基于16S_rRNA测序技...血压疾病患者肠道菌群的变化_吴晶晶.pdf

第 卷第期 年 月福建医科大学学报 基于 测序技术分析妊娠期高血压疾病患者肠道菌群的变化吴晶晶，胡淋淋，黄凤凤，赵梅晶摘要：目的采用 测序技术对妊娠期高血压疾病（）患者肠道菌群的变化进行分析。方法选择 年月 年月入住产科重症室的 例 孕妇作为研究对象，以同期住院分娩的 例正常妊娠孕妇作为对照组。采用前瞻性研究方法，收集组患者的粪便标本，采用 测序技术检测粪便菌群，并进行生物信息分析。结果（）在 组和对照组中分别获得 、个可用的序列。（）肠道菌群多样性分析显示，组的 指数 （，）（，）和 指数 （，）（，）均较对照组显著下降，差别均有统计学意义（）；组 多样性指数（）和 多样性指数（）差别均无统计学意义（）。提示 组肠道菌群的丰度下降。（）肠道菌群多样性分析：采用主成分分析（），基于加权 距离分析的主坐标分析 图和非度量多维尺度（）估计的多样性。从 和 评分中可看出组间的分离，分别占总变异的 和 （），分析 表 明，组 间 菌 群 组 成 差 别 有 统 计 学 意 义（拟 合优度：，）。（）差异菌分析（门水平）：在前 个菌门中，组间只有候选糖杆菌门（）的相对丰度存在显著差异。组 丰度较对照组显著增加 （，）（，），。（）差异菌分析（科、属水平），组的肠道菌群中有益共生菌属（普雷沃菌属、毛螺菌属、巴恩斯氏菌属等）的比例较对照组丰度显著降低，而致病菌属（肠杆菌、放线菌、埃格特氏菌属等）的比例较对照组丰度显著增加，差别有统计学意义（）。（）采用 分析方法研究组间的生物标志物，组间有 个差异丰富的类群，其 评分均为。分析显示，组间的肠道菌群存在显著的细菌性差异。结论 患者肠道微生态失衡表现为菌群的丰度下降及菌群群落结构发生显著改变，有益共生菌属减少，致病菌属增多，可能与 的发生发展有关。关键词：妊娠高血压疾病；肠道菌群；肠道微生态；菌群多样性文献标志码：文章编号：（）收稿日期：资助项目：福建省自然科学基金项目（）作者单位：福建医科大学 附属第二医院妇产科，泉州 作者简介：吴晶晶，女，副主任医师，医学硕士 ：妊娠期高血压疾病（，）是临床常见的妊娠特有急危重症，是孕产妇和围生儿病死率增高的主要原因之一。临床上对 尚缺乏有效的预防和治疗措施。近年研究表明，肠道微生态的改变是糖尿病、高血压病等发生以及发展中的重要影响因素。肠道微生态与 的关系研究较少，本研究采用 测序技术对 患者的肠道菌群进行检测及生物信息分析，初步探讨 患者肠道菌群变化的特点，为临床制订预防和治疗策略提供新思路。对象与方法 对象采用前瞻性研究方法，收集 年月 年 月 入 住 产 科 重 症 室 的 孕 妇 例为 组，以同期入住产科病房分娩的 例正常孕妇作为对照组。组研究对象的一般资料比较见表，年龄及孕前体质量指数（，）差别无统计学意义，具有可比性。纳入标准：（）的诊断参照 妊娠期高血压疾病诊治指南（）；（）单胎妊娠；（）长期在本地居住且既往饮食无特殊；（）所有孕妇均无相关慢性消化系统疾病、感染性疾病、心脏病、慢性肾炎、糖尿病、系统性红斑狼疮等内科和手术并发症的病史。排除标准：多胎妊娠、胎儿异常、自身免疫性疾病、长期服用抗生素或调解肠道菌群药物史、合并甲状腺疾病、高血糖危象及心、肝、肺等严重功能不全者、合并恶性疾病、合并艾滋病、乙型肝炎、梅毒等传染性疾病、吸烟等。正常妊娠和 妊娠均在孕 周终止妊娠。本研究经笔者医院伦理委员会批准（审批号：），患者或直系家属均知情同意。方法 采集标本用粪便收集容器、带螺帽的导管收集组孕妇粪便样本，每个导管预装 稳定溶 液。样 品 收 集 在 导 管 中，使 用 液 氮 罐 转 运，冰箱保存备用，直到 提取。实 验 方 法利 用 正 向 引 物 （）和反向引物 （）对 基因 区进行 扩增。采用特定的福建医科大学学报 年表一般资料对比 一般资料 组对照组统计量生产方式 顺产 剖宫产 年龄岁 孕前 （）收缩压 舒张压 孕周周（，）（，）。：体质量指数；：妊娠期高血压疾病。生产方式和孕周的统计量分别为和值，余指标的统计量为值。特 定 序 列 合 成 到 序 列 中。反 应 体 系：高 保 真 酶 为 。各（）前 后 引 物，模 板，。按照以下反应条件进行 扩增：预变性 ；变性 退火 延伸 ，个循环；最终延伸 。产物用 （，美国贝克曼库尔特公司）纯化，使用 检测试剂盒（美国英杰公司）进行量化。定量后应用 平台（）进行高通量测序。生物信息分析序列数据分析主要使用 和统计包（）。使用 软件计算 操 作 分 类 单 位（，）水平多样性指数，包括 指数、指数、基于系统学的谱系多样性指数曲线、和 指数等，生成 水平丰度等级曲线，绘制稀释曲线，多样性指数组间差异分析，比较样本间的 丰度和均匀度。通过 软件计算 距离度量，绘制主成分分析（，）、主 坐 标 分 析（，）图和非度量多维尺度分析（，）图，对不同样本的微生物群落结构进行多样性分析。采用 统计包的 检验对门、纲、目、科、属、种水平的类群丰度进行统计学比较。采用 分 析 方 法 鉴 定 组 间 差 异 丰 富 的 细 菌 类群。最终只考虑那些获得对数线性判别分析（，）评分的类群。统计学处理采用 软件对数据进行统计分析，对计量资料进行正态性检验，符合正态分布计量资料以表示，并采用独立样本检验（组间）和配对样本检验（组内），不符合正态分布则以中位数与四分位数表示，并采用秩和检验，组间差异分析使用 检验，组内使用 检验；计数资料采用百分比描述，等级资料采 用 秩 和 检 验，组 间 率 的 比 较 采 用检 验。为差别有统计学意义。结果 测序结果 测序时，组排除质量控制不符合标准的个样本，最终纳入 个样本。生物信息分析显示，在对照组和 组中分别获得 和 个可用的序列。等级丰度曲线如图所示。物种丰富度可以用不同物种的数量来表示，图中直线的斜率可以反映物种的均匀度。每一行代表样本 丰度分布，横轴长度代表 数量。组的丰度曲线与对照组相比呈陡峭的梯度，表明物种多样性低于对照组，组物种的丰度、均匀度均低于对照组。稀释曲线分析抽样序列条数 时，随着测序条数的加大，每条曲线起始时表现为急剧上升，表明患者肠道中有大量的不同菌群；在 时，曲线的序列数越来越趋于平缓，表明检测的微生物已接近饱和，更多的测序量对发现的新的 边际贡献率低，故本次测序数据量合理，反映出样品多样性完整度高（图）。肠道菌群多样性分析在多样性指数中，和 指数反映微生物群落数量的丰富度，而 和 指数则更多反映了群落的多样性和均匀性。组 和 指数均较对照组显著下降，差别均有统计学意义（），提示 组 肠 道 菌 群 的 丰 度 下 降。组 的 微 生 物多样性与对照组相比较低，但 （）和 多样性指数（）的结果差别无统计学意义（表）。肠道菌群多样性分析采用 、和 估计的多样性。红点和蓝点分别代表对照组和 组的肠道微生物样本。从 和 评分中可以看出组之间的分离分别占总变异的 和 （）（图、）。分析结果显示，组间菌群组成差别有统计学意义（拟合优度：，图）。组和对照组肠道菌群差异菌分析 门水平差异菌分析在门水平上，组粪便样本 中 相 对 丰 度 较 高 者 均 为 厚 壁 菌 门（）、拟杆菌门（）、放线菌门（）、变形菌门（）个菌门，第期吴晶晶，等：基于 测序技术分析妊娠期高血压疾病患者肠道菌群的变化轴为物种丰度等级，轴为对数尺度测量的相对丰度。图组间（）和样本间（）的丰度等级曲线 （）（）图基于系统学的谱系多样性指数曲线 组差别无统计学意义。在前 个菌门中，组间只有候选糖杆菌门（）（）的相对丰度存在显著差异，组较对照组显著增加（表，图）。科、属水平差异菌分析在科水平上，有拟杆菌科（）、普雷沃氏科（）、梭状芽孢杆菌科（）等 个科存在差异（）。在属水平上，显著差异细菌为拟杆菌属（）、普雷沃氏菌属（）、梭菌属（）等 个菌属，表中列出前 个。组与对照组间的细菌类群差异采用表 组与对照组肠道菌群多样性变化 分组丰度指数 指数 指数 指数 指数 组 （，）（，）（，）（，）对照组 （，）（，）（，）（，）表中数据为（，）。：妊娠期高血压疾病。分析方法研究组间的生物标志物，结果发现，组间有 个差异丰富的类群，其 评分均。组中 、放线菌属、放线菌目、肠杆菌属、埃格特氏菌属、拟杆菌属、变形菌属等的相对丰度均高于对照组，而 组中普雷沃氏菌科、普雷沃氏菌属、梭菌属、毛螺菌属等的相对丰度均低于对照组。结果分别用红色和绿色表示，表明 组的丰度减少和增加（图）。分析显示，组和对照组之间的粪便微生物群存在显著的细菌性差异。讨论肠道微生物群是存在于消化道中的一个复杂而巨大的微生物群落，具有许多功能，其变化与许多疾病的发生密切相关，可能是治疗干预的靶点。近年来，越来越多的研究表明，肠道菌群失衡与高血压病的发生、发展有明显相关性，高血压病患者的福建医科大学学报 年：二维 ；：；：。图 组与对照组肠道菌群多样性多样性比较 表 组与对照组肠道菌群门水平比较 分组丰度指数厚壁菌门拟杆菌门放线菌门变形菌门 组 （，）（，）（，）（，）（，）对照组 （，）（，）（，）（，）（，）表中数据为（，）。：妊娠期高血压疾病。图 组与对照组肠道菌群门水平差异 第期吴晶晶，等：基于 测序技术分析妊娠期高血压疾病患者肠道菌群的变化表 组与对照组肠道菌群属水平比较 分组丰度指数拟杆菌属普雷沃氏菌属瘤胃球菌属梭菌属巴恩斯氏菌属 组 （，）（，）（，）（，）（，）对照组 （，）（，）（，）（，）（，）分组丰度指数埃格特氏菌属放线菌属候选糖杆菌属乳酸杆菌属无氧芽孢杆菌属 组 （，）（，）（，）（，）（，）对照组 （，）（，）（，）（，）（，）表中数据为（，）。图采用 分析 组与对照组之间的细菌类群差异 肠道菌群结构存在显著差异，菌群丰度和多样性均显著下降，同样孕妇肠道菌群失衡也是高血压病的重要驱动因素。研究发现，肠道菌群失衡会导致肠道屏障障碍，进而细菌易位，导致持续系统性炎症，促进疾病的发生和发展。全身性炎症免疫反应过度及炎症介导血 管 内皮 细 胞 损 伤 可 能 是 的病理机制。目前，多认为 患者发生多系统损伤的机制是由于胎盘产生的一系列炎性因子致使胎盘组织发生氧化应激反应，从而引起母体血管内皮损伤，进而导致多系统病变，出现高血压病、蛋白尿等症状。可见炎性因子引起母体内皮损伤是 的中心环节。炎症因子与肠道微生态失衡以及细菌易位可相互促进并加重机体的炎症反应，其机制为肠道菌群失衡，条件致病菌比例增加，共生菌比例降低，特别是保护肠屏障的细菌数量降低，影响肠上皮细胞基因的表达，导致肠道通透性增加，使得脂多糖等内毒素进入体内，被免疫细胞识别后产生 多 种 炎 性 因 子，从 而 对 机 体 造 成 广 泛 损害。炎症反应肠道菌群失衡之间存在相互调控、相互促进。然而，具体的作用机制尚不明确，目前肠道菌群失衡与 关系的相关研究较少。本研究主要阐明了 患者存在肠道微生态的显著失衡。近年，有研究报道子痫前期母体肠道菌群和健康孕体间存在差异性 。本研究对 患者肠道菌群的、多样性分析发现，组存在肠道菌群的丰度下降以及菌群群落结构发生改变，说明在 疾病状态下，患者肠道微生态发生失衡。对于 患者与正常妊娠者肠道菌群变化之间的差异性，先前有研究报道，通过 测序技术对肠道菌群的宏基因组进行分析筛选，。本研究通过 测序技术进行门水平的差异菌群分析，结果显示，组相对丰度较高的前个菌群组成差别无统计学意义，组中 菌门丰度增加。是寄生在宿主细菌表面的专性附生生物，根据 谱研究，在炎症环境中活跃，可以保护哺乳动物宿主免受宿主细菌诱导的炎症损伤。而 患者正是处于全身炎性反应状态。对科、属水平差异菌分析的结果显示，在科水平上，组中拟杆菌科、变形菌科的丰度增加，而福建医科大学学报 年厚壁菌科的丰度降低。拟杆菌科是居住在胃肠道的最大的革兰阴性菌，被认为是由肠道微生物群保护的健康状态和复杂稳态的主要参与者。它在免疫紊乱、包括代谢综合征和神经系统疾病在内的全身系统疾病中发挥着重要作用 。组的肠道微生物群中有益共生菌属（普雷沃氏菌属、毛螺菌属、巴恩斯氏菌属等）的比例较对照组丰度显著降低。普雷沃 氏 菌 是 一 类 益 生 菌，与 肠 道 丁 酸 水 平 相关。丁酸菌可影响体内钠平衡和血压调节，有维稳孕妇血压功能。而 组中致病菌属（肠杆菌、放线菌、埃格特氏菌属等）的比例较对照组丰度显著增加。因此，可能由于肠道菌群中有益共生菌减少，致病菌属增多，导致肠道菌群失衡，通过细菌易位诱发疾病的发生发展。等 研究发现，肠杆菌科在肠道组织易位到内脏器官的过程中，可诱导促炎途径，改变肠道屏障相关分子。等 的研究也有类似发现，子痫前期孕妇肠道中菌群的种类和丰度，与健康孕妇相比，均发生显著变化，病原菌增多、益生菌减少、肠道菌群丰度减少，可能与子痫前期发生相关。本研究通过 分析发现，组和对照组间存在 个差异丰富的类群，可能是潜在提示疾病风险的新型生物标志物。肠道菌群中的某些特定细菌及代谢产物都会影响孕妇血压水平，如产丁酸盐细菌丰度及丁酸产物与 孕 妇血 压 水 平 显 著 负 相关，提示此类菌群及产物或可作为反映 疾病风险的特征性筛查标志物，监测这类特定菌群可作为疗效、预后的评估指标。综上所述，患者肠道菌群的丰度下降，同时菌群群落结构也发生明显改变，表现为益共生菌属减少，而致病菌属增多，失衡的肠道菌群导致肠道屏障障碍，进而细菌易位，引起的持续系统性炎症可能促进 的发生、发展。但本研究样本量较少，今后将扩大样本量，进一步研究肠道菌群、机体免疫以及 之间的关系，以及 炎症反应肠道菌群失衡之间的作用机制，将有助于 的预防和治疗。参考文献：中华医学会妇产科学分会妊娠期高血压疾病学组妊娠期高血压疾病诊治指南（）中华妇产科杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：谢幸，孔北华，段涛妇产科学北京：人民卫生出版社，：，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：第期吴晶晶，等：基于 测序技术分析妊娠期高血压疾病患者肠道菌群的变化 ，（）：，（）：，（）：，：，（），（）（：（，）（，）；：（，）（，），）（）（）（）：（），（），（）（：，）（）：，（）（，）（，），）（）：，（），：；（编辑：何佳凤）