样品类型一样品序号”方式进行编号。动物蓄:别和样品类型可分别用 汉语拼音的第一个字母大写表示，如有重复，可用第二个字母大写表示，如猪7、牛N、羊Y、鸡J、鸭A,血清X、扁桃体B、淋巴结L、拭子S、环境样品H。样品序号用数字依次连续编号。6.3采样记录6.3.1采样人员做好样品信息记录，填写采样登记表，确保样品及相关信息可追溯。6.3.2采样登记表应准确记录采样时间、地点，畜主姓名、联系方式，样品种类、数量、编号，采样 动物信息（畜种、品种、年龄、性别及标示号）及免疫状况（免疫时间、疫苗和类、疫苗生产厂家及批 号等）。6.3.3疑似感染动物采样时，记录同群动物数量、饲养管理情况、发病过程、临床症状、用药情况。6.3.4采样登记表用钢笔或签字笔填写，采样人和被采样单位签章，一式三份，采样单位一份、被采6DB 65/T 45902022样单位-份、随样一份c7送检7.1样品送检应符合病原微生物实验室生物安全管理条例第2章的规定。7.2 采取有效措施确保样品安全、完整、无泄漏，严防发生被盗、丢失等事件。7.3 样品由专人管理，运送人员和接收人员对样品进行双签收，核对样品来源、种类、数量、保存方 法、送检单位和送检人的联系方式、送检日期等信息。接收人员在现场对样品进行编号、登记。7.4 疑似阳性样品送至省级动物疫病预防控制机构进行检测，同时附采样登记表及相关情况说明。8样品保存与包装8.1样品保存样品采集后应尽快送往实验室，24 h内能检测的样品可置于4汽冷藏保存；24 h内无法检测的样品 置于-20 冷冻保存（细菌类检测样品除外）。设立专柜单独保存样品。如需长途运输，样品应在冷藏 和密封状态下运输，于保温箱中加冰袋保存。样品运输期间应避免反复冻融。8.2样品包装8.2.1样品处理的生物安全措施应符合兽医实验室生物安全技术管理规范第6章的规定。8.2.2样品盛放在密封、无菌、耐冷冻的容器里，容器外注明样品种类、编号及采样日期。血清、拭 子放在离心管里，食道-咽部分泌物（0-P液）放在带螺旋盖的样品采集管里，组织、粪便样品放在大 小适合的带螺旋盖的样品采集管或密封袋，每管/袋限一份样品。8.2.3将密闭后的样品装入密封袋，同一采样地点的同类型样品可装入同一个密封袋，不同类型样品 分别包装，避免样品间交叉污染。密封袋外贴封条和标签，注明采样地点、样品种类、编号、数量及采 样日期等信息，封条上有采样人签章和贴封日期。8.2.4样品运输包装应符合高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范的规定，使用密封三层包装，外包装上贴生物危险标识。8.2.5将采样登记表放入一个独立的密封、防水的包装袋内，随样品一起送达实验室。7DB 65/T 45902022附录A(规范性)相关试剂的配制A.1 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)称取 NaCl 8 0.0 g、KC1 2.0 g、Na2HP04 s 12H20 30.0 g、KH2P04 2.0 g,加入少量蒸储水，待溶解 后加蒸储水定容至1000疝，4 冰箱保存。A.2 0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液(ph7.4)量取0.i mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)100 m3加入900矶蒸储水，混匀，103 kPa高压蒸汽灭菌 30 min,4。冰箱保存。A.3 0.04 mol/L 磷酸盐缓冲液(ph7.4)量取0.01 mol/L磷酸盐缓冲液400 mL,加入600 mL蒸储水，混匀，103 kPa高压蒸汽灭菌30 min,4 冰箱保存。A.4 50%甘油-磷酸盐保存液0.04mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)与纯甘油等量混合,分装成小瓶。103kPa高压蒸汽灭菌30min,冰箱保存。A.6 EagleJ s-MEM 营养液10XEagle s-MEM营养液：Eagle s-MEM营养剂9.5 g,加超纯水100.0 mL0溶解后过滤除菌。用无 菌超纯水将lOXEagle s-MEM营养液按1:10稀释，即100 mL营养液加入900 mL无菌超纯水中即为使用浓 度营养液，4 9保存备用。A.6 0.5%水解乳白蛋白称取/量取NaCl 6.8 g、KC1 0.4 g、CaCl2 0.2 g、Na&P。比0 0.14 g、MgS04 0 7 H20 0.2 g、撕萄糖1.0 g、10%酚红2.0 mL、水解乳白蛋白5.0 g,加超纯水逐个溶解,最后加超纯水至1000 mL,过滤除菌，4 2保存备用。A.7食道-咽部分泌物(0-P液)保存液(ph7.4-7.6)分别量取Eagle s-MEM营养液5Q mL和0.5%水解乳白蛋白50 mL,混合后混匀，5%碳酸氢钠调整ph 值至7.67.8,4。保存备用。8