基于CRISPR_Cas1...LK融合基因检测方法的建立_邹赛.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):19Feb.,2023 收稿日期:2022-02-11 基金资助:全军卫勤保障能力创新与生成专项(20WQ029);全军保健专项科研课题(18BJZ14);广东省医学科学技术研究基金项目(A2021273)作者简介:邹赛(1997-),女,湖南省岳阳人,学士,检验师,研究方向:肿瘤分子标志物快速诊断,E-mail:784753475 。通讯作者:李林海(1972-),男,云南省大理人,博士,教授,博导,研究方向:肿瘤分子标志物及细胞信号转导学,发表论文 100 余篇,E-mail:。技术与方法TECHNIQUE AND METHOD基于 CRISPR/Cas13a 的 EML4-ALK 融合基因检测方法的建立邹赛1,2,肖斌3,邝振展4,孙朝晖1,黄秀娜1,李林海3(1.中国人民解放军南部战区总医院 检验科,广东 广州 510010;2.珠海市妇幼保健院 检验科,广东 珠海 519000;3.广州医科大学附属第六医院,清远市人民医院 检验医学部,广东 清远 511518;4.深圳大学附属华南医院 检验科,广东 深圳 518000)摘要:目的构建基于 CRISPR/Cas13a 蛋白的 SHERLOCK 技术平台,并将其应用于肺癌 EML4-ALK 融合基因的检测。方法构建 EML4-ALK 融合基因的质粒标准品;利用 RPA 和 PCR 技术分别扩增目的基因后进行 SHERLOCK 检测并比对结果,比较基于 RPA 和 PCR 扩增的 SHERLOCK 检测 EML4-ALK 融合基因的灵敏度,评估 SHERLOCK 检测目的基因及多种非目标基因的特异性。结果成功构建 EML4-ALK 融合基因表达质粒标准品;基于 RPA 和 PCR 扩增的 SHERLOCK 检测 EML4-ALK 融合基因的相对荧光值无显著差异,最低检测下限为10 copies/L,且在5 min 内荧光达到平台期;SHERLOCK 技术仅对 EML4-ALK 融合基因有阳性检测信号,对 EML4、ALK、EGFR T790M 和 EGFRL858R 基因无阳性检测信号。结论基于 SHERLOCK 技术的 EML4-ALK 融合基因检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优势,有望为肺癌 EML4-ALK 融合基因的早期诊断提供重要依据。关键词:Cas13a 蛋白;SHERLOCK 技术;EML4-ALK;基因检测中图分类号:R446.7 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0004Establishment of a novel method in detecting EML4-ALKfusion gene based on CRISPR/Cas13aZOU Sai1,2,XIAO Bin3,KUANG Zhen-zhan4,SUN Zhao-hui1,HUANG Xiu-na1,LI Lin-hai3(1.Department of Clinical Laboratory,General Hospital of the Southern Theater of the Chinese Peoples LiberationArmy,Guangzhou 510010,China;2.Department of Clinical Laboratory,Clinical Laboratory of Zhuhai Maternaland Child Health Hospital,Zhuhai 519000,China;3.Department of Laboratory Medicine,the Sixth AffiliatedHospital of Guangzhou Medical University,Qingyuan Peoples Hospital,Qingyuan 511518,China;4.Department of Clinical Laboratory,South China Hospital Affiliated to Shenzhen University,Shenzhen 518000,China)Abstract:Objective The SHERLOCK technology platform based on CRISPR/Cas13a protein was constructed and appliedto the detection of EML4-ALK fusion gene in lung cancer.MethodConstructing plasmid standard of EML4-ALK fusiongene.After the target genes were amplified by RPA and PCR techniques,SHERLOCK detection was performed to compare thesensitivity of SHERLOCK based on RPA and PCR amplification and to evaluate the specificity of SHERLOCK detection of tar-get genes and various non-target genes.ResultThe standard EML4-ALK fusion gene expression plasmid was successfullyconstructed.SHERLOCK based on RPA and PCR amplification showed no significant difference in the relative fluorescence val-ue of EML4-ALK fusion gene,with a minimum detection limit of 10 copies/L and a plateau in fluorescence within 5 min.SHERLOCK technique only had positive detection signal for EML4-ALK fusion genes,but had no positive detection signal forEML4-ALK,EGFR T790M and EGFR L858R genes.Conclusion The EML4-ALK fusion gene detection method based onSHERLOCK technology has the advantages of strong specificity,high sensitivity and short detection time,and is expected to pro-vide an important basis for the early diagnosis of EML4-ALK fusion gene in lung cancer in lung cancer.Keywords:Cas13a protein;SHERLOCK technology;EML4-ALK;genetic testing EML4-ALK(The echinoderm microtubuleassoci-ated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase)融生 物 技 术2023 年合基因是首个被发现的高特异性肺腺癌驱动基因1,该基因可促使细胞获得恶性转化和致瘤能力2。EML4-ALK 融合基因在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的发生率为6.8%(472/6950)3,但由于 NSCLC 的发病率逐年增加,EML4-ALK 阳性患者数量依然不可忽视。目前,针对 EML4-ALK 融合基因的靶向药克唑替尼在 EML4-ALK 阳性 NSCLC 患者中的临床受益率超过 80%,6 个月的无进展生存率(Progress Free Survival,PFS)为 72%4;因此,建立快速有效的 EML4-ALK 融合基因检测方法,对肺癌的早期诊断以及指导用药具有重要意义。目前,针对 EML4-ALK 融合基因的检测方法包括实时 qPCR 技术、第二代 DNA 测序技术(Next-generation sequencing,NGS)、扩增阻碍突 变 系 统(amplification refractory mutation system,ARMS)和荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等5。其中,qPCR 技术是 EML4-ALK 融合基因最常见的临床检测技术,具有敏感、特异、半定量等优点,也存在着易污染、检测时间长等不足6;其他方法成本较高,通常需要较长的检测时间6-7。因此,临床急需一种快速准确检测 EML4-ALK 融合基因的方法。特异性高灵敏度酶报告系统(Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking,SHERLOCK)技术利用重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymer-ase amplification,RPA)技术在恒温条件下快速扩增核酸,结合成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated gene,CRISPR/Cas)系统中 Cas13a 蛋白的生物特性,在 crRNA(CRISPR-de-rived RNA)的引导下特异性切割靶 RNA,同时切割荧光报告分子发出荧光8。该技术可以快速、低成本、高灵敏度地检测临床样本中的 DNA 或 RNA。目前,SHERLOCK 技术已成功应用于新型呼吸道病毒SARS-CoV-2、寨卡病毒和登革热病毒等病原微生物的快速检测9-11。此外,SHERLOCK 在表皮生长因子受体 L858R、鼠类肉瘤病毒癌基因同源物 B1V600E 等肿瘤突变基因检测中也发挥重要作用12。然而,SHERLOCK 技术在肿瘤融合基因检测中的应用尚未见报道。本研究拟联合利用 Cas13a 的生物学特性和RPA 的技术优势,建立一种基于 SHERLOCK 技术的快速准确高效检测 EML4-ALK 融合基因的方法,为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料EML4 基因质粒、ALK 基因质粒、EGFR T790M基因质粒、EGFR L858R 质粒由笔者课题组先前构建并保存于-80 冰箱,测序和 Blast 结果如图 1所示。图 1 各质粒的测序和 Blast 结果注:A:L858R;B:EML4;C:ALK;D:T790M。Fig.1 Sequencing and blast results of all plasmidsNote:A:L858R;B:EML4;C:ALK;D:T790M.02 1 期邹赛,等:基于 CRISPR/Cas13a 的 EML4-ALK 融合基因检测方法的建立1.1.2 试剂Cas13a 蛋白、RNA 荧光探针、crRNA 购自于中国广州博徕斯生物公司。引物购自于中国广州四和生物。qPCR 试剂(RR420A)、高保真聚合酶(R045A),T4 连接酶(6024)、Xho(1635)、Kpn(1618)限制酶来自于日本 Takara 生物。TwistAmp Basic RPA 试剂盒(TABAS03KIT-96t)来自于英国 FAPAS 公司。本文所用的引物、crRNA 及探针具体序列见表 1。表 1 引物、crRNA 及探针序列Tab.1 Primer,crRNA and probe sequence名称 Name序列 SequenceEML4-FACACCCGGGGTACCCTTGCCCTATCGTTAATTGTAAGTAGCAG(下划线为 KPN限制酶位点)EML4-RCCGGCGGTACACTTTAGGTCCTTTCCCAGGTGTGGG(下划线为 ALK 基因序列)ALK-FAGGACCTAAAGTGTACCGCCGGAAGCACCAGGAGCT(下划线为 EML4 基因序列)ALK-RACCCACCGCTCGAGTGGGGAGAGACAGATCACTGTGGGT(下划线为 XHO限制酶位点)EML4-ALK-FATATTTAATACGACTCACTATAGGGGAGTCATGCTTATATGGAGCAAAACTEML4-ALK-RTCAGCTTGTACTCAGGGCTCTGcrRNAGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACGGUGCUUCCGGCGGUACACUUUAGGUCCUU(双下划线的为ALK 基因序列,下划线为 EML4 基因序列)Probe5-FAM-UUUUUU-3-BHQ21.1.3 仪器CFX96 Real-Time System 来自于美国 Bio-Rad 公司、GeneAmp PCR System 9700 来自于中国北京科志达信息技术有限公司。1.2 方法1.2.1EML4-ALK 融合基因标准品构建流程及SHERLOCK 检测原理 以 pENTER-EML4 基因质粒和 pENTER-ALK基因质粒作为模板,使用两对引物(EML4-F&EML4-R,ALK-F&ALK-R)分别扩增 EML4 和 ALK 基因序列,并利用 ALK-F 及 EML4-R 使 ALK 基因的 5端和 EML4 基因的 3端互补,随后使用 EML4-F&ALK-R 引物扩增 ALK 和 EML4 基因片段混合物,从而得到 EML4-ALK 融合基因片段,最后与空质粒 pENTER 连接得到重组载体(图 2A)。SHER-LOCK 技术依赖于 Cas13a 蛋白的“连带剪切”特性,当 Cas13a 蛋白与 crRNA 结合并识别靶 RNA 时,Cas13a 蛋白会连带剪切周围任何的 RNA 分子,此时,通过检测 RNA 探针的荧光便可检测靶 RNA 是否存在(图 2B)。其中,crRNA 由恒定的重复序列区和与靶 RNA 互补的间隔序列区组成,本文设计的crRNA 间隔序列区由 12 bp 的 EML4 序列和 18 bp的 ALK 序列组成。1.2.2建立 EML4-ALK 融合基因的 SHERLOCK检测系统 RPA 扩增体系共50 L:2.4 L 引物F(10 mol/L),2.4 L 引物 R(10 mol/L),29.5 L 的 Buffer A,2 L的 DNA 模板,2.5 L 的 MgCl2(280 mmol/L),11.2 L 无 RNA 酶水,39 反应 30 min。SHERLOCK 检测反应体系共 20 L:2 L 的核糖核苷酸(10 mol/L),0.2 L 的 T7 转录酶(50 U/mL),2.0 L 的 T7 Buffer(10 ),2.0 L DNA 扩增产物,7.6 L 无 RNA 酶水,0.2 L RNA 酶抑制剂(50 U/L,1.0 L Cas13a(10 mol/L),4.0 LcrRNA(1 mol/L),1.0 L RNA 荧光探针(500nmol/L)。瞬时离心混匀,立即放入 CFX96 Real-Time System 中进行测定,每 5 min 测定一次荧光强度。同时进行 RPA 和 PCR 扩增,PCR 扩增体系共50 L:2 L 引物 F(10 mol/L),2 L 引物 R(10 mol/L),25 L Prime Start 反应液,2.0 LDNA 模板,19 L 无 RNA 酶水。PCR 扩增程序如下:98、5 min,98、10 s,58、15 s,72、30 s,40 个循环,72、8 min。1.2.3 SHERLOCK 检测体系特异性验证使用 EML4-ALK-F&EML4-ALK-R 引物分别对 EML4-ALK 融合基因质粒、EML4 基因质粒,ALK 基因质粒,EGFR T790M 基因质粒,EGFR L858R质粒进行 RPA 扩增,然后分别使用 SHERLOCK 技术对上述扩增产物进行检测,具体方法参照步骤1.2.2。12生 物 技 术2023 年图 2 EML4-ALK 质粒标准品构建流程及 SHERLOCK 检测原理注:A:EML4-ALK 质粒标准品构建流程示意图;B:SHERLOCK 技术检测原理示意图。Fig.2 Construction process of EML4-ALK plasmid standard and SHERLOCK detection principleNote:A:Schematic diagram of construction process of EML4-ALK plasmid standard;B:Schematic diagram of SHERLOCK technology detection princi-ple.1.2.4 灵敏度验证及方法学比对用无 RNA 酶水对 EML4-ALK 融合基因标准品进行梯度稀释,同时对稀释后浓度为 1、10、100、1 000、10 000、100 000、1 000 000(copies/L)的标准品及空白质粒进行 RPA 扩增及 SHERLOCK 检测,具体方法参照步骤 1.2.2。同时对不同浓度的EML4-ALK 融合基因标准品及空白质粒进行荧光定量 PCR 检测。1.3 统计学分析对检测结果进行 Shapiro-Wilktest 正态性检验和 Levene 方差齐性检验,如果数据满足正态分布且方差齐性,使用 ANOVA 方差分析统计学方法,组内两两比较使用 SNK-q 检验;如果数据不满足正态分布或者方差齐性,则使用 Kruskal-Wallis H 秩和检验,组内两两比较使用 Steel-Dwass 检验。2 结果与分析2.1 EML4-ALK 标准品构建结果以 EML4 基因质粒和 ALK 基因质粒为模板,扩增出 EML4 与 ALK 基因片段(图 3A),两片段融合形成 EML4-ALK 基因,扩增片段大小约 1 600 bp(图3B)。菌液 PCR 结果显示成功扩增出 EML4-ALK融合基因(图 3C)。对经过菌液 PCR 鉴定的 1 号阳性菌株进行测序,测序结果证实,阳性菌株含有EML4-ALK 融合基因(图 3D)。2.2 SHERLOCK 检测肺癌 EML4-ALK 融合突变基因 RPA 和 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示两种方法均成功扩增出目的条带(图 4A),且PCR 法扩增产物的条带亮度明显高于 RPA 法。RPA 法与 PCR 法扩增产物 SHERLOCK 检测的相对荧光值(Relative Fluorescent unit,RFU)均高于对照组(P 0.001),而两个实验组的 RFU 比较无统计学差异(图 4B),且检测结果均在 5 min 内达到平台期(图 4C)。2.3 EML4-ALK 融合基因的特异性检测琼脂糖凝胶电泳结果显示 EML4-ALK 融合基因的检出率为 100%,EML4 单基因、ALK 单基因、22 1 期邹赛,等:基于 CRISPR/Cas13a 的 EML4-ALK 融合基因检测方法的建立EGFR T790M、EGFR L858R 基因以及空质粒载体的检出率为 0%(图 5A)。SHERLOCK 检测结果显示,EML4-ALK 融合基因的 RFU 显著高于同意对照组、无意对照组以及空白对照组,差异具有统计学意义。图 3 EML4-ALK 质粒标准品构建注:A:EML4 和 ALK 基因扩增结果;B:EML4-ALK 融合基因扩增结果;C:菌液重组质粒扩增结果;D:重组质粒测序结果。Fig.3 Construction of EML4-ALK plasmid standardNote:A:The amplification results of EML4 and ALK gene;B:The amplification results of EML4-ALK fusion gene;C:The amplification results of con-structed plasmid in bateria;D:The sequencing result of constructed plasmid.2.4 SHERLOCK 与 qPCR 技术检测 EML4-ALK 融合基因的灵敏度 利用梯度稀释的 EML4-ALK 融合基因质粒标准品验证 SHERLOCK 法的灵敏度(图 6)。SHER-LOCK 法最低可检测出浓度为 10 copies/L 的标准品,且随着浓度增大,RFU 值也随之增大直至平台期(图 6A)。qPCR 法的最低检测下限为 10 copies/L,且随着浓度增大,荧光曲线越早爬升,直至平台期(图 6B)。3 讨论肺癌侵袭性高13,缺乏有效的早期发现手段,多数肺癌患者确诊时已是中晚期14,常使用化疗等治疗方式,但治疗效果不佳15。分子靶向治疗是个体化精准医疗的基础和重要实现途径,具有毒副作用小、临床获益高等优点16。2007 年,日本学者MANABU SODA 等发现了导致肺癌恶性转化的驱动基因 EML4-ALK 融合基因17。随后出现的针对EML4-ALK 融合基因突变的靶向抑制剂克唑替尼,能够有效减弱 ALK 激酶活性并阻断下游信号通路促进癌细胞凋亡。克唑替尼靶向治疗 EML4-ALK 阳性患者可明显降低 EML4-ALK 阳性表达率,提高患者生存率18,取得了较好的临床获益19。32生 物 技 术2023 年图 4 SHERLOCK 检测 EML4-ALK 融合突变基因注:A:RPA 法和 PCR 法分别扩增产物的电泳图;B:RPA 法和PCR 法扩增产物的 SHERLOCK 检测结果(“”表示与对照组具有显著差异,P 0.001);C SHERLOCK 检测结果曲线。Fig.4 Detection of EML4-ALK fusion mutation by SHERLOCKNote:A:Electrophoresis of amplified products by RPA and PCR;B:The SHERLOCK detection results of amplified products by RPA andPCR(“”indicates that there is a significant difference withthe control group,P 0.001);C:The curve of SHERLOCK detectionresults.临床上有多种 EML4-ALK 融合基因的分子诊断方法,包括 qPCR、高通量测序、数字 PCR 等,但由图 5 SHERLOCK 技术对 EML4-ALK 融合基因检测的特异性分析注:A:多个质粒标准品 RPA 扩增产物的电泳图;B:多个质粒扩增产物的 SHERLOCK 检测结果(“”表示与空白对照具有显著差异,P 0.001)。Fig.5 The specificity valiadation of EML4-ALKfusion gene detection by SHERLOCKNote:A:Electrophoresis of RPA amplification products from multipleplasmid standards;B:SHERLOCK detection results of multiple plas-mid amplification products(“”indicates that there is a signifi-cant difference from the blank control,P 0.001).于其局限性,难以快速、低成本、高灵敏度且高特异性的对 EML4-ALK 融合基因进行检测,因此临床急需一种能够快速高效地检测 EML4-ALK 融合基因的新 检 测 方 法。基 于 CRISPR/Cas13a 的 SHER-LOCK 技术具有高特异性、高灵敏度、快速、低成本和多重功能的优点,在 RNA 和 DNA 定量以及病毒检测方面具有巨大潜力。譬如,对于 SARS-CoV-2 病毒,Parinaz Fozouni 等人使用 CRISPR-Cas13a蛋白直接检测出 SARS-CoV-2 的 RNA,结果显示30 min 内可检测 100 copies/L 的 RNA9。本研究42 1 期邹赛,等:基于 CRISPR/Cas13a 的 EML4-ALK 融合基因检测方法的建立的最低检出限达到了 10 copies/L,灵敏度更佳。也有报道 SHERLOCK 技术在传染性疾病核酸检测方面的成功应用,包括寨卡病毒和登革热病毒的检测20。图 6 SHERLOCK 技术与 qPCR 技术的对比结果注:A:SHERLOCK 检测不同浓度的 EML4-ALK 融合基因质粒标准品(“”表示与对照组相比具有显著差异,P 0.001);B:qPCR 检测不同浓度的 EML4-ALK 融合基因质粒标准品。Fig.6 Comparison results of SHERLOCK technology and qPCR technologyNote:A:SHERLOCK detection of different concentrations of EML4-ALK fusion gene plasmid standard(“”indicates that there is a significantdifference from the control group,P 0.001);B qPCR detection of different concentrations of EML4-ALK fusion gene plasmid standard.2018 年,通过将 Cas13 与辅助 CRISPR 相关酶Csm6 结合来提高信号敏感性,张峰等人检测到NSCLC 患者中的 EGFR L858R 突变和外显子 19 缺失21。这提示 SHERLOCK 技术或许可对肿瘤循环DNA 进行检测。目前有研究利用 SHERLOCK 技术平台,成功检测出循环体液中的 EGFR L858R 和BRAF V600E 突 变 基 因20。本 文 则 填 补 了 SE-ROLOCK 技术在融合基因检测方面的空缺。此外,科学家还发现了 SHERLOCK 技术可以应用于 miR-NA、N1-甲基腺苷、感染性微生物等的快速检测22-24。SHERLOCK 技术广泛的应用潜力可为疾病的早期诊断、治疗及预防提供极大的帮助。在本研究中,笔者首先构建了 EML4-ALK 融合基因标准品质粒,经基因测序和 qPCR 鉴定质粒构建成功。根据其他研究报道,crRNA 间隔序列如低于 20 bp,Cas13a 蛋白将失去对靶 RNA 检测的作用22,因此,笔者设计的 crRNA 间隔序列区由 12 bp的 EML4 序列和 18 bp 的 ALK 序列组成,实验结果表明本文所用 crRNA 对 EML4-ALK 融合基因具有良好的检测效果。基于对标准品的扩增,本文将传统的 PCR 与 RPA 技术进行了方法学比对。传统的PCR 方法具有高特异性的优点25,但缺点在于耗时过长,扩增时长需要约 1.5 h。SHERLOCK 体系的优势在于采用 RPA 扩增,扩增一般只需 20 30 min即可完成,大大提高了扩增效率。对两者的扩增产物进行 SEHRLOCK 检测,检测体系均在 5 min 时便达到了峰值,此外,RPA 的扩增产物电泳图强度明显低于 PCR 的强度,而 RPA 的扩增产物在 SHER-LOCK 检测中所测得的荧光值高于 PCR,说明 RPA能够达到 PCR 同样的扩增效果。由此可见,RPA 适合当下临床检验的发展趋势和临床需求。为验证体系特异性,本文设置单基因对照、无意义基因对照以及空白对照。结果显示,各基因经RPA 扩增及电泳后,EML4-ALK 融合基因条带明显,其余对照组无条带显示;经 SHERLOCK 检测后,实验组荧光强度与各对照组均具有统计学差异,说明本研究体系具有良好的检测特异性,有望适用于临床检测。本研究还将标准品模板分别进行梯度稀释,并利用 qPCR 与 SHERLOCK 检测,比较两种方法的检测灵敏度。有研究显示,qPCR 技术的检测灵敏度可达 10 copies/L5,而本研究中 SHERLOCK 技术的最低检测下限也为 10 copies/L,说明基于 SHER-LOCK 技术的 EML4-ALK 融合基因检测体系具有与 qPCR 技术相近的灵敏度,能够满足临床的检测需求。而相比 qPCR 技术,SHERLOCK 技术能够大大降低检测时间。然而,本研究也存在一定的局限性:1.研究结果52生 物 技 术2023 年仍需要 EML4-ALK 融合基因阳性的肺癌血清或组织样本的验证;2.SHERLOCK 的检测灵敏度仍具有一定的优化空间,未来可通过优化引物长度、调整crRNA 检测位置等方式进一步提高灵敏度;3.与PCR 扩增产物相比,RPA 扩增产物较不稳定,需要即时进行 SHERLOCK 检测。4 结论成功构建肺癌 EML4-ALK 融合基因质粒标准品,以此标准品作为研究对象,基于 RPA 和 PCR 扩增的 SHERLOCK 检测 EML4-ALK 融合基因的相对荧光值无显著差异,且 RPA 技术全过程仅需30 min。同时验证了 SHEROLOCK 检测体系的灵敏度和特异性。比较 qPCR 与 SHERLOCK 技术发现两者的最低检出限均为 10 copies/L,且 SHERLOCK技术在 5 min 内即可进行结果判读。经验证,构建的 SHERLOCK 技术仅对 EML4-ALK 融合基因有阳性检测信号。以上表明该技术为 EML4-ALK 融合基因的快速检测提供了一种新的解决方案,为融合基因阳性肺癌患者的靶向治疗提供了潜在的诊断依据。参考文献1 Robert A,Junaid A,Sofia P,et al.Brigatinib for ALK-positive me-tastatic non-small-cell lung cancer:design,development andplace in therapyJ.Drug Design Development&Therapy,2019,13(2):569-580.2Grosse C,Soltermann A,Rechsteiner M,et al.Oncogenic drivermutations in Swiss never smoker patients with lung adenocarcinomaand correlation with clinicopathologic characteristics and outcomeJ.PLOS ONE,2019,14(8):1-19.3Zhao F,Xu M,Lei H,et al.Clinicopathological characteristics ofpatients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK fusion gene:A meta-analysisJ.PLOS ONE,2015,10(2):57-61.4 Gadgeel S M,Cote M L,Schwartz A G,et al.Parameters for individ-ualizing systemic therapy in non-small cell lung cancerJ.DrugResist Updat,2010,13(6):196-204.5 Dwivedi S,Purohit P,Misra R,et al.Diseases and molecular diag-nostics:A step closer to precision medicineJ.Indian Journal ofClinical Biochemistry,2017,32(4):374-398.6 Peter P,Lieven C,Matthijs V,et al.A unified censored normal re-gression model for qPCR differential gene expression analysisJ.PLOS ONE,2017,12(8):1-16.7 Shackelford R E,Vora 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