高铜通过转录水平上调LC3...癌HepG2细胞自噬的研究_张萌.pdf

实验研究/论著高铜通过转录水平上调L C 3表达诱导肝癌H epG 2细胞自噬的研究张萌,石萌,南欣睿,张杰,杜文倩,李超,刘宝琴中国医科大学生命科学学院,辽宁 沈阳1 1 0 1 2 2摘要:目的 探究微量元素铜对肝癌H e p G 2细胞自噬水平的影响,解析铜离子诱导肝癌自噬的分子机制。方法 0、1 0、5 0、1 0 0和2 0 0m o l/L硫酸铜(C u S O4)处理H e p G 2细胞2 4h,1 0 0m o l/LC u S O4处理H e p G 2细胞0、4、8、1 2、2 4h后检测自噬相关蛋白表达,蛋白质印迹法检测H e p G 2细胞内自噬分子标志物L C 3-/L C 3-和p 6 2,以及线粒体自噬标志分子P a r k i n表达;实时荧光定量P C R(q R T-P C R)检测L C 3和p 6 2mR NA表达,细胞计数试剂盒检测细胞活力。R F P-G F P荧光双标L C 3慢病毒系统感染H e p G 2细胞,C u S O4处理表达R F P-G F P-L C 3 B的H e p G 2细胞,共聚焦检测自噬流变化。结果 1 0、5 0、1 0 0、2 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞后,L C 3-/L C 3-比值呈剂量(F=65 1 9.0 0 0,P0.0 0 1)和时间依赖性升高(F=9 3 4.3 0 0,P0.0 0 1);p 6 2蛋白表达呈剂量(F=5 55 6 4.0 0 0,P0.0 0 1)和时间依赖性降低(F=1 14 1 3.0 0 0,P0.0 0 1)。共聚焦结果显示铜离子蓄积诱导H e p G 2细胞内自噬小体数目(t=3 0.0 4 0,P0.0 0 1)及自噬溶酶体数目(t=2 7 2.0 0 0,P0.0 0 1)均增加。1 0 0m o l/LC u S O4引起H e p G 2细胞中L C 3-/L C 3-比值增加(t=1 0 3.6 0 0,P0.0 0 1);p 6 2蛋白表达下降(t=1 4 6.6 0 0,P0.0 0 1),E B S S也引起p 6 2蛋白表达下降(t=1 4 6.0 0 0,P0.0 0 1);而对P a r k i n蛋白表达没有影响。1 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞2 4h后L C 3 mR NA表达上调,而E B S S饥饿处理则不影响L C 3 m R NA表达,F=3 0 2.4 0 0,P0.0 0 1;p 6 2mR NA表达均一定程度上调,F=6 1.7 5 0,P0.0 0 1。细胞计数实验结果表明1 0 0m o l/LC u S O4和E B S S饥饿均使细胞活力降低,F=1 1 1.7 0 0,P0.0 0 1。结论 高铜能够通过转录水平上调L C 3分子mR NA表达诱导肝癌H e p G 2细胞内自噬增强。关键词:肝癌;铜稳态;L C 3;自噬;p 6 2中图分类号:R 7 3 5.7 文献标识码:A 文章编号:1 6 7 3-5 2 6 9(2 0 2 2)2 4-1 7 3 4-0 7H i g hc o p p e r i n d u c e sa u t o p h a g yo fH e p G 2c e l l sb yu p-r e g u l a t i n gL C 3e x p r e s s i o na t t r a n s c r i p t i o n a l l e v e lZ HAN G M e n g,S H IM e n g,NANX i n-r u i,Z HAN GJ i e,D U W e n-q i a n,L IC h a o,L I UB a o-q i nS c h o o l o fL i f eS c i e n c e s,C h i n aM e d i c a lU n i v e r s i t y,S h e n y a n g1 1 0 1 2 2,C h i n aA b s t r a c t:O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h ee f f e c to f t r a c ee l e m e n tc o p p e ro na u t o p h a g yo fH e p G 2c e l l s,a n dt oe l u c i d a t et h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f c o p p e r-i n d u c e da u t o p h a g yo fH e p G 2c e l l s.M e t h o d s C o p p e r s u l f a t e(C u S O4)a t c o n c e n t r a t i o no f0,1 0,5 0,1 0 0a n d2 0 0m o l/Lw a su s e dt ot r e a tH e p G 2c e l l s f o r2 4h;a f t e r t h eH e p G 2c e l l sw e r e t r e a t e dw i t h1 0 0m o l/LC u S O4f o r 0,4,8,1 2a n d2 4h o u r s,t h e e x p r e s s i o no f a u t o p h a g y-r e l a t e dp r o t e i n sw a sd e t e c t e d.T h e e x p r e s s i o no f a u t o p h-a g ym o l e c u l a rm a r k e r sL C 3-/L C 3-a n dp 6 2i nH e p G 2c e l l sa n dt h ee x p r e s s i o no fm i t o c h o n d r i a la u t o p h a g ym a r k e rP a r k i nw e r ed e t e c t e db yw e s t e r nb l o t.T h ee x p r e s s i o no fL C 3 a n dp 6 2mR NA w a sd e t e c t e db yr e a l-t i m ef l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v eP C R(q R T-P C R),a n dt h ec e l l v i a b i l i t yw a sd e t e c t e db yc e l l c o u n t i n gk i t.H e p G 2c e l l sw e r e i n f e c t e db yR F P-G F Pf l u o r e s c e n td o u b l e l a b e l e dL C 3 l e n t i v i r u s s y s t e m.H e p G 2c e l l s e x p r e s s i n gR F P-G F P-L C 3 Bw e r e t r e a t e dw i t hC u S O4,a n da u t o p h a g i c f l o wc h a n g e sw e r ed e t e c t e db yc o n f o c a ld e t e c t i o n.R e s u l t s A f t e rt h eH e p G 2c e l l sw e r et r e a t e dw i t h1 0,5 0,1 0 0a n d2 0 0m o l/LC u S O4,t h eL C 3-/L C 3-r a t i oi n c r e a s e di nad o s e-d e p e n d e n tm a n n e r(F=6 5 1 9.0 0 0,P0.0 0 1)a n dt i m e-d e p e n d e n tm a n n e r(F=9 3 4.3 0 0,P0.0 0 1).T h ee x p r e s s i o no fp 6 2p r o t e i nd e c r e a s e d i nad o s e-d e p e n d-e n tm a n n e r(F=5 55 6 4.0 0 0,P0.0 0 1)a n dt i m e-d e p e n d e n tm a n n e r(F=1 14 1 3.0 0 0,P0.0 0 1).T h ec o n f o c a l r e s u l t ss h o w e dt h a t t h en u m b e ro f a u t o p h a g o s o m e s(t=3 0.0 4 0,P0.0 0 1)a n da u t o p h a g i c l y s o s o m e s(t=2 7 2.0 0 0,P0.0 0 1)i nH e p G 2c e l l si n d u c e db yc o p p e ri o na c c u m u l a t i o ni n c r e a s e d.C u S O4a tac o n c e n t r a t i o no f1 0 0m o l/Li n c r e a s e dt h eD O I:1 0.1 6 0 7 3/j.c n k i.c j c p t.2 0 2 2.2 4.0 3基金项目:国家自然科学基金(8 1 8 7 2 2 5 7);辽宁省自然科学基金(2 0 2 2-M S-1 9 9);省博士科研启动基金计划(2 0 2 0-B S-1 0 1)第一作者:张萌,女,天津人,硕士,主要从事铜离子稳态与肿瘤、基因表达调控等研究工作。E-m a i l:z m 0 9 0 91 2 6.c o m通信作者:刘宝琴,女,甘肃靖远人,博士,教授,主要从事铜离子稳态与肿瘤,基因表达调控等研究工作。E-m a i l:b q l i u c m u.e d u.c n4371张萌,等 高铜通过转录水平上调L C 3表达诱导肝癌H e p G 2细胞自噬的研究L C 3-/L C 3-r a t i o i nH e p G 2c e l l s(t=1 0 3.6 0 0,P0.0 0 1).T h e e x p r e s s i o no f p 6 2p r o t e i nd e c r e a s e d(t=1 4 6.6 0 0,P0.0 0 1),a n dE B S Sa l s oc a u s e dt h ed e c r e a s eo fp 6 2p r o t e i ne x p r e s s i o n(t=1 4 6.0 0 0,P0.0 0 1).I th a dn oe f f e c to nP a r k i np r o t e i ne x p r e s s i o n.A f t e r2 4h o u r so fe x p o s u r et o1 0 0m o l/LC u S O4,t h ee x p r e s s i o no fL C 3 mR NAi nH e p G 2c e l l sw a su p-r e g u l a t e d,w h i l eE B S Ss t a r v a t i o nd i dn o t a f f e c t t h e e x p r e s s i o no fL C 3 m R NA(F=3 0 2.4 0 0,P0.0 0 1).T h e e x-p r e s s i o no fp 6 2m R NAw a su p-r e g u l a t e dt oac e r t a i ne x t e n t(F=6 1.7 5 0,P0.0 0 1).T h e r e s u l t so f c e l l c o u n t e x p e r i m e n ts h o w e dt h a t 1 0 0m o l/LC u S O4a n dE B S Ss t a r v a t i o nr e d u c e dc e l lv i a b i l i t y(F=1 1 1.7 0 0,P0.0 0 1).C o n c l u s i o n H i g hc o p p e rc a n i n d u c ee n h a n c e da u t o p h a g y i nH e p G 2c e l l sb yu p-r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fL C 3 mR NAa t t h e t r a n s c r i p-t i o n a l l e v e l.K e y w o r d s:l i v e r c a n c e r;c o p p e rs t e a d ys t a t e;L C 3;a u t o p h a g y;p 6 2 金属元素铜是人体内不可或缺的必须微量元素之一,是超氧化物歧化酶(s u p e r o x i d ed i s m u t a s e,S O D)、铜蓝蛋白等关键代谢酶的辅助因子,参与细胞内生物氧化、铁代谢和神经递质合成等过程,对于机体正常生命活动具有非常重要的作用1。已有文献报道,铜含量在多种恶性肿瘤中均升高,包括实体瘤和血癌;且铜含量升高已被证明与癌症的进展直接相关,而铜离子螯合剂在动物及人体内均已被证实具有抑癌作用2-4。铜稳态的改变可能促进肿瘤的生长或侵袭性,甚至可能导致治疗抵抗;另外,研究表明,包括铜转运体1(c o p p e r t r a n s p o r t e r1,C T R 1)等在内的调控铜稳态的相关蛋白均与肿瘤发生发展、顺铂耐药有关5-6。铜离子通过门静脉进入肝脏,并通过C T R 1进入肝细胞,在肝内蓄积。虽然关于铜在肿瘤进程中的作用已经被广泛研究,然而高铜促进癌症以及铜代谢调控系统在肿瘤发生发展过程中的作用及具体分子机制并不清楚,同时铜离子在肝癌发生发展中作用机制也有待研究。有研究表明,铜离子是一种新型自噬诱导物,而自噬在肿瘤的发生发展过程中扮演重要角色7-8。本研究分析高铜是否能够诱导肝癌H e p G 2细胞自噬水平改变,探究其可能分子机制,以期为肝癌的发生发展以及铜离子稳态相关疾病提供数据。1 材料与方法1.1 细胞株和主要试剂及仪器人肝癌H e p G 2细 胞 购 自 上 海 中 科 院 细 胞 库。R PM I 1 6 4 0胎牛血清购自美国H y c l o n e生物公司,R F P-G F P荧光双标L C 3慢病毒系统(s t u b R F P-s e n s-G F P-L C 3L e n t i v i r u s)购 自 南 京 吉 凯 公 司,硫 酸 铜(c o p p e r m o n o s u l f a t ea n h y d r o u s,C u S O4)购 自 美 国S i g m a-A l d r i c h公司,E a r l e s平衡盐溶液(E a r l e sb a l-a n c e ds a l t s o l u t i o n,E B S S)购自美国H y c l o n e生物公司,GA P DH鼠单克隆抗体和L C 3鼠单克隆抗体购自美国C h e m i c o n公司,p 6 2鼠单克隆抗体和P a r k i n兔单克隆抗体购自美国B DB i o s c i e n c e公司,蛋白质印迹法化学发光液试剂盒购自北京全式金生物技术公司。L i g h t C y c l e r 4 8 0荧光定量P C R仪购自美国R o c h e公司,尼康C 2激 光共 聚 焦 显 微 镜 购 自 日 本N i k o n公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 将人肝癌H e p G 2细胞培养于体积分数为1 0%胎牛血清的R PM I1 6 4 0培 养 液 中,3 7、体积分数为5%C O2培养,收集对数生长期细胞进行实验。1.2.2 C u S O4处理细胞 为明确0、1 0、5 0、1 0 0和2 0 0m o l/LC u S O4对H e p G 2细胞内自噬的诱导作用,不同浓度C u S O4分别作用H e p G 2细胞8h(或2 4h)后,提取细胞总R NA(或总蛋白),进行荧光实时定量P C R实验(或蛋白质印迹实验);为明确C u S O4对H e p G 2细胞自噬的影响,1 0 0m o l/L的C u S O4作用H e p G 2细胞不同时间(0、4、8、1 2和2 4h)后提取细胞总R NA(或总蛋白),进行荧光实时定量P C R实验(或蛋白质印迹实验)。1.2.3 荧光实时定量P C R 高铜与E B S S诱导自噬实验分为对照组、1 0 0m o l/LC u S O4处理组和E B S S4h处理组。收集各组细胞,按照说明书操作提取细胞总R N A,使用多功能酶标仪检测总R N A浓度。逆转录用双标记荧光探针混合物在A B IP r i s m7 5 0 0自动序列分析系统(A p p l i e dB i o s y s t e m s,W a r r i n g t o n,U K)中进行实时P C R分析,每组重复3次。L C 3 上游引物序列为5 -A G T T C C T T G T A C C T G A C C A T G T C-3,下游引物序列为5 -A T A C A C C T C T G A G A T T G G T G T G G-3。p 6 2上游 引 物 序 列 为5 -T G A G G A A C A G A T G G A G T C G G A-T A-3,下 游 引 物 序 列 为5 -C A T C T G T A G G G A C T G-G A G T T C A C G-3。G A P D H上游引物序列为5 -A A G-G T C A T C C C T G A G C T G A G C T G-3,下游引物序列为5 -C C A G G A A A T G A G C T T G A C A A A G T G-3。结 果 用G A P D H进行标化。1.2.4 蛋白质印迹实验 剂量依赖实验分为对照组,1 0、5 0、1 0 0、2 0 0m o l/LC u S O4处理组,时间依赖实验分为对照组,4、8、1 2、2 4h处理组,高铜与E B S S诱导自噬实验分为对照组、1 0 0m o l/LC u S O4处理组、E B S S4h处理组。收集各组细胞,用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(2 0mm o l/LT r i s-HC l;1 5 0mm o l/LN a C l;2 mm o l/L E D T A;体积 分 数 为1%T r i t o nX-1 0 0)裂解破碎离心后,用考马斯亮蓝蛋白分析试剂盒5371中华肿瘤防治杂志2 0 2 2年1 2月第2 9卷第2 4期 C H I NJC AN C E RP R E VT R E A T,D e c e m b e r2 0 2 2,V o l.2 9 N o.2 4对上清蛋白进行定量。用体积分数为1 0%S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳和湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上,以5%脱脂奶粉T B S T封闭后,依次进行L C 3(110 0 0)、p 6 2(110 0 0)、P a r k i n(110 0 0)、GA P DH(150 0 0)等抗体4孵育过夜,辣根过氧化物酶标记的二抗(150 0 0)室温孵育1h,进行E C L化学发光显像。以鼠抗人GA P DH单克隆抗体作为内参。1.2.5 R F P-G F P-L C 3稳定过表达H e p G 2细胞系的建立 按照吉凯基因慢病毒感染操作手册说明进行实验,应用R F P-G F P荧光双标L C 3慢病毒系统感染H e p G 2细胞,抗生素筛选后获得稳定细胞系。1.2.6 共聚焦荧光显微成像 高铜与E B S S诱导自噬实验分为对照组、1 0 0m o l/LC u S O42 4h处理组和E B S S4h处理组。C u S O4或者E B S S处理稳定过表达R F P-G F P-L C 3的H e p G 2细胞系,共聚焦荧光显微镜下观察细胞内自噬体(绿色点簇状)和自噬溶酶体(红色点簇状),随机选择视野观察、拍照。1.2.7 细胞计数实验 高铜与E B S S诱导自噬实验分为对照组、1 0 0m o l/LC u S O4处理组和E B S S4h处理组。将细胞置于9 6孔板中,C u S O4或者E B S S处理,按照说明书进行实验,每组重复加入活性检测试剂,于培养箱中培养至颜色变为橙色,酶标仪测光密度D值(4 5 0n m)。1.3 统计学方法应用G r a p h P a dP r i s m9.0对数据进行统计学分析。采用S h a p i r o-W i l k(S-W)方法对数值进行正态分布检验,符合正态分布以x-s表示,2独立组间均值比较采用t检验,多组间均值比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用双因素方差分析;如果不符合正态分布,采用对应的非参数检验方法。检验水准=0.0 5(双尾)。2 结 果2.1 不同时间和剂量C u S O4诱导肝癌H e p G 2细胞自噬对相关蛋白表达影响蛋白质印迹结果显示,与对照组相比,1 0、5 0、1 0 0和2 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞后,L C 3-/L C 3-比值呈剂量(F=65 1 9.0 0 0,P0.0 0 1)和时间依赖性升高(F=9 3 4.3 0 0,P0.0 0 1);p 6 2蛋白表达呈剂量(F=5 55 6 4.0 0 0,P0.0 0 1)和时间依赖性降低(F=1 14 1 3.0 0 0,P0.0 0 1),表明高铜能够诱导肝癌H e p G 2细胞内自噬增强。见图1和图2。2.2 高铜诱导稳定过表达肝癌细胞自噬对相关蛋白表达影响自噬流监测系统R F P-G F P荧光双标L C 3慢病毒系统感染H e p G 2细胞之后与对照组相比,H e p G 2细胞内绿色点簇状(代表自噬体)数目(t=3 0.0 4 0,P0.0 0 1)与红色点簇状(代表自噬溶酶体)数目均增加(t=2 7 2.0 0 0,P0.0 0 1),表明高铜与E B S S饥饿均能诱导肝癌H e p G 2细胞自噬增强。见图3。图1 不同剂量C u S O4作用H e p G 2细胞2 4h后相关蛋白表达F i g.1 E x p r e s s i o no f r e l a t e dp r o t e i n s i nH e p G 2c e l l s t r e a t e dw i t hd i f f e r e n td o s e so fC u S O4f o r2 4h o u r s图2 1 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞不同时间后相关蛋白表达F i g.2 E x p r e s s i o no f r e l a t e dp r o t e i n s i nH e p G 2c e l l s t r e a t e dw i t h1 0 0m o l/LC u S O4a td i f f e r e n t t i m e 蛋白质印迹结果显示,与E B S S培养诱导自噬不同,高铜诱导H e p G 2细胞中L C 3-/L C 3-比例增加,t=1 0 3.6 0 0,P0.0 0 1。同时,高铜引起自噬底物p 6 2蛋白表达下降(t=1 4 6.6 0 0,P0.0 0 1),E B S S也引起自噬底物p 6 2蛋白表达下降(t=1 4 6.0 0 0,P0.0 0 1);而对P a r k i n蛋白表达没有影响。见图4。6371张萌,等 高铜通过转录水平上调L C 3表达诱导肝癌H e p G 2细胞自噬的研究图3 1 0 0m o l/LC u S O4作用稳定过表达H e p G 2细胞2 4h后细胞内自噬流变化(6 0 0)F i g.3 C h a n g e so f a u t o p h a g yf l o wi nH e p G 2c e l l ss t a b l yo v e r e x p r e s s e dw i t h1 0 0m o l/LC u S O4f o r2 4h(6 0 0)图4 1 0 0m o l/LC u S O4作用稳定过表达H e p G 2细胞2 4h后相关蛋白表达F i g.4 E x p r e s s i o no f r e l a t e dp r o t e i n s i nH e p G 2c e l l ss t a b l yo v e r e x p r e s s e db y1 0 0m o l/LC u S O4f o r2 4h o u r s2.3 高铜在转录水平对自噬标志分子L C 3表达影响1 0 0m o l/L C u S O4作 用H e p G 2细 胞2 4h后L C 3 mR NA表达上调,而E B S S饥饿处理则不影响L C 3 mR NA表达,F=3 0 2.4 0 0,P0.0 0 1;p 6 2mR-NA表达均一定程度上调,F=6 1.7 5 0,P0.0 0 1,对照组与1 0 0m o l/LC u S O4处理组和E B S S4h处理组比较,均P0.0 0 1,表明C u S O4能够在转录水平上调自噬关键分子L C 3表达,诱导肝癌H e p G 2细胞内自噬增强。见图5。2.4 高铜和E B S S饥饿对细胞活力影响与对照组相比,1 0 0m o l/LC u S O4处理组、E B S S4h处理组均能导致细胞代谢活力降低,F=1 1 1.7 0 0,P0.0 0 1,提示高铜和E B S S饥饿诱导的细胞自噬与细胞死亡情况一致。见图6。7371中华肿瘤防治杂志2 0 2 2年1 2月第2 9卷第2 4期 C H I NJC AN C E RP R E VT R E A T,D e c e m b e r2 0 2 2,V o l.2 9 N o.2 4注:A.L C 3 B m RNA表达;B.p 6 2m RNA表达。图5 1 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞2 4h后L C 3 B和p 6 2m R NA表达F i g.5 E x p r e s s i o no fL C 3 Ba n dp 6 2m R NAi nH e p G 2c e l l s t r e a t e dw i t h1 0 0m o l/LC u S O4.f o r2 4h图6 1 0 0m o l/LC u S O4作用H e p G 2细胞2 4h后细胞活力F i g.6 C e l l v i a b i l i t yo fH e p G 2c e l l s t r e a t e dw i t h1 0 0m o l/LC u S O4f o r2 4h3 讨 论在人体内,铜以氧化态C u()和还原态C u()两种状态存在。在细胞外,铜以C u()态存在,在细胞内还原环境中,主要以C u()存在。然而,在氧化还原酶中,C u在C u()和C u()之间穿梭。铜独特的电子结构使其能够作为酶的氧化还原反应的辅助因子,这些酶执行正常生长和发育所需的基本生物功能;铜转运系统对于维持体内铜的平衡和保证各组织的正常功能起到关键作用9-1 0。哺乳动物肠上皮细胞通过C T R 1从食物中摄取铜离子。摄入后,铜离子被输送到铜转运P型AT P酶(c o p p e r-t r a n s p o r t i n g AT P a s e p o l y p e p t i d e,AT P 7 A),AT P 7 A将肠细胞中的铜离子泵入血液1 1。铜离子通过门静脉进入肝脏,并通过C T R 1进入肝细胞1 2。铜稳 态 的 维 持 主 要 需 要:(1)铜 转 运 蛋 白。C T R 1主要负责铜的摄入,二价金属转运体1(d i v a l e n tm e t a l t r a n s p o r t e r1,DMT 1)能够转运包括铜离子在内的多种二价金属离子,铜转运三磷酸腺苷酶肽/肽(AT P 7 A/AT P 7 B)主要负责把铜泵出胞外。(2)铜伴侣蛋白,包括抗氧化蛋白1(a n t i o x i d a n t1c o p p e rc h a p e r o n e,AT O X 1)、细 胞 色 素C氧 化 酶1 7(c y t o-c h r o m eCo x i d a s e,C O X 1 7)和超氧化物歧化酶铜伴侣蛋 白(c o p p e rc h a p e r o n ef o rs u p e r o x i d ed i s m u t a s e,C C S)等1 3-1 4。保持机体内铜相关代谢平衡,维持机体内环境铜含量的稳定非常重要,C O X是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分;该复合体包含2个铜中心(C u A和C u B),在电子传递、氧化磷酸化产能过程中发挥重要作用1 5。但是过量和缺乏铜离子都是有害的,铜的失衡可能导致各种疾病1 6-1 8。M e n k e s病(M a n k e sd i s e a s e,MD)是一种罕见的先天性铜代谢8371张萌,等 高铜通过转录水平上调L C 3表达诱导肝癌H e p G 2细胞自噬的研究异常疾病,以严重的全身性铜缺乏为特征;而W i l s o n病(W i l s o nD i s e a s e,WD)又称为肝豆状核变性(h e p a-t o l e n t i c u l a rd e g e n e r a t i o n,HL D),主要表现为肝脏核脑内铜蓄积1 9-2 0。目前已经明确铜代谢紊乱在肿瘤进程中发挥重要作用,靶向铜代谢及其体内铜调控机制的相关研究已成为肿瘤生物学研究的重要方向4-5,2 1-2 2。本研究探讨铜离子作用肝癌细胞H e p G 2后,对细胞自噬的影响,结果显示,细胞内自噬降解底物蛋白p 6 2表达降低,自噬标志分子L C 3-/比值增加,说明铜离子引起细胞发生自噬,线粒体自噬标志分子P a r k i n未检测到蛋白水平的表达变化,则铜离子并不引起肝癌细胞线粒体自噬。共聚焦结果显示,铜离子蓄积诱导H e p G 2细胞内自噬流发生变化,与E B S S饥饿诱导的自噬流变化一致。临床研究发现,癌症患者血浆中铜离子的浓度与肿瘤恶化程度以及药物治疗的反应相关2 3。铜代谢紊乱通过活化肿瘤增殖相关信号通路、调控肿瘤微血管生成、重塑基质和炎症微环境等促进肿瘤发生发展,而使用铜离子载体和铜螯合剂减少体内铜离子的含量可以显著减缓肿瘤的血管生成,抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞增殖,具有较好的临床应用前景2-4,2 4。因此铜离子蓄积诱导自噬的分子机制及在肿瘤发生发展中的作用值得探索。上述结果表明,高铜引起的自噬与E B S S饥饿诱导的自噬在表达水平上存在差异,而P C R结果表明高铜能够在转录水平上调自噬,E B S S饥饿不影响转录水平上自噬的表达,细胞计数实验结果表明高铜和E B S S饥饿均使细胞死亡。正常机体内,为防止铜离子过载等带来的细胞毒性和脏器损伤,机体的主动稳态机制会控制细胞内铜离子浓度稳定在极低水平。继“铁死亡”之后,麻省理工学院和哈佛大学B r o a d研究所的P e t e rT s v e t k o v和T o d dR.G o l u b团队将铜离子载体诱导的新型细胞死亡途径定义为铜死亡,提示未来铜代谢相关研究定会进入一个新的高度2 5。自噬是一种进化上保守的循环过程,其主要功能是清除衰老或受损的细胞器,维持基础能量平衡,是机体内非常重要的质量控制体系。而细胞自噬对肿瘤发挥双刃剑作用,在肿瘤的早期生长阶段自噬起着抑癌作用;而随着肿瘤的生长,肿瘤细胞通过多种方式利用细胞自噬,应对营养缺乏和低氧等。有研究表明,铜离子是一种新型自噬诱导物,然而关于铜离子蓄积诱导自噬的分子机制及在肿瘤发生发展中的作用尚未阐明2 6-3 2。未来将进一步致力于解析高铜诱导自噬在肝癌发生发展中的作用及更为广泛的分子机制;明确高铜在转录水平上调L C 3表达的分子机制等,为靶向铜代谢的肿瘤治疗提供科学数据。利益冲突 无参考文献1 T o s c a n oC M,F i l e t t i F M,A l m e n a r aC C P,e t a l C o p p e r e x p o s u r e f o r 3 0d a y s a t ad a i l yd o s e t w i c e t h er e c o mm e n d e d i n c r e a s e sb l o o dp r e s s u r ea n dc a r d i a c c o n t r a c t i l i t yJ.L i f eS c i,2 0 2 2,3 0 0:1 2 0 5 7 9.2 I s h i d aS,A n d r e u xP,P o i t r y-Y a m a t eC,e ta l.B i o a v a i l a b l ec o p p e rm o d u l a t e so x i d a t i v ep h o s p h o r y l a t i o na n dg r o w t ho ft u m o r sJ.P r o cN a t lA c a dS c iUSA,2 0 1 3,1 1 0(4 8):1 9 5 0 7-1 9 5 1 2.3 T s a n gT,P o s i m oJ M,G u d i e lAA,e ta l.C o p p e ri sa ne s s e n t i a lr e g u l a t o ro f t h e a u t o p h a g i ck i n a s e sU L K 1/2 t od r i v e l u n ga d e n o-c a r c i n o m aJ.N a tC e l lB i o l,2 0 2 0,2 2(4):4 1 2-4 2 4.4 B e n g u i g u iM,W e i t z I S,T i m a n e rM,e ta l.C o p p e ro x i d en a n o p a r-t i c l e si n h i b i tp a n c r e a t i ct u m o rg r o w t h p r i m a r i l y b yt a r g e t i n gt u m o r i n i t i a t i n gc e l l sJ.S c iR e p,2 0 1 9,9(1):1 2 6 1 3.5 K u oMT,H u a n gY F,C h o uC Y,e t a l.T a r g e t i n g t h e c o