核苷类似物耐药在慢性乙型肝炎的机制研究进展_仵朝晖.pdf

doi:10.3969/j.issn.1006-5709.2023.01.021综述基金项目:甘肃省青年科技基金(20JR10RA016)第一作者简介:仵朝晖,在读硕士,住院医师,研究方向:胃肠病及肝病基础研究。E-mail:441401977 通讯作者:于晓辉,博士,主任医师,研究方向:胃肠病及肝病基础研究。E-mail:yuxiaohui528 ;李初谊,硕士,主治医师,研究方向:胃肠病及肝病基础研究。E-mail:13679428930 核苷类似物耐药在慢性乙型肝炎的机制研究进展仵朝晖1,2,陈顺1,贾栋1,2,李斌1,于晓辉1,李初谊11.中国人民解放军联勤保障部队第九四医院消化内科,甘肃 兰州 730050;2.甘肃中医药大学第一临床医学院【摘要】慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者的抗病毒治疗除了可以使用核苷类似物(nucleoside analogues,NAs)治疗外,还可以考虑使用干扰素。但 NAs 的临床应用虽然在一定程度上降低了 CHB 的发病率,延缓了病程进展,但在长期抗病毒治疗过程中容易产生耐药,导致治疗失败并最终进展为肝硬化甚至肝癌。对此,本文重点就 NAs 治疗 CHB 现状、机制、耐药原因进行综述。【关键词】慢性乙型肝炎;核苷类似物;干扰素;耐药中图分类号:R575文献标识码:A文章编号:1006-5709(2023)01-0101-05收稿日期:2022-02-22Research progress on mechanism of nucleoside analogues resistance in chronic hepa-titis BWU Zhaohui1,2,CHEN Shun1,JIA Dong1,2,LI Bin1,YU Xiaohui1,LI Chuyi11.Department of Gastroenterology,the 940th Hospital of the Joint Logistic Support Force of PLA,Lanzhou 730050;2.The First Clinical Medical College of Gansu University of Chinese Medicine,China【Abstract】In addition to nucleoside analogues(NAs)therapy,interferon can also be used for antiviral treatment of chronic hepatitis B(CHB)patients.However,although the clinical application of NAs reduces the incidence of CHB and delays the progression of the disease to a certain extent,it is easy to produce drug resistance in the long-term antivi-ral process,resulting in treatment failure and eventually progression to liver cirrhosis or even liver cancer.In this paper,the current status of NAs treatment of CHB,the mechanism of NAs treatment of CHB,and the causes of drug resistance to NAs treatment of CHB were reviewed.【Key words】Chronic hepatitis B;Nucleoside analogue;Interferon;Drug resistance乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染全球流行,全世界估计有 20 亿人感染 HBV,每年因 HBV导致的肝硬化、肝衰竭、肝细胞癌(hepatocellular carci-noma,HCC)死亡的患者有 68 万人1。慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是指 HBV 检测为阳性,病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎表现者,是当前世界严重的公共卫生问题,目前各种抗病毒药物的出现以及我国传统医学的发展,使 CHB 治疗得到明显进展及提高,比如核苷类似物(nucleoside ana-logues,NAs)。但 HBV 感染的抗病毒治疗仍然是一个主要的临床问题。由于 HBV 基因组的病毒持久性和异质性,耐药菌株不断出现,导致抗病毒治疗效果显著下降。耐药引起的肝炎、组织学改善的逆转,有时还会出现病情严重恶化、肝功能失代偿甚至死亡。有研究2显示,我国 HBV 耐药仍有增高的趋势,且病毒耐药问题一直未得到有效解决。本文将近年来 NAs 治疗 CHB 现状、机制、耐药原因的研究进展进行综述,以加深我们对于 NAs 耐药问题的深刻理解和认识,以期为我们进一步的研究提供理论基础。1NAs 治疗 CHB 现状HBV 是一种 DNA 病毒,通过使用逆转录的 RNA中间体复制其基因组,感染这种病毒可导致肝硬化或HCC。干扰素(常规或聚乙二醇化)和其他 6 种属于NAs 的药物如拉米夫定(Lamivudine,LAM)、阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)、恩 替 卡 韦(Entecave,ETV)、替比夫定(Telbivudine,LdT)、富马酸替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)和富马酸丙酚替诺福韦(Tenofovir alafenamide fumarate,TAF)已在世界许多地区被批准用于治疗 CHB3。干扰素和 NAs 目前均用于治疗 HBV 感染。干扰素抗 HBV 的机制是干扰素与位于肝细胞表面的干扰素受体结合后,把干扰素的信号传到细胞核,激活干扰素要激活的基因,从而表达出实现干扰素功能的一系列蛋白质,再去激活其他一些特殊功能的蛋白质,达到抗病毒或免疫增强的作用。而目前主要用 NAs 作用于 HBV 的聚合酶区,通过取代病毒复制过程中延长聚合酶链所需的结构相似的核苷,终止链的延长,从而抑101胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1制病毒复制。因为干扰素有严重的不良反应,所以,它在临床实践中的使用往往受到限制,包括血小板减少、中性粒细胞减少、淋巴细胞减少、失眠、抑郁等,但 NAs治疗的不良反应通常是轻微甚至比较罕见的。NAs 由于比干扰素具有更少的不良反应而得到更广泛的应用4。在过去的 20 年里,NAs 治疗 CHB 患者的治疗模式发生了重大转变,通过抑制病毒复制活性,随后停止肝脏坏死和纤维化消退,可以降低失代偿期肝硬化或 HCC 的发生。虽然 NAs 抑制病毒复制,但它们并不能完全消除许多患者的 HBV。因此,许多 CHB 患者需要接受长期抗病毒治疗5。持续使用 NAs 治疗可以延缓肝硬化患者 CHB 的临床进展。虽然 NAs 抑制病 毒 复 制,但 它 们 并 不 能 完 全 消 除 许 多 患 者 的HBV。因此,许多 CHB 患者需要接受长期抗病毒治疗。但由于 NAs 长期抗病毒治疗的性质,HBV 对某些NAs(包括 LAM、LdT 和 ADV)产生了耐药性,导致病毒重新激活和疾病复发。因此,HBV 耐药率较低的NAs(包括 ETV、TDF 和 TAF)被推荐作为一线抗 HBV药物6。NAs 耐药过程中,NAs 原发性突变直接导致耐药性,而代偿性(或继发性)突变可改善病毒复制适应度。抗病毒药物耐药性需要的初级突变越多,NAs 抗病毒药物的耐药性就越高。HBV 单一的初级突变来抵抗对 LAM、LdT 和 ADV 的活性。然而,HBV 对 ETV的耐药性需要三种突变,包括 rtL180M、rtM204V/I 和rtI169、rtT184、rtS202 或 rtM250 的任何突变7。TDF或 TAF 耐药性高于 ETV。据报道,81%的 CHB 患者仍然接受 LAM、LdT 或 ADV,尽管耐药性较低,但在我国作为初始治疗,它们相对便宜。因此,HBV 患者对NAs 的耐药形势严峻。2NAs 治疗 CHB 机制2.1HBV 结构特点 HBV 是一种部 分双链嗜肝DNA 病毒,而可以引起人体感染病毒的种属为正嗜肝DNA 病毒属,其包膜围绕着一个二十面体核衣壳,它包含一个部分双链、松弛、环状 DNA(rcDNA)基因组,其基因组约 3.2 kb8。四个部分重叠的开放阅读框(open reading frame,ORF),称为 P(聚合酶)、S(表面)、C(核心)和 X(HBx 蛋白),定义了 HBV 基因组的编码能力。而最长的阅读框 P 基因区即为编码具有逆转录酶活性的 DNA 聚合酶9。2.2HBV 感染机制HBV 主要在肝细胞中感染和复制。HBV 感染的启动是一个多步骤的过程,涉及到HBsAg 糖蛋白的高度构象决定区域(a)与细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖的结合,这是一种可逆的低亲和性结合反应。随后,HBV 与其特定的主要受体 Na+牛磺胆酸共转运多肽(sodium taurocholate cotransporting poly-peptide,NTCP)相互作用,通过乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)(L)蛋白(由 pre-S1 编码)具有高亲和力,触发病毒的内化。NTCP 与pre-S1 蛋白之间的相互作用区域已经被定位,允许未来合理的药物设计来阻断病毒的进入。在某些感染阶段,前核 ORF 的翻译可导致血清中建立慢性肝炎所需的分泌蛋白,即乙型肝炎 e 抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)。2.3HBV 复制机制HBV DNA 是由两条螺旋的DNA 双链构成,其中正链长度 较短,为松弛 的环状DNA(rcDNA),在 DNA 聚合酶的作用下,以此为模板进行复制,最后形成一条环状的、完整的长链;另一条负链本身即为完 整的环状长 链。正 链 复 制 完 成 后HBV 基因组就变成了一个完全闭合的双链环状 DNA,可以将其看作 HBV 复制的原始模板,称为共价闭合环状 DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。cccDNA 稳定性极高,代谢周期长不易被破坏。此后病毒将会利用肝细胞内的酶类,并以 cccDNA 的一条链为模板进行一代又一代的复制,最终装配在一起,整合成新的 HBV DNA 颗粒,新一代的 HBV 可感染其他健康的肝细胞,也可被释放入血10。病毒进入细胞后,rcDNA 基因组被运输到细胞核中,并利用宿主细胞 DNA 修复反应转化为 cccDNA。HBV cccDNA 分子与组蛋白 H3、H4 和非组蛋白相关联,形成典型的病毒小染色体11。组蛋白 H3 和 H4的乙酰化状态直接驱动 HBV cccDNA 的转录活性,而H4 的甲基化则抑制 cccDNA 的转录。前基因组 RNA(pre-genomic RNA,pgRNA)从细胞核输出,形成逆转录模板,由此形成两条 HBV DNA 链。pgRNA 也可以作为核心蛋白和聚合酶的翻译模板。含有 pgRNA 和HBV 聚合酶的核心分子的复制复合物在细胞质中与聚合酶结合后形成 pgRNA 中的 5茎环结构()。rcDNA基因组是在核衣壳内复杂的模板引物和多步骤过程后产生 的,这 导 致 了 未 成 熟 的 核 衣 壳 的 形 成,其 中pgRNA 发生了逆转录。为了脱离细胞,含 HBV 基因组的衣壳与内质网中的 HBV 表面蛋白结合,并在通过分泌途径离开肝细胞之前在内质网中易位。HBV 复制的一个特征是在血液中分泌大量的 HBsAg 亚病毒颗粒,主要以 1725 nm 包膜球形囊泡的形式存在9。2.4NAs 治疗机制治疗 HBV 的关键是:(1)靶向(cccDNA)池;(2)克服 HBV 特异性 B/T 细胞的耗尽,因此抗 HBV 治疗可分为两大类:直接作用抗病毒药物(NAs)和免疫调节疗法12。HBV 的生命周期中,HBV 进入涉及途径:(1)HBsAg糖蛋白的高度构象决定区域(a)与细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖的结合;(2)HBV 与其特定的主要受体 NTCP相互作用,通过病毒 HBsAg(L)蛋白(由 pre-S1 编码)201胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1具有高亲和力,触发病毒的内化;(3)HBV 颗粒与细胞膜的融合是由受体介导的内吞作用介导的13。NAs 可以作用于 HBV 生命周期的一个或多个步骤(见图 1):(1)进入;(2)核衣壳传递;(3)cccDNA 的形成或染色质化;(4)cccDNA 转录;(5)HBV RNA 蛋白翻译;(6)核衣壳的形成及包封;(7)病毒聚合酶(RT 聚合酶活性);(8)成熟核衣壳的回收;(9)病毒粒子分泌。cccDNA转录受病毒、细胞、蛋白以及炎症细胞因子(IL-6、IL-1 和IFN-)的表观遗传修饰的调控12。根据上面 HBV 的生命周期以及 NAs 进入 HBV 的步骤中,NAs 可直接抑制胞质衣壳中的 HBV 聚合酶活性。例如,ETV 抑制:(1)核苷酸引物的早期步骤(第一个脱氧核糖核苷酸与聚合酶多肽的共 价连接);(2)RNA 依赖的 DNA 合成酶;(3)DNA 依赖的 DNA合成酶14。TDF 和 TAF 抑制 RT 引物和 DNA 依赖的DNA 合成酶。NAs 对 cccDNA 水平、cccDNA 染色质组织、cccDNA 转录和病毒蛋白的产生无直接影响。然而,通过大大减少 rcDNA 的合成,NAs 减少了新病毒粒子的产生,减少了成熟衣壳向受感染细胞的细胞核的循环。NAs 并不能抑制新感染细胞中 cccDNA 的从头形成,这意味着在抗病毒治疗期间持续残留的病毒血症可导致肝细胞的二次感染以及病毒 cccDNA 库的重建。所以,值得注意的是,即使病毒血症为阴性,cccDNA、HBV RNA 和衣壳相关的 HBV DNA 仍然存在于 NAs 治疗患者的肝脏中,因此,如果停用 NAs,复发率仍然很高13。图 1HBV 代谢路径和药物作用靶点Fig 1HBV metabolic pathways and drug targets3NAs 治疗 CHB 耐药原因3.1NAs 耐药简述HBV 感染作为全球公共卫生问题,可 用 于 治 疗 CHB 患 者 的 NAs 药 物 包 括 LAM、ADV、ETV、LDT 等,虽然所有的 NAs 均是 HBV 复制的有效抑制剂,但它们很少能治愈,也很少有患者达到HBsAg 清除。因此,长期使用 NAs 治疗是必要的。然而,长期治疗增加了 HBV 基因组改变的可能性,导致单药耐药或多药耐药,降低了 CHB 患者的治疗效果,并可能进 展为严重的 肝病,从而 导致抗 HBV 治 疗失败15。HBV 耐药性的发展是由特异性病毒突变直接影响 NAs 的识别和结合或通过 RT 切除终止链,并且可能伴随着互补突变。HBV 是一种具有松弛环状、部分双链 DNA 基因组(3.2 kb)的病毒16。虽然 HBV 是一种脱氧核糖核酸病毒,但它使用 pgRNA 作为复制中间体,类似于核糖核酸病毒。它的复制依赖于其 RT,它缺乏校对能力和高复制率,导致病毒基因组突变的频率显著增加17。HBV 从受感染细胞中清除的主要决定因素是存在 cccDNA。在慢性 HBV 感染期间,cccDNA 在肝细胞核中维持,在感染细胞中半衰期较长。此外,研究表明NAs 抗病毒治疗不能阻止 cccDNA 的初始形成,这表明治疗期间持续的病毒血症导致新细胞感染。HBV cccDNA 是作为病毒基因组复制重新激活的蓄水池。在肝 病 毒 感 染 的 模 型 中 也 表 明,耐 药 突 变 保 存 在cccDNA 中,因此,在使用表现出交叉耐药的药物时可301胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1能迅速被选择出来。因此,cccDNA 的稳定性和补充是目前使用抗病毒药物根除 CHB 感染的绊脚石18。3.2NAs 耐药机制抗病毒耐药性是由于病毒基因组中的适应性突变导致的结果。HBV 感染的特点是病毒的产生和周转非常快,每天产生超过 1011个病毒粒子19。此外,受感染者体内的病毒种群是高度异质性的,HBV 复制率高,且突变率高(由于 RT 的易出错性,在每个复制周期中,每 105个核苷酸替换中有 1 个发生)20,结果是 CHB 患者具有不同病毒株的混合物,每个病毒株均有一个或多个突变21。另一个研究22发现,NAs 的共同目标是含有 YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)基序的聚合酶基因的 RT 结构域,该结构域的突变将导致耐药性。HBV 菌株 NAs 耐药性的出现与 HBV 逆转录酶的初级和次级氨基酸改变有关。初级突变是氨基酸替换导致抗病毒药物敏感性下降的结果,而次级突变恢复病毒复制23。NAs 对 cccDNA 无直接抑制作用,因此需要长期的 NAs 治疗,导致 HBV 发 生耐药性突 变的风险增加24。经典的初级抗性突变包括 LAM 的 rtM204I/V(LAMr)(rtM204I 也 是 LdTr);ADV 的 rtA181V/rtN236T(ADVr)。LAMr 以及在 rtT184(A/C/F/G、I/L/M/S)、rtS202(C/G/I)和针对 ETV 的 rtM250(I/L/V)(ETVr)。最近,TDFr 报道是 rtS106C+rtH126Y+rtD134E+rtL269I 四重突变。而且,一些不寻常的突变被认为是特定 NAs 的初级抗性,如 rtM204Q、rtA181S、rtN236V 和 rtA186T。此 外,rtL180M 是 与 LAMr 和ETVr 密切相关的典型复制代偿性突变25。据报道26,HBV 聚合酶基因突变可能导致 NAs抗 性。rtM204I/V 在 RT 区 催 化 域 的 典 型 氨 基 酸(AA)取代 可能导致 LAM 和 LdT 抗 性。rtM204I/V替 换 通 常 伴 随 着 补 偿 性 替 换,如 rtL180M 和rtV173L,它们可以恢复或以某种 方式恢复 HBV 复制。此外,这些替换与 RT 其他区域的替换相结合,可对 ETV 产 生 耐 药,如 rtI169T、rtT184A/C/G/I/L/L/M/S、rtS202C/G/I 或 rtM250I/V 等。Tenney 等27报道了 在 从 LAM 用 药 到 ETV 用 药 之 前,rtV173L、rtL180M80M 和 rtM204V 存在 LAM 抗性替换。然后,在 5 年 的 ETV 治 疗 过 程 中,出 现 了 rtI169T 和rtM250V 的额外替换。体外实验表明,额 外的替代rtM250V 降低了 ETV 的 敏 感 性。此 外,HBV RT 中rtM204I/V 与 rtA181I/V 的联 合替代可获 得 多 药 耐药。由于 HBV RT 区与 HBV S 基因重叠,RT 区的替换也可能导致乙肝表面蛋白的 AA 替换,从而导致免疫逃逸或改变病毒适应度。3.2.1ADV 耐药:ADV 属于无环磷酸盐类15。ADV与其天然底物 dATP 的结构相似性,允许它可获得ADV 聚合酶。ADV 耐药相关的主要突变是 rtA181T/V、rtI233V 和 rtN236T。次 级 突 变 包 括 rtV84M、rtS85A、rtV214A、rtQ215S、rtN238T/D。rtN236T 突变可能会破坏 rtN236 和 rtS85 和 rtN236 之间以及二磷酸之间的氢键,从而降低对 ADV 的结合亲和力。同样,该区域周围的其他突变(rtP237H、rtN238T/D、rtV84M 和rtS85A)也可能破坏三磷酸结合位点。结构域 B 中的rtA181V/T 突变可能通过氢键的形成使 螺旋弯曲,因此催化位点的变构变化可能导致耐药性。其他突变(rtV214A、rtQ215S)并不直接与核苷酸相互作用,但可能导致影响聚合酶功能的变构变化28。3.2.2ETV 耐药:ETV 属于环戊烷类,对 HBV 具有较强 的 选 择 性 活 性。目 前 已 发 现 两 种 抗 性 模 式:rtM250V+rtI169T+M204V+L180M 和 rt184G+rtS202I+rtM204V+rtL180M。ETV 的耐药性需要多重突变,这表明对耐药性的遗传障碍更高。rt250 突变似乎改变了引物链与模板 DNA 之间的结合相互作用29。rt169与 dNTP 相互作用,并可能与 rt250 的突变位点协同工作。这些 突 变 的 组 合 可 能 会 影 响 DNA 链 的 延 伸。rtT184G 和 rtS202I 突变相互作用,影响 DNA 模板结合区 螺旋与 片之间的疏水核心区,编码 C 域的 2个催化天冬氨酸残基。rt184 和 rt202 残基上的替换将放大 YMDD 环中 LAM 耐药突变的影响,影响核苷酸装载和引物末端添加时的底物识别。在无 LAM 耐药突变的情况下,rtT184G 和 rtS202I 突变并不影响 HBV对 ETV 的易感性30。4NAs 耐药的预防 HBV 感染已成为严重的公共卫生问题,预防和控制 HBV 感染极为重要,NAs 为目前治疗 HBV 感染的主要药物,而其耐药问题影响着治疗效果,如何预防HBV 耐药值得引起重视31。预防措施主要包括以下几方面:(1)根据 2019 年慢性乙型肝炎防治指南32,不同 NAs 耐药情况及推荐用药如下:对于 LAM 或 LdT耐药患者,换用 TDF 或 TAF;对于 ADV 耐药,之前未使用 LAM 或 LdT,换用 ETV、TDF 或 TAF;ADV 耐药,且对 LAM/LdT 耐药,换用 TDF 或 TAF;ETV 耐药,换用 TDF 或 TAF;ETV 和 ADV 耐 药,换 用 ETV 联 合TDF,或 ETV 联合 TAF。TDF 及 ETV 作为目前抗 HBV的推荐用药,但针对不同药物耐药情况以及患者个体差异,目前仍未有明确的最佳治疗方案;(2)定期随访,每 36 个月复查血常规、肝功、HBV DNA、乙肝两对半、AFP、腹部超声、肝纤维化测定等,如发现病毒性突破,及时更换调整药物;(3)提高患者的依从性,避免随意停药、更换药物剂量、更换其他药物等;(4)避免应用可引起交叉耐药的 NAs 药物,可根据变异位点检测结果选择抗病毒药物;(5)对于初治的 HBV 感染401胃肠病学和肝病学杂志2023 年 1 月第 32 卷第 1 期Chin J Gastroenterol Hepatol,Jan 2023,Vol.32,No.1患者,首选 ETV、TDF 或 TAF 抗病毒治疗。5展望在 NAs 应用于临床后,我国 HBV 感染患者的生存率提高,相关并发症死亡率降低。在未来的发展中,针对 NAs 耐药问题,研发新一代的创新型药物,以临床治愈为目标,与真实世界临床资料相结合,为临床提供有效用药证据33。随着医学科技进步,新型的抗病毒药物逐步被研发,先进的检测技术应用于临床,细胞内 cccDNA 有望被彻底清除,使 HBV 达到真正治愈,我们 应 以 此 为 目 标,为 HBV 慢 性 感 染 患 者 带 来曙光34。参考文献1 Polaris Observatory Collaborators.Global prevalence,treatment,and prevention of hepatitis B virus infection in 2016:a modelling study J.Lancet Gastroenterol Hepatol,2018,3(6):383-403.DOI:10.1016/S2468-1253(18)30056-6.2 Park ES,Lee AR,Kim DH,et al.Identification of a quadruple mutation that confers tenofovir resistance in chronic hepatitis B patients J.J Hepatol,2019,70(6):1093-1102.DOI:10.1016/j.jhep.2019.02.006.3 Chinese Society of Infectious Diseases,Chinese Medical Association;Chinese Society of Hepatology,Chinese Medical Association.The guidelines of prevention and treatment for chronic hepatitis B(2019 version)J.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2019,27(12):938-961.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-3418.2019.12.007.4 Wang X,Liu X,Dang Z,et al.Nucleos(t)ide analogues for reducing hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B patients:a systematic review and Meta-analysis J.Gut Liver,2020,14(2):232-247.DOI:10.5009/gnl18546.5 Mak LY,Wong DK,Cheung 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