基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱.pdf

第44卷第5期2023年9月质谱学报Journal of Chinese Mass Spectrometry SocietyVol.44No.5Sep.2023基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱付亚宁1,2，崔利利1.2，于捧捧1.2,陈韩书磊1-2,侯宏卫1-2，胡清源1.2（1.国家烟草质量监督检验中心，河南郑州450 0 0 1;2.烟草生物学效应重点实验室，河南郑州450 0 0 1）东欢12，摘要：天然烟碱和合成烟碱的生物合成和化学合成过程不同，其同位素分馏也不同。本研究利用这一特性开发了一种基于同位素模式峰的串联质谱方法，通过对比烟碱的M+H+和M+H+1+峰的丰度和面积比，以及M十H+和M+H+1+峰作为母离子产生的碎片峰丰度比来验证烟碱的来源。结果表明，天然烟碱与合成烟碱的MS谱图中m/164.1、16 3.1峰的丰度比和面积比，以及MS/MS谱图中m/163.1、16 4.1碎片离子的丰度比均具有显著性差异。在具有显著性差异的变量中，合成烟碱的总体丰度比高于天然烟碱。同时，结合化学计量学方法进一步构建鉴别天然烟碱与合成烟碱的评价模型。在OPLS-DA模型中，16 4.1-8 5.1/8 4.1、16 4.1-8 5.1/(8 4.1+8 5.1）、16 3.1-131.1/131.1、16 3.1-131.1/（130.1+131.1)为筛选出来的天然烟碱与合成烟碱鉴别的主要变量，准确度达97.8 7%。该方法具有操作简单、快速、无需定量等特点，有助于市场上不同来源烟碱烟草制品的准确识别、标签和监管。关键词：合成烟碱；同位素；串联质谱；鉴别中图分类号：0 6 57.6 3doi;10.7538/zpxb.2022.0187Identification of Natural Nicotine and Synthetic Nicotineby Tandem Mass Spectrometry Based on Isotope Pattern PeaksFU Ya-ning*,CUI Li-lil-,YU Peng-peng*,CHEN Huan2,HAN Shu-leil-,HOU Hong-weil-,HU Qing-yuan-(l.National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center,Zhengzhou 45000l,China;2.Key Laboratory of Biological Ef fects of Tobacco,Zhengzhou 450o01,China)Abstract:“Tobacco-free or synthetic nicotine products have been favored by the major-ity of young people,which undoubtedly increase the potential health risks and regulato-ry challenges.Currently,there are few reliable methods for the determination ofauthenticity of natural nicotine and synthetic nicotine.The analytical techniques basedon mass spectrometry have broad application prospects in component sequence analysis,structure analysis,molecular weight determination and component content determina-tion.The synthesis processes of natural nicotine and synthetic nicotine are different,文献标志码：A文章编号：10 0 4-2 997（2 0 2 3)0 5-0 7 14-0 7国家烟草质量监督检验中心科技创新项目（552 0 18 CA0070）本文通信作者侯宏卫，胡清源第5期and their isotopic fractionations are also different.Here,a method of tandem mass spec-trometry based on isotope model peak was developed using this feature.The source ornaturalness of nicotine is verified by comparing the abundance and area ratio of M+HJ+and M+H+1J+peaks of nicotine,and the abundance ratio of M+HJ+andM+H+1+peaks as fragments of parent ions.A total of 47 experimental resultsshowed that the m/z 164.1,163.1 peak abundance ratios and the area ratios of naturalnicotine and synthetic nicotine in MS spectra were significantly different.In addition,inMS/MS spectra,the abundance ratios of fragment ions of m/z 163.1,164.1 also hadsignificant differences.Among the variables with significant differences,the overallabundance ratio of synthetic nicotine was higher than that of natural nicotine.The eval-uation model for the identification of natural nicotine and synthetic nicotine was furtherconstructed by combining chemometric methods.Using OPLS-DA modeling,the dis-criminant accuracy was 97.87%.Moreover,rankings of importance of variables differeddepending on the model of the evaluation.164.1-85.1/84.1,164.1-85.1/(84.1+85.1),163.1-131.1/131.1,163.1-131.1/(130.1+131.1)were the key discriminant variables.This method has the advantages of simple operation,rapid operation and no need forquantitative analysis,which will help to accurately identify,label and supervise tobaccoproducts from different nicotine sources on the market.Key words:synthetic nicotine;isotopes;tandem mass spectrometry;authentication烟碱是烟草制品的重要化学成分，其含量高低与烟草制品的品质和口感密切相关11。天然烟碱（99%（S)-（一)-烟碱）主要来源于烟草植物，例如，烤烟和卷烟2-3。随着烟碱有机合成技术的不断发展，含有合成烟碱的新型烟草制品成为传统烟草产品的替代品。合成电子烟一经问世，便受到欢迎，其销售额占美国一次性电子烟市场份额的51.3%41。与天然烟碱不同，合成烟碱含有等量的2 种立体异构体(R，S-（土）-烟碱），其主要通过化学合成得到5-6 。然而，合成烟碱对人类健康和成瘾方面的影响尚无定论。由于合成烟碱非来源于烟草植物，这给烟草制品的监督管理带来了极大的挑战。因此，迫切需要开发一种可靠的方法来识别天然烟碱与合成烟碱。目前,基于手性柱的液相色谱-质谱分析是较常用的烟碱鉴定方法9-10 1，然而，高纯度合成(S)-（一)-烟碱的出现给该方法提出了挑战。近年来，稳定同位素比值技术在鉴定人工合成和天然提取的牛磺酸1、咖啡因12 、麻黄碱13中发挥着重要作用。此外,Hu等141基于核磁共振氢谱的位点特异性峰强度比（site-specificpeak intensityratio，SPI R)技术研究了天然烟付亚宁等：基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱715碱与合成烟碱的不同。但上述2 种方法均要求操作者具备较丰富的专业知识，且实验过程复杂、成本高。由于这2 种方法均利用了天然与合成产品中同位素分馏不同的原理，因此可借助高分辨质谱的串联技术监测化合物的同位素分馏情况15。化学计量统计分析对于数据的解释和未知来源样品的分类模型构建非常重要16 。典型的化学计量学数据分析包括：无监督的主成分分析(principal component analysis,PCA)17),层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA)；以及有监督的线性判别分析（lineardiscriminant analysis，L D A)、偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogonalpartial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)等18 。与 PLS-DA 相比,OPLS-DA可以滤除与分类信号无关的噪声，提高模型的分析能力和有效性。本研究拟通过开发基于同位素模式峰的串联质谱技术，结合化学计量学分析手段鉴定天然烟碱与合成烟碱，为实现市场上合成烟碱烟草产品的准确识别、标签和监管提供技术参考。7161实验部分1.1主要仪器与装置ImpactII超高分辨四极杆-飞行时间串联质谱仪（高于50 0 0 0 的全灵敏度分辨率）：德国Bruker公司产品；Ultimate3000液相色谱仪：美国ThermoFisher公司产品。1.2主要材料与试剂甲酸铵、甲酸：均为色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；乙腈（色谱纯）：德国Merck公司产品；实验用水：由Milli-Q超纯水制备系统（美国Millipore公司产品）制得。从8 种传统卷烟样本、8 种加热卷烟样本、6种电子烟样本中提取天然烟碱。合成烟碱来源：TRC（加拿大）公司购买的R-烟碱、R，S-（土）-烟碱及6 种不同合成路径的S-烟碱，共8种。另外通过8 种烟碱的部分烟碱进行1：1混合制得17 种合成烟碱。具体为R-烟碱与6种S-烟碱混合，制得6 种烟碱;R,S-（土）-烟碱与6 种S-烟碱混合，制得6 种烟碱，1号S-烟碱样本与另外5种S-烟碱样本混合，制得5种烟碱。共计2 5种合成烟碱样本。1.3实验条件1.3.1样品制备准确称取0.0 1g（精确至0.0001g)天然烟草制品，加入50 mL水，于30超声萃取2 0 min，静置过夜，取适量的萃取液过0.2 2 m水系滤膜，待测。用水将上述合成烟碱纯品稀释至2 0 mg/L，进样分析。1.3.2?色谱条件ACQUITY UPLC CSHC18 色谱柱(2.1 mmX100 mmX1.7 m),柱温40；流动相：A为含10 mmol/L甲酸铵，pH3.5的水溶液，B为纯乙腈；流速0.4mL/min，在100a质谱学报第44卷70%B条件下等度洗脱7 min;进样体积2 L。1.3.3质谱条件电喷雾（ESI)离子源，正离子模式；碰撞气体为氩气；毛细管电压一4.5kV；雾化气压强18 0 kPa；干燥气温度2 2 0；质谱内标为甲酸钠溶液，m/z50130.10；分别对烟碱m/z163.1、16 4.1进行MS/MS碎裂分析,碰撞能量(CID)10 eV。1.4数据处理使用DataAnalysis4.0软件进行数据分析，计算m/163.1、16 4.1的丰度比和峰面积比，以及烟碱m/163.1、16 4.1的二级碎片离子（m/84.1、8 5.1、130.1、131.1）丰度比。使用保留时间1.8 2.1min的平均丰度和士0.5u的质量窗口，计算丰度比和峰面积比。将数据分别导入SPSS23.0和SIMCA14.0软件进行单变量和多变量分析。2结果与讨论2.1天天然烟碱与合成烟碱的结果烟碱（C1oHi4N2，相对分子质量16 2.1）在电喷雾离子源中会产生质子化离子m/163.1M+H+和m/z164.1M+H+1+。在二级质谱碎裂中，母离子m/z163.1产生m/z84.1、130.1碎片离子，mz164.1产生m/z85.1、131.1碎片离子，示于图1。本研究分别对天然烟碱与合成烟碱样本进行MS和MS/MS分析，碎片离子峰的丰度比列于表1。在MS谱图中，整理收集m/164.1与m/163.1峰的丰度比（FD164.1/163.1）、面积比（MJ164.1/163.1）以及m/z164.1与总和峰的丰度比（FD164.1/（16 3.1十100b130.0521131.05925050Fig.1 MS/MS spectra of m/z 163.1(a),164.1(b)protonated nicotine parent ions5084.0733163.1059100150m/z图1质子化烟碱母离子m/z.163.1(a)、16 4.1(b)的MS/MS谱图164.109185.075720050100150m/z200第5期Table 1 Abundance ratios of each fragment ion peaks of natural nicotine and synthetic nicotine samplesm/Abundance ratio164.1/163.1164.1/163.1面积比164.1/(163.1+164.1)164.1/(163.1+164.1)面积比163.185.1/84.185.1/(84.1+85.1)131.1/130.1131.1/(130.1+131.1)164.185.1/84.185.1/(84.1+85.1)131.1/130.1131.1/(130.1+131.1)付亚宁等：基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱表1天然烟碱和合成烟碱样本各碎片离子峰的丰度比天然烟碱Natural nicotine/%(n=22)丰度比平均值标准差最大值最小值平均值标准差最大值最小值PvalueMeanSD10.361.0010.220.349.380.849.270.282.730.302.650.284.910.474.680.4379.462.4344.270.76324.0325.7576.351.23717合成烟碱Synthetic nicotine/%（n=2 5)P值MaxMin6.7110.859.2210.816.299.798.449.751.822.981.792.894.055.393.895.1174.2883.1742.6245.41297.89427.7274.8781.05Mean10.9510.509.879.502.872.795.315.0576.7443.42316.6975.97SD0.070.240.060.200.100.090.120.100.970.3116.270.91Max10.7910.059.749.132.652.585.114.8674.2742.62295.0774.69Min11.0510.849.959.783.032.945.555.2678.8744.09350.7577.810.0050.0020.0060.0020.0330.0340.0000.0000.0000.0000.2430.233164.1)）、面积比（MJ164.1/（16 3.1+16 4.1)）。在母离子为m/z163.1的MS/MS谱图中，选择m/z85.1与m/84.1峰的丰度比（16 3.1-85.1/84.1）、m/z 8 5.1与总和峰的丰度比（16 3.1-85.1/(84.1+85.1)以及m/z131.1与m/130.1峰的丰度比（16 3.1-131.1/130.1）、m/131.1与总和峰的丰度比（16 3.1-131.1/（130.1十131.1)）作为考察对象。同样，在母离子为m/z164.1的MS/MS谱图中，考察了m/z85.1与m/84.1峰的丰度比（16 4.1-8 5.1/8 4.1）、m/z85.1与总和峰的丰度比（16 4.1-8 5.1/（8 4.1十85.1)以及m/131.1与m/130.1峰的丰度比（16 4.1-131.1/130.1）、m/131.1与总和峰的丰度比(16 4.1-131.1/(130.1十131.1)）。在上述12 个变量中，通过对2 2 种天然烟碱样本和2 5种合成烟碱样本进行单变量分析，除m/164.1在MS/MS碎裂下131.1/130.1和131.1/(130.1+131.1)无显著性差异(P0.05)外，其余10 个变量对天然烟碱与合成烟碱鉴定的影响较大，可以发现合成烟碱的整体丰度比高于天然烟碱。2.2天然烟碱与合成烟碱的同位素分馏差异天然烟碱与合成烟碱的同位素分馏差异可以追溯到烟碱的合成过程不同。烟碱由1个五元吡咯烷环和1个六元吡啶环组成。天然烟碱的吡啶环由天冬氨酸和3-磷酸甘油醛生物合成，吡咯烷环来自鸟氨酸或精氨酸的氨基酸,N-甲基部分来自S-腺苷甲硫氨酸1-2 0 。自190 4年以来，不同的化学合成方法被报道2 1-2 2。不同的起始反应物或合成途径会导致不同的同位素比值。此外，动力学和平衡同位素分馏也影响同位素比值。一般来说，生物过程更易受“动力学”同位素分馏的影响。因为“能源成本”较低，生物体优先使用较轻的同位素物种2 3。相反，对于化学合成，平衡同位素分馏是在化学平衡的2 种或多种物质之间分配同位素。大多数平衡分馏被认为是由于当较重的同位素取代较轻的同位素时，振动能量（尤其是零点能量)降低，导致在振动能量对同位素取代最敏感的物质中较重同位素的浓度更高2 41。动力学和平衡同位素分馏的不同机制可以解释合成烟碱的丰度比通常略高于天然烟碱。2.3天然烟碱与合成烟碱鉴别OPLS-DA模型的构建与评价为了评估基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱的可行性，本研究结合化学计量学方法构建OPLS-DA模型，示于图2。该模型中,RX和RY分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q表示模型的预测能力。理论上，R和Q越接近1.0，表明模型越好，二者值越低则说明模型的拟合准确性718116011Josd*90E1L60-0.1-0.3F-0.6H-0.5图2 天然烟碱与合成烟碱鉴定OPLS-DA模型的得分图(a)和载荷图(b)Fig.2 Score chart(a)and load chart(b)of OPLS-DA model for natural nicotine and synthetic nicotine越差。通常情况下，R和Q高于0.5（50%)表明模型较好，高于0.4即可接受，且两者差值不应过大2 4。由图2 a可知，模型中RX=0.418,R=0.813,Q=0.758,其中,RX表示该模型能反映41.8%数据的变化,R和Q接近1.0 表明该模型具有良好的可解释度和拟合度。天然烟碱与合成烟碱样品在OPLS-DA得分散点图上的聚类良好，组内差异小，可以实现不同组间样品的完全分离。从图2 b可以看出，变量16 4.1-8 5.1/8 4.1和16 4.1-8 5.1/(8 4.1+85.1)可以代表天然烟碱样本，变量16 3.1-131.1/131.1和16 3.1-131.1/(130.1十131.1）代表合成烟碱样本。该模型的总预测准确率为97.87%，天然烟碱预测准确率为95.45%，仅将1个样本误判为合成烟碱，合成烟碱样本预测准确率为10 0%。为进一步验证该判别模型的可预测性，进行了2 0 0 次模型置换交叉检验。置换检验的R=0.045,Q=一0.30 2,表明该模型不存在过拟合现象R0.5,Q0)，具有统计学意义。质谱学报第44卷a1N18ON052iNO5ON17N14ON04ON12ON08ON060NO9OON03ON22ON20N100N19S21S00.S19520S09-2S24S25S22S23ONO7-4ONiiON21-6H-2-5-4R2X1=0.23R2Xo1=0.187b0.3164.1-85.1/84.1164.1-85.1/(85.1+84.1)0.1ASM2.DA()-0.412S03S05.S08s17S04MCWS02S140STTON02ON16OAN113-1-31.00025*1 FD164.1/(163.1+164.1)FD164.1/163.1MJ164.1/(163.1+164.1)MJ164.1/163.1163.1-85.1/(85.1+84.1)163.1-85.1/84.1163.1-131.1/(130.1+131.1)163.1-131.1/130.1164-131/48-0.3-0.2R2XT1I-0.23注：圆点代表天然烟碱样本，方块代表合成烟碱样本310S15S18S13101Ellipse:Hotellings T2(95%)0.00.11-0.10.727064*pq1用于衡量各组分积累差异对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，VIP值越大，对烟碱天然性鉴别的差异性越显著，贡献率越大。一般来说，VIP值大于1被认为是最相关的变量，VIP值低于0.5表示无关变量2 5。16 4.1-85.1/84.1、16 4.1-8 5.1/(8 4.1+8 5.1)、16 3.1-131.1/131.1、16 3.1-131.1/(130.1+131.1)的VIP值均大于1,表明这4个变量是影响模型的主要变量，与图2 b所得结果一致，示于图3。3结论由于天然烟碱与合成烟碱的同位素分馏原理和机制不同，本研究开发了基于同位素模式峰的串联质谱方法鉴定天然烟碱与合成烟碱。结果表明,天然烟碱与合成烟碱在MS谱图中m/164.1、16 3.1峰的丰度比、面积比，以及MS/MS谱图中m/z163.1、16 4.1碎片离子的丰度比都具有显著性差异。同时，在OPLS-DA模型的构建与评价中，16 4.1-8 5.1/8 4.1、16 4.1-20.2R2Xo1-0.187VIP是OPLS-DA模型变量的权重值，可30.34XYSM2.DA(2)40.4第5期付亚宁等：基于同位素模式峰的串联质谱鉴别天然烟碱与合成烟碱7191.20.80.40.01t8/1S8-1t91-(1t8+1S8)/1S8-1t911t8/1S8-1E91-(1t8+1S8)/1S8-1c91Var ID(primary)图3天然烟碱与合成烟碱鉴定的12 个变量的VIP值Fig.3 VIP values of 12 variables identified by natural nicotine and synthetic nicotine85.1/(84.1+85.1)、16 3.1-131.1/131.1、16 3.1-131.1/(130.1十131.1)在鉴定天然烟碱时更准确,其准确度达97.8 7%。与常规方法相比，该方法操作简单、快速、无需定量分析，在国际烟草贸易等领域具有实际意义。参考文献：1郭青青，许天驰，杨春雷，孙光伟，杨久红，余君，杨勇.一株高效烟碱降解菌的筛选及其在烟草烘烤中的应用J安徽农业科学，2 0 2 2，50（16）：45-49.GUO Qingqing，,XU T i a n c h i,YA NG Ch u n l e i,SUN Guangwei,YANG Jiuhong，YU Ju n,YANG Yong.Screening of a highly efficientnicotine-degrading bacterium and its applicationin tobacco 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