横经席不同部位提取物药效学评价研究_黄源春.pdf

-87-横经席不同部位提取物药效学评价研究 黄源春1,2 郑志远1,2 吕林艳1,2 蒙永明1,2 梁云飞1,2 刘 洋1,2 （1.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543000；2.广西天然药物现代制剂技术工程研究中心，广西 梧州 543000）【摘 要】目的：评价横经席不同部位提取物的抗细菌性炎症及改善脂肪肝的作用。方法：以受精后 3 天的斑马鱼用于横经席样品抗细菌性炎症功效最大检测浓度测定及其功效评价；以受精后 5 天的斑马鱼用于改善脂肪肝功效评价。结果：横经席根茎和横经席枝叶抗细菌性炎症功效最大检测浓度均为 125 gmL-1，横经席种子抗细菌性炎症功效最大检测浓度为2000 gmL-1；横经席根茎和横经席枝叶31.2 gmL-1、62.5 gmL-1和125 gmL-1及横经席种子500 gmL-1、1000 gmL-1和 2000 gmL-1浓度组炎症部位中性粒细胞数量较模型对照组减少，具有统计学差异。横经席根茎 125 gmL-1浓度组、横经席枝叶 62.5 gmL-1和 125 gmL-1浓度组及横经席种子 1000 gmL-1和 2000 gmL-1浓度组肝脏染色强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异。结论：横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子均具有抗细菌性炎症、改善脂肪肝功效。【关键词】横经席；提取物；斑马鱼；细菌性炎症；脂肪肝【中图分类号】R282 【文献标识码】A 【文章编号】1008-1151(2022)12-0087-04 Study on Pharmacodynamic Evaluation of Extracts from Different Parts of Calophylli Herba Abstract:Objective:To evaluate the antibacterial inflammation and the improvement of fatty liver with the extracts from different parts of Calophylli herba.Methods:Zebrafishes of 3 days after fertilization were used to determine the maximum test concentration of antibacterial inflammation and the evaluation of efficacy;zebrafishes of 5 days after fertilization were used to evaluate the efficacy of improving fatty liver.Results:The maximum detectable concentration of antibacterial inflammatory efficacy of rhizomes,branches and leaves of Calophylli herba is 125 gmL-1,while the maximum detectable concentration of antibacterial inflammatory efficacy of Calophylli herba seeds is 2000 gmL-1.Compared with the model control group,the number of neutrophils in inflammatory sites is decreased in the Calophylli herba rhizomes,branches and leaves of 31.2 gmL-1,62.5 gmL-1 and 125 gmL-1,and in the Calophylli herba seeds of 500 gmL-1,1000 gmL-1 and 2000 gmL-1 groups,which is statistically different.The liver staining intensities in the rhizomes of Calophylli herba with 125 gmL-1 concentration group,the branches and leaves of Calophylli herba with 62.5 gmL-1 and 125 gmL-1 concentration group,and the seeds of Calophylli herba with 1000 gmL-1 and 2000 gmL-1 concentration group are significantly lower than those of the model control group,which is statistically different.Conclusion:The rhizomes,branches and leaves of Calophylli herba and the seeds of Calophylli herba have the effect of antibacterial inflammation and the improving fatty liver.Key words:Calophylli herba;extract;zebrafish;bacterial inflammation;fatty liver 引言 横经席，别名篦子王、梳篦王、薄叶红厚壳、独角风（广西中草药）、铁将军、跌打将军、碎骨莲、皮子黄（广州部队常用中草药手册），属藤黄科胡桐属植物薄叶胡桐（Calophyllum membranaceum Gardn.et Champ），常以根、叶入药1。性味微苦、平，具有祛风湿、壮筋骨、活血止痛等功能，主产于广西梧州、玉林、百色、南宁等地，为广西道地药材。横经席主要生长于山地疏林或密林中，为木本中药材。根、叶用于治疗风湿关节痛、腰腿痛、跌打损伤、黄疸型肝炎、月经不调、痛经；叶外用治外伤出血1。其叶、茎、根、皮、种子等部位含有呫吨酮类（Xanthones）、香豆素类（Coumarins）、黄酮类（Flavonoids）、萜类（Terpenoids）等多种类型化合物。其叶的乙醇提取物的乙酸乙酯部分分离可总第 24 卷 280 期 大 众 科 技 Vol.24 No.12 2022 年 12 月 Popular Science&Technology December 2022 【收稿日期】2022-08-14【基金项目】梧州市科技计划项目（2022A04021）。【作者简介】黄源春（1989），男，广西梧州制药（集团）股份有限公司工程师，从事中药及天然药物的研究与开发工作。【通信作者】刘洋（1979），男，广西梧州制药（集团）股份有限公司高级工程师，从事药物研发、药物分析研究。-88-得木栓酮、木栓醇、-谷甾醇、-香树脂醇和 3-表白桦脂酸2。韦健全等3研究表明，横经席具有镇痛作用，能够有效缓解炎症发生过程中的早期症状，急性毒性实验表明，其在一定剂量范围内应用是安全的。目前对横经席药用研究报道甚少，为了使这一丰富的药用资源得到合理地开发、有效地利用，本文主要从药理方面对横经席的药效学进行初步探讨。1 实验材料 1.1 实验样品与药物实验样品与药物 分别称取横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子粉末，加入 5 倍量纯化水提取，保持微沸 30 分钟，过滤，药渣加 23 倍量纯化水继续提取，保持微沸 20 分钟，过滤，合并两次提取液，加入凉开水定量至 5 倍量（药粉），即得。用超纯水配制成 200 mgmL-1母液，-20分装储存。乙酸地塞米松，白色粉末，批号 B1828095，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4储存。临用前用二甲基亚砜配制成 21.7 mgmL-1母液，-20避光储存。阿托伐他汀钙片（以下简称阿托伐他汀钙），白色片剂，批号 202105219C，乐普医疗，阴凉避光储存。用二甲基亚砜配制成 11.6 mgmL-1母液，-20分装储存。1.2 实验动物实验动物 斑马鱼均饲养于 28的养鱼用水中（水质：每 1 L 反渗透水中加入 200 mg 速溶海盐，电导率为 450 Scm-1550 Scm-1；pH 为6.58.5；硬度为50 mgL-1100 mgL-1 CaCO3），由杭州环特生物科技股份有限公司养鱼中心繁殖提供，实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2022-0004，饲养管理符合国际 AAALAC 认证（认证编号：001458）的要求。转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后 3 天（3 dpf）的斑马鱼用于横经席样品抗细菌性炎症功效最大检测浓度（maximum test concentration，MTC）测定及其功效评价。黑色素等位基因突变型半透明 Albino 品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后 5 天（5 dpf）的斑马鱼用于改善脂肪肝功效评价。1.3 仪器、耗材与试剂仪器、耗材与试剂 解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；CCD 相机（VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China）；电动聚焦连续变倍荧光显微镜（AZ100，Nikon，Japan）；显微注射仪（IM300，Narishige，Japan）；拉针仪（PC-10，Narishige，Japan）；精密电子天平（CP214，OHAUS，USA）；6 孔板（Nest Biotech，China）。甲基纤维素（批号 C2004046、B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China）；脂多糖（LPS，批号 12180309，Sigma，Lsrael）；二甲基亚砜（批号 BCCD8942，Sigma，Switzerland）；油红 O（批号 SHBM5455，Sigma，USA）；1.2-丙二醇（批号 20210817，国药集团化学试剂有限公司，China）；纯蛋黄粉（批号 20200809，浙江艾格生物科技股份有限公司，China）；D-(+)-葡萄糖（批号 20201105，国药集团化学试剂有限公司，China）。2 实验方法 2.1 抗细菌性炎症功效评价抗细菌性炎症功效评价 2.1.1 MTC 测定测定 随机选取 3 dpf转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼于6孔板中，每孔均处理 30 尾斑马鱼。分别水溶给予横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子（浓度见表 1），同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为 3 mL。除正常对照组外，其余各实验组均卵黄囊注射给予 LPS 建立斑马鱼细菌性炎症模型，28 处理 5 h 后，测定横经席样品对细菌性炎症模型斑马鱼的 MTC。表表 1 MTC 测定所用的测定所用的横经席样品浓度横经席样品浓度 序号 部位 浓度（gmL-1）1 横经席根茎 31.2 2 横经席根茎 62.5 3 横经席根茎 125 4 横经席根茎 250 5 横经席根茎 500 6 横经席枝叶 31.2 7 横经席枝叶 62.5 8 横经席枝叶 125 9 横经席枝叶 250 10 横经席枝叶 500 11 横经席种子 125 12 横经席种子 250 13 横经席种子 500 14 横经席种子 1000 15 横经席种子 2000 2.1.2 抗炎功效评价抗炎功效评价 将随机选取 3 dpf 转基因中性粒细胞绿色荧光斑马鱼于 6孔板中，每孔均处理 30 尾斑马鱼。分别水溶给予横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子（浓度见表 2），阳性对照乙酸地塞米松 32.6 g mL-1浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为 3 mL。除正常对照组外，其余各实验组均卵黄囊注射给予 LPS 建立斑马鱼细菌性炎症模型，28处理 5 h 后，每个实验组随机选取 10 尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用 ImageJ v1.53k 软件分析并采集数据，分析炎症部位中性粒细胞数量，以该指标的统计学分析结果评价横经席样品抗细菌性炎症功效。统计学处理结果采用 mean SE 表示。用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析，P0.05 表明差异具有统计学意义。-89-表表 2 抗炎抗炎功效评价所用的功效评价所用的横经席样品浓度横经席样品浓度 序号 部位 浓度（gmL-1）1 横经席根茎 31.2 2 横经席根茎 62.5 3 横经席根茎 125 4 横经席枝叶 31.2 5 横经席枝叶 62.5 6 横经席枝叶 125 7 横经席种子 500 8 横经席种子 1000 9 横经席种子 2000 2.2 改善脂肪肝功效评价改善脂肪肝功效评价 随机选取5 dpf黑色素等位基因突变型半透明Albino品系斑马鱼于烧杯中，每烧杯 30 尾。分别水溶给予横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子（浓度见表 3），阳性对照阿托伐他汀钙 11.6 gmL-1，同时设置正常对照组和模型对照组，每杯容量为 25 mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予高脂饲料（纯蛋黄粉+葡萄糖），建立斑马鱼脂肪肝模型。28处理 48 h 后，给予油红 O 进行整体脂肪染色。染色结束后，每个实验组随机选取 10 尾斑马鱼在解剖显微镜下拍照，用 NIS-Elements D 3.20 高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼肝脏染色强度，以该指标的统计学分析结果评价横经席样品改善脂肪肝功效。统计学处理结果采用 meanSE 表示。用 SPSS 26.0 软件进行统计学分析，P0.05 表明差异具有统计学意义。表表 3 改善脂肪肝改善脂肪肝功效评价所用的功效评价所用的横经席样品浓度横经席样品浓度 序号 部位 浓度（gmL-1）1 横经席根茎 31.2 2 横经席根茎 62.5 3 横经席根茎 125 4 横经席枝叶 31.2 5 横经席枝叶 62.5 6 横经席枝叶 125 7 横经席种子 500 8 横经席种子 1000 9 横经席种子 2000 3 结果 3.1 抗细菌性炎症功效评价抗细菌性炎症功效评价 3.1.1 MTC 在本实验条件下，横经席根茎和横经席枝叶抗细菌性炎症功效 MTC 均为 125 gmL-1，横经席种子抗细菌性炎症功效 MTC 为 2000 gmL-1，详见表 4。表表 4 横经席样品抗炎功效浓度摸索实验结果（横经席样品抗炎功效浓度摸索实验结果（n=30）组别 浓度（gmL-1）死亡数（尾）死亡率（%）表型 正常对照组-0 0 未见明显异常 模型对照组-0 0 未见明显异常 横经席根茎 31.2 0 0 与模型对照组状态相似 62.5 0 0 与模型对照组状态相似 125 0 0 与模型对照组状态相似 250 22 73-500 29 97-横经席枝叶 31.2 0 0 与模型对照组状态相似 62.5 0 0 与模型对照组状态相似 125 0 0 与模型对照组状态相似 250 5 17-500 9 30-横经席种子 125 0 0 与模型对照组状态相似 250 0 0 与模型对照组状态相似 500 0 0 与模型对照组状态相似 1000 0 0 与模型对照组状态相似 2000 0 0 与模型对照组状态相似 3.1.2 抗炎功效评价抗炎功效评价 LPS 是一种内毒素，是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，当其作用于人类、大小鼠、斑马鱼或其他生物细胞时均会诱导炎症介质的产生4。中性粒细胞作为免疫应答的第一道屏障，具有活跃的变形运动能力，可迅速穿出血管聚集到炎症部位进行吞噬免疫5。在本次实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组炎症部位中性粒细胞数量明显增加，具有统计学差异（P0.001），表明模型建立成功；与模型对照组比较，阳性药乙酸地塞米松可以显著减少炎症部位中性粒细胞数量，具有统计学差异（P0.001）；横经席根茎和横经席枝叶31.2 g mL-1、62.5 g mL-1和 125 g mL-1浓度组炎症部位中性粒细胞数量较模型对照组减少，均具有统计学差异（P0.05&P0.001&P0.001），横经席种子 500 gmL-1、1000 gmL-1和 2000 gmL-1浓度组炎症部位中性粒细胞数量较模型对照组减少，具有统计学差异（P0.05&P0.05&P0.001），详见表 5 和图 1。表表 5 横经席样品抗细菌性炎症功效评价实验结果（横经席样品抗细菌性炎症功效评价实验结果（n=10）组别 浓度（gmL-1）炎症部位中性粒细胞数量（个，meanSE）正常对照组-8.10 0.567 模型对照组-113 5.20#乙酸地塞米松 32.6 60.7 5.23*横经席根茎 31.2 96.2 2.57*62.5 69.4 4.74*125 57.8 4.02*横经席枝叶 31.2 94.3 3.34*62.5 77.9 4.28*125 68.9 4.49*横经席种子 500 95.1 3.96*1000 91.7 5.61*2000 78.6 3.12*注：与正常对照组比较，#P0.001；与模型对照组比较，*P0.05，*P0.001。-90-与正常对照组比较，#P0.001；与模型对照组比较，*P0.05，*P0.001 图图 1 横经席样品处理后斑马鱼炎症部位中性粒细胞数量横经席样品处理后斑马鱼炎症部位中性粒细胞数量 3.2 改善脂肪肝功效评价改善脂肪肝功效评价 非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界上最主要的肝病病因之一，随着肥胖症和 2 型糖尿病在全球范围内的流行，在未来几十年中，NAFLD 可能会成为终末期肝病的主要病因6。肝脏作为鱼类脂肪合成的主要场所，会因当天进食饲料的营养搭配而造成不同的影响，如果饲料营养搭配不当，会导致脂肪合成和代谢不平衡，致使肝脏内部脂肪大量堆积，久而久之便会形成营养性脂肪肝7。油红 O 是一种强脂溶剂和染脂剂，特异性与甘油三酯等中性脂肪滴结合而呈橘红色的显色反应，常用于甘油三酯染色和定量评价8。在本实验条件下，与正常对照组比较，模型对照组肝脏染色强度显著增加，具有统计学差异（P0.001），表明模型建立成功；与模型对照组比较，阳性药阿托伐他汀钙可以显著降低肝脏染色强度，具有统计学差异（P0.001）；横经席根茎 125 gmL-1浓度组肝脏染色强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异（P0.01）；横经席枝叶 62.5 gmL-1和 125 gmL-1浓度组肝脏染色强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异（均 P0.001）；横经席种子 1000 g mL-1和 2000 g mL-1浓度组肝脏染色强度较模型对照组显著降低，具有统计学差异（均 P0.01），详见表 6 和图 2。表表 6 横经席样品改善脂肪肝功效评价实验结果（横经席样品改善脂肪肝功效评价实验结果（n=10）组别 浓度（gmL-1）肝脏染色强度（像素，mean SE）正常对照组-8944 312 模型对照组-55262 865#阿托伐他汀钙 11.6 42350 857*横经席根茎 31.2 54056 1376 62.5 54401 1602 125 49779 829*横经席枝叶 31.2 56412 1551 62.5 46851 1191*125 47047 939*横经席种子 500 52347 930 1000 49570 1085*2000 50503 1284*注：与正常对照组比较，#P0.001；与模型对照组比较，*P0.01，*P0.001。与正常对照组比较，#P0.001；与模型对照组比较，*P0.01，*P0.001 图图 2 横经席样品处理后斑马鱼肝脏染色强度横经席样品处理后斑马鱼肝脏染色强度 4 结论 本研究结果显示，横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子均具有抗细菌性炎症功效。三个横经席样品同浓度比较，抗细菌性炎症功效情况如下：（1）在 31.2 gmL-1条件下，横经席样品根茎和枝叶炎症部位中性粒细胞数量相似，无显著差异；（2）在 62.5 gmL-1条件下，中性粒细胞数量无显著差异，但横经席根茎中性粒细胞数量绝对值低于横经席枝叶；（3）在 125 gmL-1条件下，中性粒细胞数量无显著差异，但横经席根茎中性粒细胞数量绝对值低于横经席枝叶。炎症部位中性粒细胞数量越低抗细菌性炎症功效越佳，提示抗细菌性炎症功效横经席根茎最优，枝叶次之。本研究结果显示，横经席根茎、横经席枝叶和横经席种子均具有改善脂肪肝功效。三个横经席样品同浓度比较，改善脂肪肝功效情况如下：（1）在 31.2 gmL-1条件下，肝脏染色强度无显著差异，但横经席根茎肝脏染色强度绝对值低于横经席枝叶；（2）在 62.5 gmL-1条件下，横经席枝叶肝脏染色强度显著低于横经席根茎（P0.01）；（3）在 125 g mL-1条件下，横经席枝叶肝脏染色强度显著低于横经席根茎（P0.05）。肝脏染色强度越低改善脂肪肝功效越佳，提示改善脂肪肝功效横经席枝叶最优，横经席根茎次之。综上所述，横经席药材不同部位提取物均具有明显的抗细菌性炎症及改善脂肪肝的作用，其作用机制还需进一步地研究，因此对横经席进行深入研究具有一定的理论价值和实际应用前景，一方面为横经席防治细菌性炎症、脂肪肝研究提供实验基础，另一方面为后续横经席的资源开发及合理利用提供科学理论依据。【参考文献】1 全国中草药汇编 编写组.全国中草药汇编(第二版)(下册)M.北京:人民卫生出版社，1996.2 熊志勇，王辉，谢凤妮，等.滇南红厚壳叶化学成分的研究J.广东化工，2008(7):18-19.（下转第 38 页）-38-12 MIAO X,XU L,LI H,et al.Determination of olaquindox,carbadox and cyadox in animal feeds by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometryJ.Food Additives and Contaminants,2018,35(7):1257-1265.13 ZHANG H,QU W,DING C,et al.Tissue depletion of olaquindox and its six metabolites in pigs and broilers:Identification of a suitable marker residueJ.Frontiers in Veterinary Science,2021,8:638358.14 HASSANTABAR F,ZORRIEHZAHRA M J,Firouzbakhsh F,et al.Development and evaluation of colloidal gold immunochromatography test strip for rapid diagnosis of nervous necrosis virus in golden grey mullet(Chelon aurata)J.Journal of Fish 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