寒湿困脾证动物模型研究进展_孟岩.pdf

48第25 卷 第 1 期 2023 年 1 月辽 宁 中 医 药 大 学 学 报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol.25 No.1 Jan.，2023寒湿困脾证动物模型研究进展孟岩1，吴威2，李威莹1，史晨旭1，刘莲宣1，丁子峻1，杨关林1，张会永3（1.辽宁中医药大学中医脏象理论及应用国家教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110847；2.珠海科技学院，广东 珠海 519041；3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（81603513）；广东省自然科学基金面上项目（2021A1515011485）；沈阳市中青年科技创新人 才支持计划项目（RC190281）作者简介：孟岩（1995-），女，辽宁盘锦人，硕士在读，研究方向：经典方剂的临床应用与实验研究，中医药疗效评价方法。通讯作者：张会永（1983-），男，河北保定人，教授、主任中医师，硕士研究生导师，研究方向：中医古典方剂的文献整理研究与经典方剂的临床 应用与实验研究。吴威（1983-），女，辽宁沈阳人，教授，博士，研究方向：基于中医理论的传统中药和方剂药理学研究与中药及天然药物的活性化学成 分研究。摘要：寒湿困脾证因寒湿或阴寒内蕴，困阻脾阳所致，是常见的中医证候类型。建立科学规范的中医证候模型对中医研究具有重要意义。目前寒湿困脾证造模方法多从外因、内因入手或从病证结合角度出发进行造模，寒湿困脾证动物模型造模方法中的外感寒湿、苦寒泻下、饮食不节、劳倦过度等具有操作简单、可控性强等特点，但并不符合临床多因素致病机制，因此多因素造模法更加符合临床实际。关于模型的评价多采用动物的宏观体征、微观指标及反证方剂来验证模型是否成功。该文旨在对寒湿困脾证动物模型的造模方法及模型评价方法做出分析与探讨。关键词：寒湿困脾证；动物模型；模型评价；中医证候中图分类号：R332 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2023)01-0048-05Research Progress of Animal Model of Cold Dampness Trapped Spleen SyndromeMENG Yan1，WU Wei2，LI Weiying1，SHI Chenxu1，LIU Lianxuan1，DING Zijun1，YANG Guanlin1，ZHANG Huiyong3（1.State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Imaging Theory and Application，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110847，Liaoning，China；2.Zhuhai University of Science and Technology，Zhuhai 519041，Guangdong，China；3.Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，Liaoning，China）Abstract：The syndrome of cold dampness and stagnation of spleen is caused by cold dampness or Yin and cold accumulation，which is a common syndrome type of traditional Chinese medicine.Establishing a scientific and standardized TCM syndrome model is of great significance to the research of TCM.At present，the modeling methods of cold dampness trapped spleen syndrome mostly start with external and internal causes or from the perspective of the combination of disease and syndrome.The animal model of cold dampness trapped spleen syndrome has the characteristics of simple operation and strong controllability，such as exogenous cold dampness，bitter cold diarrhea，improper diet and excessive fatigue，but it does not accord with the clinical multifactorial pathogenesis.Therefore，multi factor modeling method is more in line with clinical practice.As for the evaluation of the model，the macro signs，micro indexes and counter evidence prescriptions of animals are used to verify whether the model is successful.This paper aims to analyze and discuss the modeling method and model evaluation method of animal model of cold dampness trapped spleen syndrome.Keywords：cold dampness trapped spleen syndrome；animal model；model evaluation；TCM syndrome 中医证候动物模型是把人类相关疾病原型的某些特征在动物身上通过施加某种因素加以模拟复制的一种模型。动物模型的正确复制是实验成功的前提与基础，也是还原疾病发生、发展规律的重要保障。“脾主运化”指运化水谷和水湿的生理功能，而运化失常经常表现为脾阳虚与脾气虚，湿浊不化，久病湿从寒化，进而形成寒湿困脾证。寒湿困脾证在临床上以脘腹胀闷，不渴，纳呆、食少，肠鸣作泻，或身目发黄而晦暗，舌淡苔白腻等为常见症状1。相关研究显示，寒湿困脾证在急性感染性腹泻的中医证型中占比4.52%2，并且与多种消化系统疾病息息相关，如溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠易激综合征等。因此，寒湿困脾证的研究受到广大临床及科研工作者的普遍关注。现今寒湿困脾证造模方法较为繁杂，本质却多属于脾阳虚。本文就寒湿困脾证动物模型造模方法和模型评价进行总结与分析，为今后寒湿困脾证动物模型制备提供参考。1模型造模方法1.1 外感寒湿造模法寒为阴邪易损伤阳气，湿为阴邪易阻滞气机。DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2023.01.01149 25 卷 辽宁中医药大学学报 久居寒湿之地，易导致寒湿之邪损伤脾阳，寒湿中阻。谢俏俏3每天中午将大鼠放入温度为（40.5），湿度为（902）%的气候箱中4 h，连续造模21 d，大鼠出现精神萎靡、嗜睡、懒动、肛周秽浊、体质量减轻、毛发无泽并伴有舌上的瘀斑、瘀点等症状。王常松等4每天上、下午将Wistar大鼠分别置于自制寒湿气候箱中1.5 h，然后每晚用8 的面糊灌胃，连续造模21 d，造模后大鼠出现反应迟钝、精神萎靡、行动迟缓、拱背、眯眼、摄食量减少、肛温污秽及便溏等症状，并用胃苓汤治疗后大鼠症状明显缓解。寒湿困脾日久的患者会伴有身目发黄、皮肤晦暗等症状。曲长江等5每天将Wistar大鼠置于相对湿度为95%以上，温度812 的气候箱内，并每日上午给予2 mL/100 g大黄煎剂灌胃，造模后大鼠出现蜷缩、毛发晦滞、肛周秽浊、扎堆、耳背皮肤略有黄色等症状，符合寒湿困脾的表现。外用寒湿因素是常用的造模方法，但此造模方法对于外界条件要求较高，造模箱内的温度不易控制，如用冰块放入箱中模拟寒冷环境，冰块融化速度较快，需要人长期观察等待，大量浪费了人力。当实验动物长期生存在寒湿气候箱中，大鼠不仅会出现寒湿困脾的表现，还会出现关节僵硬等痹症的表现，夹杂症状较多，所以需要学者仔细斟酌实验方案，减少实验误差。1.2 苦寒泻下受“火热之邪”的影响，目前临床上多喜欢用苦寒泻火的药物治疗炎症，然而过度服用苦寒之品，易导致脾胃阳气受损，虚寒内生，进而寒湿困脾6。张发斌等7采用大承气汤对大鼠进行灌胃，造模后大鼠出现体质量减轻、嗜睡、蜷卧、畏寒、肛周有污物等表现，但造模结束后大鼠的表现逐渐恢复，并接近于正常。樊慧杰等8用大黄煎剂按照20 g/kg的剂量进行灌胃，造模18 d，大鼠出现毛黄无泽、大便稀溏、行动缓慢、蜷缩、消瘦等症状。目前大黄灌胃是苦寒泻下法最常用的造模方法，除此之外番泻叶也是常用药物之一。孟静一9用番泻叶按0.4 g/d的剂量对小鼠进行灌胃，连续5周，小鼠出现稀便、嗜卧、懒动、消瘦、毛无泽等症状。苦寒泻下法建立脾虚寒湿证动物模型具有操作简单、可重复性好的特点，但模型自我恢复时间难以确定，致使模型的稳定性差，而且寒湿困脾证是一个长期的演变过程，虽通过强制的药物干预可在短时间内出现脾虚湿困的表现，但却忽略了疾病的发展演变过程，与传统的中医理论不符。1.3 饮食不节脾胃后天之本，饮食不节，脾胃乃伤。黄炳山等10首次根据“饮食自倍，胃肠乃伤”的理论建立了脾虚证动物模型，每日采用甘蓝喂小鼠，喂猪脂2 d 1次，连续9 d，小鼠出现畏寒蜷缩、行动迟缓、肛温低、便溏等症状。麦楚填等11自制高蛋白饲料喂养大鼠，造模后大鼠出现皮毛色黄、大便黏腻、扎堆等症状。此造模方法与现代人平素饥饱无度，暴饮暴食，或过食肥甘厚味，碍胃伤脾的饮食习惯相符合。而饮食偏嗜法也属于饮食不节的一种，因此也有学者采用食醋、白酒灌胃来模拟饮食不节12-13，但此方法不符合临床致病特点，因此不建议使用。饮食不节具有简单快速、可重复性强、成本低且不需要特殊设备及条件的优点，但存在饲料用量不易精确掌握、造模周期长、饲料不易长期保存、动物易出现厌食症状等缺点。1.4 劳倦过度法济生方 云：“劳伤脾胃，脾胃既寒，积寒化水也”，所以劳倦过度也是导致脾阳虚寒湿内生的重要原因。靳荃等14将小鼠每日上午在水温（14.00.5）水中力竭游泳，下午将其置于温度（4 0.5），湿度为90%95%的气候箱中4 h，连续15 d，小鼠出现了寒湿证的表现。薛晓倩等15采用改良的疲劳法进行造模，每日将大鼠放入水池中游泳15 min，再用4 的蒸馏水灌胃，连续6 d，大鼠出现脱毛、便溏、体质量下降等症状，经藿香正气散治疗后明显好转。劳则耗气法是目前动物造模最常用的方法之一，此方法符合中医理论的发病原理，但仍存在一定的局限性，实验动物游泳力竭时间难以评判，主观性强，有学者仅以大鼠下沉作为标准，也有学者用大鼠下沉15 s或3 s来说明大鼠力竭。但大鼠下沉时间过久会使大鼠出现呛水导致肺脏的病变，进而造成模型的准确性差，因此要严格规范动物造模时间并摸索最佳造模时间。1.5 复合因素造模法复合因素造模法是目前最常用，也是最符合临床实际的造模方法，模型成功性高，稳定性强16。刘敏等17使用母子分离+束缚+番泻叶灌胃的方法，大鼠出现反抗力弱、自主活动少、耳廓色淡、稀便等症状，并经四神丸治疗后症状明显缓解。祝赫等18采用相似的方法用醋酸结合母婴分离及束缚的方法进行造模，造模后通过粪便含水量检测法验证模型成功与否。但以上两种造模方法并不符合伦理，母婴分离过于残忍，并不推荐使用。因此，孙羽中等19及唐红梅等20用番泻叶灌胃法结合束缚及夹尾刺激方法进行造模。李晟等21分两个阶段进行寒湿困脾模型造模，第17天采用游泳、大黄灌胃、寒湿环境造模，第89天用大肠杆菌灌胃，造模成功后使用加味厚朴温中汤治疗，结果显示治疗有效。复合因素造模方法是目前中医证候动物模型中最常用的造模方法，模型成功率高，稳定性强，而且模型造模方法相对于单因素造模方法时间较短，更能凸显出中医的特色，而且模型更加具有代表性及实用性。见表1。2模型评价2.1 行为学特征研究者一般都会根据实验动物的行为、精神状态、毛发、肛温、二便及体质量等来判断造模是否成功，但此方法主观性强，可信度低，因此有学者对以上指标进行了量化22，当评分大于10分判定模型造模成功，使实验更加具有说服性，如表2。钟毅等23在此基础上增加了糖水偏好实验、旷场实验及内脏敏感性来判定模型造模成功。丁凌辉等24采用相对简单的主证及兼证评判方法，当实验动物符合2项主证同时符合2项兼证，或仅符合3项主证即为造模成功。50 辽宁中医药大学学报 25 卷表2 动物模型的评分量表指标项评分标准活动度懒动、扎堆、嗜睡每项记为1分，行动轻微迟缓1分，重度迟缓2分（包括抓尾悬空反抗力弱）精神状态眯眼记1分，精神萎靡记1分，反应呆滞记2分毛发耳尾及肛门毛发稀少记1分，无泽枯黄记2分，耳尾血色淡记1分排便便软不成形记1分，水样大便记2分肛温医用数字式远红外热成像仪监测动物温度变化（一般1分，明显2分）体质量饮食量少记1分，体质量增长慢或下降记2分舌苔舌淡红无苔0分，淡红有薄苔1分2.2 反证方剂反证方剂是验证寒湿证是否成立的必要条件。不同证型的寒湿证动物模型侧重点有所不同，故反证方剂亦不同。黄文武等25研究显示，经四君子汤反证脾虚寒湿模型后，与模型组相比大鼠粪便短链脂肪酸及肠道菌群明显升高，以此说明模型造模成功。唐晓桐等26造模后大鼠出现胃肠激素分泌失调、免疫力下降等现象，并使用养脾丸反证，大鼠各项指标恢复正常。李晗等27通过高脂高糖饲料喂养并游泳的方式造模后，喂养香砂平胃颗粒，大鼠的一般症状有所缓解。赖艳等28研究表明经过蚕沙表1 动物模型造模方法分类动物模型造模方法微观指标宏观表征外感寒湿SD大鼠，雌雄对半，体质量200250 g，成模时间5周。3每 天 寒 湿 环 境 4 h，连续 21 d，然 后 生 理 盐 水0.810 mL/（100 gd）灌胃14 d。血清免疫球蛋白G-S（IgG-S）、呼吸道液lgG抗体（IgG-R）、血清中胰蛋白酶（tryp-sin）、蛋白酶激活受体-2（PAR-2），脾脏系数、胸腺系数烦躁，舌质紫黯，毛发粗糙无泽，精神萎靡，神疲，饮食减少，肛周污秽。Wistar大鼠，雄性，体质量180200 g，成 模 时 间3周。4寒湿环境上、下午各1.5 h，每晚8 左右予50%熟面糊灌胃，高脂鼠料饲养。D-木糖排泄率，胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）精神不振，行动缓慢，嗜卧，拱背，喜眯眼、扎堆，消瘦，毛发光泽枯黄，饮食量少，肛周污秽，便稀。Wistar大鼠，雌雄各半，体质量180220 g，成模时间3周。5寒湿环境，每日上午予100%大黄煎剂2 mL/100 g灌胃，不限饮食饮水。IgG、IgM眯眼，懒动，蜷卧，喜扎堆，萎靡，被毛晦滞，稀便，肛门秽浊，体质量下降，肛温降低。苦寒泻下SD大鼠，雌雄各半，体质量180220 g，成 模 时 间12 d。7大承气汤3.5 mL/200 g灌 胃6 d，大承气汤 4 mL/200 g灌胃6 d，自由饮食饮水。D-木糖浓度体质量减轻，倦怠乏力，抱团，大便溏泻，肛周污秽，毛色枯槁，食欲下降。SD大鼠，雌雄各半，体质量200220 g，成 模 时 间18 d。8大黄煎剂 20 g/kg灌胃18 d。中性粒细胞大便稀溏、食量减少、蜷缩、毛疏松无泽、行动缓慢、嗜睡、精神萎靡、消瘦。ICR小 鼠，雄 性，体 质 量1620 g，成模时间5周。90.4 g/d剂量番泻叶灌胃，力竭游泳。血清D-木糖，GAS、MTL，生长抑素（SS）、血管活性肠肽（VIP），IgG、IgM，血清总蛋白（TP）、白蛋白（AL）、血红蛋白（Hb），血清淀粉酶（AMS）体质量降低，便溏，扎堆，精神萎靡，肛周污秽，被毛稀疏，无光泽。饮食不节小白鼠，雌雄各半，体质量2037 g，成模时间9 d。10室温每日喂养甘蓝，每两日喂养猪脂。-体温、体质量降低，精神萎靡，便溏，畏寒，毛色枯黄，纳呆，迟钝，四肢无力。昆明幼鼠，雄性，体质量812 g，成模时间8 d。11每日喂食特制高蛋白高热量饲料、牛奶溶液。肠道菌群含量，血清脂多糖（LPS）精神萎靡，蜷缩扎堆，毛色黄无泽，饮食减少，粪便黏腻质软。Wistar大鼠，雌雄各半，体质量170220 g，成模时间10 d。12每日灌胃2 mL/200 g食醋。小肠酶（SDH）、小肠酶（AKP），肝细胞萎缩，肝糖原，脾脏T细胞、B细胞竖毛，被毛无泽，拱背，倦卧，嗜卧，便溏，肛周污秽，体质量减轻，体温下降。Wistar大鼠，雌雄各半，体质量170220 g，成模时间10 d。13第1日50 白酒灌胃，第2日以后每日食醋2 mL灌胃。血浆甲状腺素浓度，红细胞免疫黏附性，SDH活性，脾脏T细胞、B细胞竖毛，被毛失去光泽，拱背，倦卧，肛周污秽，腹泻，体质量减轻，体温下降。劳倦过度ICR小 鼠，雌 性，体 质 量2333 g，成模时间15 d。14寒湿环境，游泳力竭，生理盐水灌胃。小鼠扭体次数便稀，体质量升高变慢，毛发不泽，状态萎靡，嗜睡足趾及尾巴颜色变浅甚至出现瘀斑。SD大鼠，雌雄各半，体质量180220 g，成模时间2周。15寒湿环境，游泳力竭，生理盐水灌胃。水通道蛋白4（AQP4）精神萎靡，懒动，游泳耐力短，便溏，毛疏松，饮食量减少，体质量减轻。复合因素SD大鼠，180 g，成模时间6周。17束 缚，番 泻 叶 水 煎 剂（1 gkg-1）灌胃，第4周后灌胃生理盐水。腹泻指数、内脏敏感性、离体结肠舒张性活动量少，反抗力减弱，毛无泽，耳廓色淡，便溏。SD大鼠，180 g，成模时间6周。18母婴分离，醋酸刺激，束缚。血 浆 中 二 胺 氧 化 酶（DAO）、D-乳 酸（D-LA）、结肠组织病变、内脏敏感性精神萎靡，肛门污秽，腹泻，稀便，毛发光泽、扎堆、蜷卧少动，体质量减轻。SD大 鼠，雄 性，体 质 量160200 g，成 模 时 间2周。19番泻叶+生理盐水灌胃，束缚。海马、皮质、下丘脑中5-羟色胺转运体-SD大鼠，雌雄各半，体质量150170 g，成模时间7 d。20大黄煎煮液+夹尾刺激，番泻叶灌胃+束缚。平均粪点体质量减轻，大便稀溏。SD大鼠，雌雄各半，体质量180220 g，成模时间7 d。21游泳后大黄水煎液灌胃后寒湿环境饲养。白细胞介素-2（IL-2），胃肠道P物质（SP）饮食减少，大便溏，肛周污秽，倦怠乏力，毛色枯黄，体质量减轻，行动缓慢。注：“”表示含量增加，“”表示含量下降。51 25 卷 辽宁中医药大学学报 治疗的寒湿困脾证动物模型的肠道菌群与模型组比较，物种丰度、均匀度指数明显增加。韩晓春等29研究显示，薏苡仁治疗寒湿困脾证动物与正常动物比较，在离子转运功能方面存在较大区别。因此可见反证方剂作为模型成功性的评判标准仍存在一定的局限性，寒湿证的动物模型仍有不规范处或所复制的动物模型并非典型。2.3 微观指标随着现代科学技术的发展，越来越多的学者采用现代生物学技术测量蛋白含量、炎症因子表达、免疫功能及消化水平对脾胃寒湿证动物模型进行构建与评价。使构建的模型更加指标化、客观化和标准化，进而促进中医证候模型的发展。2.3.1 基于蛋白水平细胞内核转录因子B（NF-B）信号通路可调控炎症反应各个阶段的许多分子，而疾病在发生、发展过程中或多或少都会有炎症的参与，因此有学者通过检测炎症通路蛋白来验证模型成功性。李姿慧等30研究显示，与正常组比较，模型组大鼠结肠组织IB激酶亚基（IK）、核转录因子-B p65（NF-B p65）蛋白表达上调（P0.01），蛋白B抑制因子亚基（IB）蛋白表达降低（P0.01）。在临床中寒湿困脾证会使人体出现胃肠道损伤的表现。黄庆芳等31研究显示，寒湿困脾证动物模型与空白组对比，模型组大鼠的结肠组织紧密连接膜蛋白（occludin）和细胞紧密连接蛋白（ZO-1）表达增强，此蛋白主要根据肠道的通透性来判断肠道是否损伤并且发现结肠组织中能量相关代谢酶Na+-K+-三磷酸腺苷（ATP）酶、Ca2+-Mg2+-ATP活性降低（P0.05）。不仅如此寒湿困脾证患者还会出现脾虚湿盛的表现，水通道蛋白对胃肠道内水液代谢起重要的作用，因此有学者32通过检测水通道蛋白作为判断实验动物是否成功的依据，脾虚泄泻模型大鼠具有结肠水通道蛋白（AQP3）、水通道蛋白（AQP8）表达水平降低的表现（P0.01）。还有学者研究显示，脾虚湿困证模型组动物与对照组比较，大鼠小肠原癌基因蛋白质 Wnt-1（WNT1）、-连环蛋白（-catenin）表达显著增加（P0.01）33。2.3.2 基于消化水平寒湿困脾日久会有脾虚证的表现，脾虚证主要表现以消化系统为主的多系统多器官的功能低下。因此杨彬彬等33研究结果显示，模型组与对照组相比D-木糖、AMS、GAS、MTL水平显著降低（P0.01）。李慧君34研究结果同样显示D-木糖含量明显降低。赵文晓等35研究表明，与空白组比较模型组大鼠血清GAS、胆囊收缩素、VIP、尿D-木糖排泄率均下降（P0.01或P0.05）。张琦等32研究结果显示，脾虚湿困泄泻动物模型与空白组比较AMS的活性降低，D-木糖含量下降，D-LA含量升高，小肠推进率增强（P0.001）。2.3.3 基于免疫水平免疫系统在机体上可以分为先天免疫与后天免疫。肾为先天之本，与先天免疫有极大关联；脾胃后天之本，故与后天免疫有很大的联系。从解剖学角度讲，脾是人体最大的淋巴网状内皮系统，故与人体的免疫机制关系密切36。因此有很多学者从免疫机制水平探讨寒湿困脾证。韩晓春等37建立寒湿困脾证相关的动物模型，研究结果显示，与对照组相比模型组中的分泌型免疫球蛋白A（IgA）、IgG含量降低（P0.05）。王新雪38研究结果显示，脾虚泄泻小鼠与空白组比较，模型组除了以上指标含量降低外，小鼠CD4、T淋巴细胞（CD3T）淋巴细胞百分率及外周血CD4+/CD8+比值也均下降，提示小鼠免疫功能低下。2.3.4 基于炎性因子水平当机体细胞受到抗原刺激后，就会大量分泌释放白介素及肿瘤坏死因子等炎性因子，以此来说明疾病的发生。李姿慧等39研究显示，寒湿困脾证动物模型中模型组与正常组比较，大鼠血清肿瘤坏死因子-（TNF-）、血清白细胞介素-6（IL-6）及血清白细胞介素-1（IL-1）含量升高（P0.01）。余焕钦等40研究显示，大鼠结肠组织与空白组比较，模型组IL-6含量上升，白细胞介素-10（IL-10）含量下降（P0.05）。毕殿勇等41建立寒湿困脾证溃疡性结肠炎动物模型，结果显示：与空白组比较，模型组大鼠结肠组织白细胞介素-4（IL-4）含量下降，IL-1含量增加（P0.01）。李艺垚42研究结果示与对照组相比，模型组大鼠白细胞介素-2（IL-2）下降，TNF-含量增加（P0.01）。还有研究发现与空白组比较，模型组大鼠白细胞介素-17（IL-17）显著升高43。谢婧等44得出结论，与空白组比较，模型组小鼠体内LPS、TNF-含量下降（P0.001）。3讨论与小结目前寒湿困脾证动物模型的造模方法主要分为外感寒湿、内伤脾胃以及两者相结合的方式进行造模，造模后主要通过模型动物的行为学特征、二便、饮食等宏观表征及药物治疗后动物的宏观改变来评价造模是否成功。随着研究不断深入，检测微观指标和观察病理切片已经成为模型评价不可或缺的一部分，这两者使构建的模型更加指标化、客观化。虽然造模方法及模型评价在不断地改进，但仍存在一些问题亟需我们去解决。首先就造模方法而言，大多数学者的造模方法多是根据中医理论外湿引动内湿，而内湿的构建多是通过改变实验动物的饮食结构来实现的，如通过定制的高脂高糖或高蛋白高热量饲料自由饮食的方式进行造模，食用不同饲料造模结果差异较大，在药物干预的情况下存在混乱给药及给药剂量不精确、无统一标准等问题。外感寒湿因素大多是通过使用人工气候箱来模拟外界寒湿环境，但是造模箱内的湿度、温度以及造模时间等因素没有明确标准，并且这些因素难以得到精确控制。复合因素造模方法种类繁多，多种因素的施加可以增强模型的稳定性，提高模型的成功率，但是在造模顺序上存在一定的差异性。就模型评价而言，在造模结束后，许多研究者都是根据模型动物简单出现的宏观表征来评判模型是否成功，即使有学者对宏观表征进行了量化也会存在主观差异性，而且中医的舌脉辨证目前仍无法在动物模型中实现。在模型的检测指标方面，被检测指标通常都缺乏特异性，如白介素及肿瘤坏死因子等，在任何疾病中都可作为评价标准。D-木糖、血清淀粉酶、胃泌素、胃动素水平可以在其他胃肠道疾病中52 辽宁中医药大学学报 25 卷出现，如功能性消化不良、食管癌45-46等，并不是寒湿困脾证所独有。综上所述，中医证候动物模型尚未成熟，还需不断完善。后期研究人员要在前人的基础上不断摸索，开展更多的模型进行对比研究，确定最佳造模方法并统一造模因素、给药剂量、造模时间等因素。在造模方法中多使用中医证候与临床疾病相结合的方式造模，并且将中医的特色舌诊、脉诊应用到实验研究中。明确中医证候之间的区分点，将证型明确划分，并结合临床寻找更加确切的微观评价指标。参考文献 1 国家技术监督局.GB/T 16751.1-16751.3-1997中医临床诊疗术语 Z .北京：中国标准出版社，1997：36-37.2 叶青艳，陈建杰，周华，等.急性感染性腹泻中医证型分布 J .中国中西医结合杂志，2016，36(6 )：678-680.3 谢俏俏.阿里红对寒湿证大鼠血清和尿液的核磁共振代谢组学研究 D .乌鲁木齐：新疆医科大学，2020.4 王常松，吴同玉，陈学习，等.寒湿困脾证动物模型的建立和评价 J .上海中医药大学学报，2011，25(5 )：75-78.5 曲长江，王文丽，吴谙诏，等.中医黄疸动物模型的建立 J .辽宁中医杂志，2005，48(10 )：106-108.6 孙苗苗，王珊珊，郭立中，等.温运中土法临床应用初探 J .中医杂志，2017，58(7 )：605-607.7 张发斌，吴萍，李杰，等.太阴病（脾阳虚证）“欲解时”大鼠血清淀粉酶变化研究 J .时珍国医国药，2018，29(2 )：492-494.8 樊慧杰，柴智，闫润红，等.补中益气汤对脾气虚证模型大鼠手术切口肌肉组织炎症反应和肉芽组织增生的影响 J .中医杂志，2014，55(3 )：238-241.9 孟静一.基于苦寒泻下脾虚小鼠模型的党参多糖补脾作用研究 D .太原：山西医科大学，2021.10 黄柄山，毛翼楷，范隆昌，等.饮食失节所致的脾虚动物模型及中药治疗观察 J .中西医结合杂志，1983，3(5 )：295-296.11 麦楚填，吴美媚，屈畅，等.小儿七星茶对食积模型小鼠肠道菌群的调节作用 J .广州中医药大学学报，2018，35(5 )：881-886.12 彭成，罗亮.过食酸味所致脾虚机制的实验研究 J .山东中医学院学报，1989，13(6 )：13-14.13 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