高效液相色谱串联质谱法测定黄芩中的植物内源激素_智绪.pdf

智绪，金桂花，吴桐彬，王月新，陈云，阚苏立（南京江北新区生物医药公共服务平台有限公司，江苏南京 211899）摘要：为了研究植物内源激素对黄芩生长的影响，建立了同时测定黄芩中赤霉素3、脱落酸、吲哚乙酸和顺式玉米素4种植物内源激素含量的液相色谱串联三重四极杆质谱的测定方法。对该方法进行优化和验证，结果表明，以Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm150.0 mm3.5 m）为色谱柱；以0.1%甲酸水为水相，甲醇为有机相梯度洗脱；流速为0.6 mL/min；柱温为30；进样量为20L；进样盘温度为4；离子源为ESI，正负采集模式；检测方式为多反应监测（MRM）方式；采用液相色谱串联三重四极杆质谱仪，以目标离子对进行定性和定量分析。在此条件下，4种植物内源激素在0.5500.0 ng/mL内线性关系良好，相关系数（R）大于0.995，检出限为0.1 ng/mL，定量限为0.5 ng/g，回收率为93.5%111.4%，相对标准偏差（RSD）小于10%，均符合验证要求。该方法快速简便，灵敏度高，可用于黄芩中4种植物内源激素的快速测定，为中药材质量提供有力保障。关键词：植物内源激素；黄芩；液相色谱串联三重四极杆质谱中图分类号:O657文献标志码:C文章编号:1004-0439（2023）01-0051-06Determination of plant endogenous hormones in Scutellaria by high-performance liquid chromatography-mass spectrometryZHI Xu,JIN Guihua,WU Tongbin,WANG Yuexin,CHEN Yun,KAN Suli(Nanjing Jiangbei New District Biomedical Public Service Platform Co.Ltd.,Nanjing 211899,China)Abstract:In order to study the effects of plant endogenous hormones on the growth of Scutellaria baicalensis,a liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry(LC-MS)was developed forthe simultaneous determination of four plant endogenous hormones in Scutellaria baicalensis.The method isoptimized and validated.The results showed that the method was performed on a Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm150.0 mm3.5 m)column by using 0.1%formic acid and methanol as mobile phases with gradientelution.The detection method used that the flow rate was 0.6 mL/min,the column temperature was 30,the injection volume was 20 L,the sample tray temperature was 4,the ion source was the electrosprayionization(ESI),positive and negative acquisition mode,and multiple reaction monitoring(MRM)mode.Qualitative and quantitative analysis was performed with target ion pairs.Under these conditions,the linear range ofthe four endogenous hormones was 0.5500.0 ng/mL,the correlation coefficient(R)was greater than 0.995,the limit of detection was 0.1 ng/mL,the limit of quantitation was 0.5 ng/g,the recoveries were 93.5%111.4%,and the relative standard deviation(RSD)was less than 10%,all meeting the verification requirements.The method is fast,simple,and highly sensitive.It can be used for the rapid determination of fourplant hormones in scutellaria and provides a strong guarantee for the quality of Chinese Herbal Medicines.Key words:plant endogenous hormones;Scutellaria;liquid chromatography-tandem triple quadrupolemass spectrometry收稿日期：2021-12-10作者简介：智绪（1991），女，工程师，硕士，研究方向为小分子化合物色谱质谱分析及其质量控制。通信作者：阚苏立（1986），男，高级工程师，博士，研究方向为小分子化合物色谱质谱分析及其质量控制。高效液相色谱串联质谱法测定黄芩中的植物内源激素印 染 助 剂TEXTILE AUXILIARIESVol.40 No.1Jan.2023第40卷第1期2023年1月印染助剂40卷植物内源激素是在植物体内合成的具有信号作用的微量有机物，由植物组织代谢合成，以微量浓度作用于特定的蛋白质受体，调节植物的生长发育。目前常见的植物内源激素主要有生长素类、赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯、脱落酸。其中，生长素、赤霉素、细胞分裂素属于生长促进剂，脱落酸和乙烯则属于生长抑制剂1-2。黄芩是唇形科多年生草本植物，在药材市场的需求量极大，是40种大宗药材之一，具有止血、泻火解毒和清热燥湿等药用功效3。然而，随着耕作环境的变化，黄芩的生产量日益降低，提高产量成为亟需解决的问题。同时，不同产地的生长环境各异，还会导致黄芩药效的不同，这主要是因为外在的生态环境会影响活性代谢产物的积累。因此，研究黄芩各部位的植物内源激素含量变化，不仅有益于了解黄芩生长发育周期的各种生理变化，而且对于引导调节黄芩生长发育过程中的生长环境也非常有意义4-6。然而植物内源激素在药用植物的体内含量极低，故建立高效快速、准确检测植物内源激素的分析方法，成为激素研究领域重要的技术工作。目前，测定植物内源物质的方法主要有生物鉴定法、免疫学方法、理化检测法、色谱法7-8和液质联用法9-11。由于植物内源激素性质不稳定，对外界环境条件敏感，容易受其他化合物的干扰。因此，液质联用法逐渐成为高效检测植物内源激素的首选方法。液质联用法不仅可以准确定量分析植物内源激素，同时具有样品处理简单、专一性强、灵敏度高、快速简便等特点，适用于复杂基质样品分析，在激素分析研究方面受到越来越多的关注12-14。本实验通过液相色谱串联三重四极杆质谱仪，建立快速准确检测黄芩中4种植物内源激素的分析方法，灵敏度高、专属性好。1实验1.1材料乙腈、甲醇（色谱纯，美国Merck公司），甲酸（色谱纯，ACS公司），超纯水（Miliq纯水仪自制），脱落酸（ABA，纯度98%）、赤霉素3（GA3，纯度90%）、吲哚乙酸（IAA，纯度 98%）、顺式玉米素（c-Zeatin，纯度98%）（上海源叶生物科技有限公司），黄芩植株（商洛天士力公司药源种植基地）。1.2仪器U3000超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），ZORBAX SB-C18 色谱柱（美国 Agilent 公司），Qtrap 6500+三重四极杆离子肼质谱仪（美国Sciex公司），百万分之一电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），Centrifuge 5427 R冷冻离心机、ThermoMixer C恒温混匀仪（德国eppendorf公司），氮吹仪（ANPEL公司）。1.3植物内源激素标准溶液的配制分别准确称取脱落酸、赤霉素 3、吲哚乙酸以及顺式玉米素标准品适量，用甲醇溶解并稀释成 0.5mg/mL的标准储备液，低温避光保存。取标准储备液逐级稀释制备成所需质量浓度的标准溶液。1.4黄芩样本的制备取黄芩的叶和块茎用清水冲洗干净，分别保存于液氮中冷冻干燥；在液氮环境下研磨成粉末；称取粉末 250 mg，加入 2.5 mL 提取溶剂 V（异丙醇）V（水）V（浓盐酸）=2 000 1 000 2，在4、100 r/min下振荡30 min，加入5 mL二氯甲烷，继续振荡30 min；在4、13 000 r/min下离心5 min，用巴斯德移液管吸取下层有机相至刻度管中，在避光条件下用氮吹仪浓缩至微量，用甲醇溶解并定容至 500 L，经 0.22m有机滤膜过滤后进样分析。1.5分析方法1.5.1色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm150.0mm3.5 m）；流动相：A为0.1%甲酸水，B为甲醇；梯度洗脱：01.0 min，20%流动相 B，1.03.0 min，20%50流动相 B，3.09.0 min，50%80流动相 B，9.010.5 min，80流动相 B，10.510.6 min，80%20流动相B，10.613.5 min，20流动相B；柱温：30；流速：0.6 mL/min；进样量：20 L；进样盘温度：4。1.5.2质谱条件离子源为ESI（），检测方式为多反应监测（MRM）方式。正离子质谱条件：喷雾电压4 500 V，离子源温度550，气帘气压力 35 psi，喷雾气压力50 psi，辅助气压力60 psi，驻留时间100 ms。负离子质谱条件：喷雾电压-4 500 V，离子源温度550，气帘气压力35 psi，喷雾气压力50 psi，辅助气压力60 psi，驻留时间100 ms。2结果与讨论2.1方法优化2.1.1质谱条件常用的质谱离子源有电喷雾离子源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），每种接口均有正负 2 种采521期集模式，实验优化了 2 种接口和相应的离子监测模式。研究发现，与 APCI离子源相比，4种植物内源激素在 ESI 离子源监测下电离效果好，峰信号响应较高15。由于ESI离子源对强极性或者中等极性的物质分析效果较好，通过分析4种植物内源激素的结构，可知其均有较强的极性，更适用于ESI离子源，与实验结果一致。在 ESI离子源下，优化正负 2种采集模式，通过比对发现，GA3和ABA在负离子模式下响应较高，c-Zeatin 和 IAA 在正离子模式下响应较高。依次优化碰撞电压（CE），得到 4种植物内源激素稳定的二级碎片，选定最强碎片作为定量离子，次强碎片作为定性离子，继续优化碰撞电压和去簇电压（DP），得到每个二级碎片的优化CE和DP，最终获得优化的质谱条件如表1所示。2.1.2色谱条件色谱柱、流动相种类和比例在色谱分离中起着非常重要的作用。Ma Z等16-17研究发现，以甲醇-水作为流动相，植物内源激素的分离效果不佳，因此，为了改善分离效果，需要加入合适浓度的甲酸，甲酸不仅可以调节流动相的pH，在色谱柱分离作用下，能够形成较窄对称的峰型，同时有益于植物内源激素在质谱条件下的电离，增强信号强度，提高灵敏度。通过实验确定了0.1%是优化的甲酸用量。同时考察了乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水和甲醇-乙腈-0.1%甲酸水体系，从毒性和经济效应角度考虑，优选甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，得到较窄对称的质谱峰如图1所示。分别考察了2种不同型号的色谱柱（Zorbax SB-C18 4.6 mm150.0 mm3.5 m；Agilent Poroshell 120EC-C18 4.6 mm150.0 mm4.0 m）对分离效果的影响，结果表明，在同样的梯度条件下，Zorbax SB-C18色谱柱的分离效果优于另一根色谱柱；优化了流速（0.50.7 mL/min）对分离效果的影响，结果表明，在0.6 mL/min时，4种植物内源激素都能实现良好的分离；同时优化色谱柱柱温，结果表明，30 时分离效果最好。为在最短时间内获得最好的分离效果，确定色谱柱为Zorbax SB-C18，流速0.6 mL/min，柱温30。2.2谱图分析植物内源激素 GA3 和 ABA 选择 ESI 负离子模式，得到相应的准分子离子峰 M-H-分别为 m/z=345.2、263.2，选择 M-H-作为母离子，在优化的 DP和CE电压下采用多反应监测扫描（MRM）模式进行二级质谱分析，结果见图2。注：*代表定量离子。植物内源激素GA3ABAc-ZeatinIAA离子模式-母离子/子离子345.2/143.1*345.2/239.1263.2/152.8*263.2/218.9220.0/202.2*220.0/148.0176.2/130.0*碰撞电压/eV-34-21-33-22291923去簇电压/eV-67-67-53-46232379表14种植物内源激素的质谱参数2bcda345678时间/min图1c-Zeatin（a）、IAA（b）、GA3（c）和ABA（d）的质谱图150100250200400300350m/za GA3150100250200400300350m/zb ABA200 ng/mL，CE 15 V智绪，等：高效液相色谱串联质谱法测定黄芩中的植物内源激素53印染助剂40卷GA3和ABA的断裂途径如下：推断 GA3 断裂后的稳定结构为 C16H31O（m/z=239.1）、C11H11（m/z=143.1），ABA断裂后的稳定结构为C9H13O2（m/z=152.8）、C14H19O2（m/z=218.9），GA3和ABA的断裂途径与文献 4，17 的解析过程相符。植物内源激素c-Zeatin和IAA选择ESI正离子模式，得到相应的准分子离子峰 M+H+分别为 m/z=220.0、176.2，选择 M+H+作为母离子，在优化DP和CE电压下采用MRM模式进行二级质谱分析，结果见图2。IAA和c-Zeatin的断裂途径如下：150100250200400300350m/zc c-Zeatin150100250200400300350m/zd IAA200 ng/mL，CE 10 V图24种植物内源激素的的二级质谱图-COOm/z=176.2IAAN HC O O Hm/z=130.0N HOOH OOO HH Om/z=345.2GA3OOOO HH Om/z=326.8-H2O-COOOO HH Om/z=283.1H Om/z=196.9m/z=178.9m/z=143.1-OH-CHCHCH3-CH2CHCH2OH OO HH Om/z=300.9H OO Hm/z=257.2H Om/z=239.1-COO-OHOOH OOO HH Om/z=345.2GA3-COO-COOH-C5H6m/z=218.9OO Hm/z=152.8OO Hm/z=263.2ABAOC O O HO HN HN NN HNO Hm/z=220.0c-ZeatinN HN NN HNm/z=202.2N NN HNNm/z=148.0-COH-C4H6541期推断c-Zeatin断裂后的稳定结构为C10H12N5（m/z=202.2）、C6H6N（m/z=148.0），IAA 断裂后的稳定结构为C9H10N（m/z=130.0），IAA的断裂途径与文献 17 涉及的解析过程相符。2.3定量限和检出限以检测信噪比S/N大于等于3时作为检出限，以信噪比S/N大于等于10时作为定量限。由表2可以看出，4种植物内源激素的检出限为0.1 ng/mL，定量限为0.5 ng/mL。2.4线性范围将混合标准溶液稀释成不同的质量浓度，以峰面积（y）为纵坐标、质量浓度（x）为横坐标制作标准曲线，对4种植物内源激素质量浓度进行线性回归。由表3可以看出，在0.5500.0 ng/mL内，4种植物内源激素的相关系数（R）为0.999 50.999 9，说明线性关系较好。2.5准确度取黄芩粉250 mg分别精确加入相应的混合标准溶液，然后制备供试溶液，然后进一步分析各提取液中IAA、GA3、ABA和c-Zeatin质量浓度，进而计算出种植物内源激素的加标回收率。由表4可以看出，IAA、ABA、GA3 以及 c-Zeatin 的回收率为 93.5%111.4%，而且RSD均小于10%，说明本方法的准确度比较好。2.6精密度将混合标准溶液稀释成含有 IAA、GA3、ABA 和c-Zeatin 各 50 ng/mL的溶液，重复测定 6次，计算峰面积的RSD值，考察仪器的精密度。由表5可知，IAA、GA3、ABA 和 c-Zeatin 的 RSD 值分别为 2.2%、3.9%、2.5%、1.8%，说明该方法能够满足精密度的要求。2.7黄芩叶和块茎中的植物内源激素在植物的不同器官中，代谢周转速率、相关受体和细胞对激素的通透性都会影响激素的含量。生长素IAA、GA3和c-Zeatin均属于生长促进剂，由表6可以看出，黄芩叶中的 IAA、GA3 和 c-Zeatin 质量分数均高于块茎中的质量分数，可能是因为这3种生长促进剂对块茎的发育比较敏感。黄芩叶中的ABA质量分数也高于块茎，这可能是因为块茎是储存器官，不需要参与大量的代谢活动。植物内源激素IAAGA3ABAc-Zeatin线性范围/（ngmL-1）0.5500.00.5500.00.5500.00.5500.0回归方程y=631.543 600 0 x-369.823 94y=9 094.780 820 0 x-4 422.057 65y=22 498.317 150 0 x-20 184.130 24y=3.864 571 5x+5 722.274 63相关系数R0.999 50.999 90.999 70.999 9表34种植物内源激素的线性方程和相关系数植物内源激素IAAGA3ABAc-Zeatin检出限/（ngmL-1）0.10.10.10.1定量限/（ngmL-1）0.50.50.50.5表24种植物内源激素的检出限和定量限植物内源激素IAAGA3ABAc-Zeatin平均峰面积2 810.13437 776.181 026 128.4318 801 385.18RSD/%2.23.92.51.8表54种植物内源激素的精密度智绪，等：高效液相色谱串联质谱法测定黄芩中的植物内源激素植物内源激素IAAGA3ABAc-Zeatin质量分数/（gg-1）叶片11.10.718.02.3叶片22.51.119.84.9叶片31.81.316.66.7块茎10.60.53.20.8块茎20.40.34.50.5块茎30.70.61.70.9表6黄芩叶和块茎中的4种植物内源激素表44种植物内源激素的准确度植物内源激素IAAGA3ABAc-Zeatin回收率/%0.5 ng/mL102.3104.1100.8111.41.0 ng/mL99.8107.694.4108.35.0 ng/mL94.3101.497.1105.220.0 ng/mL93.5102.6102.7105.3RSD/%5.12.68.84.055印染助剂40卷3结论建立了液相色谱串联质谱准确测定黄芩中IAA、GA3、ABA和c-Zeatin 4种植物内源激素的分析方法。采用MRM检测模式，以外标法定量，完成黄芩中4种植物内源激素的定量分析，准确度较高。该方法快速简单、灵敏度高、前处理效果好，适合黄芩中4种植物内源激素的快速分析。同时对黄芩不同器官中的植物内源激素质量分数进行分析，有益于研究植物内源激素对黄芩生长的影响，进而有益于探究施加外源激素来提高黄芩产量和质量的可行性。参考文献：1段娜,贾玉奎,徐军,等.植物内源激素研究进展J.中国农学通报,2015,31(2):159-165.2王丽萍,李志刚,谭乐和,等.植物内源激素研究进展J.安徽农业科学,2011(4):1912-1914.3王雅芳,李婷,唐正海,等.中药黄芩的化学成分及药理研究进展J.中华中医药学刊,2015(1):206-211.4卢巧梅,张兰,陈天文,等.液相色谱-串联质谱分析盐胁迫下植物激素的含量变化J.中国科学,2009,39(8):785-792.5谢景,马生军,王文全,等.产地土壤和种源因素对黄芩黄酮类成分含量的影响J.中医药信息,2015,32(2):8-11.6李良勇,崔国贤.营养胁迫下植物内源激素变化研究进展J.作物研究,2002(增刊1):240-244.7黄靖,刘艳芝,刘国伟,等.高效液相色谱法测定植物内源激素研究进展J.山东农业科学,2011(8):101-103.8杨婕,张日清,金晓玲.高效液相色谱法在木本植物内源激素含量检测中的应用J.经济林研究,2010,28(1):122-126.9曾婉俐,张建铎,许力,等.超高效液相色谱法快速测定烟草中的吲哚乙酸和吲哚丙酸J.分子植物育种,2019,17(6):2030-2034.10文静,孔维军,罗红梅,等.植物内源激素检测方法新进展J.中南药学,2014,12(1):47-52.11黄晓荣,张平治,吴新杰,等.植物内源激素测定方法研究进展J.中国农学通报,2009,25(11):84-87.12孙宽莹,陈彦.植物内源激素的分析方法J.湖北农业科学,2011,50(18):3681-3683.13孙震,任瑞,李增良,等.LC-MS-MS法测定葡萄中的脱落酸含量J.河北工业科技,2017(6):428-433.14侯升杰,朱江,丁明玉.液相色谱-电喷雾串联质谱法测定冬青芽中的脱落酸J.分析试验室,2009(3):96-98.15陈菲,陈丽璇,刘鸿洲,等.质谱技术在植物内源激素检测中的应用(综述)J.亚热带植物科学,2010(4):69-73.16MA Z,GE L Y,LEE A S,et al.Simultaneous analysis of differentclasses of phytohormones in coconut(Cocos nucifera L.)water usinghigh-performance liquid chromatography and liquid chromatography-tandem mass spectrometry after solid-phase extractionJ.Analytica Chimica Acta,2008,610(2):274-281.17HOU S J,ZHU J,DING M Y,et al.Simultaneous determination of gibberellic acid,indole-3-acetic acid and abscisic acid in wheat extracts by solid-phase extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometryJ.Talanta,2008,76(4):798-802.56