基于高通量测序的人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化转录组分析.pdf

Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med基于高通量测序的人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化转录组分析邓小书1，2，卫秋阳1，2，谭发银1，2，郭连安1，2，王嘉1，2，邢康康1，2，陈仕江1，2*1.重庆市中药研究院，重庆 400065；2.重庆中医药学院，重庆 402760摘要 目的：探索人工培殖冬虫夏草 Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.外观品质形成的分子基础。方法：以重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫为材料，利用 Illumina Hiseq 2500 高通量测序技术进行转录组测序分析，基于差异倍数（FC）和错误发现率（FDR）筛选差异表达基因，具体筛选条件为|log2FC|1、FDR1 and FDR0.05.Results:A total of 21 942 transcripts were obtained,and 1575 DEGs were screened by DEGSeq.There were 626 up-regulated genes and 949 down-regulated genes,Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)enrichment analysis showed that these DEGs were mainly involved in amino acid metabolism,folding-sorting-degradation,glycometabolism,transport,catabolism,co-enzyme factor and microbial metabolism,and other pathways.66 DEGs were screened,including 46 enzyme genes involved in oxidoreductase activity,12 genes involved in the peroxisome,three genes involved in 专题 基金项目 重庆市自然科学基金面上项目（CSTB2022NSCQ-MSX0874，cstc2021jcyj-msxmX0762）；重庆市中药研究院自主科技计划项目（zzkjjh2022006）；重庆市基本科研业务费项目（cstc2020jxjl-jbky00004）；重庆市技术创新与应用发展专项（cstc2020jscx-msxmX0102）；重庆市中药研究院科研发展基金项目（ygfz20220008）*通信作者 陈仕江，研究员，研究方向：中药资源可持续利用及开发；E-mail：1635Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Medmonooxygenase activity,three genes involved in melanization reactions,and two genes involved in reactive oxygen metabolism,among which tyr1 and TYR may be the key functional gene for the color formation of C.sinensis.Conclusion:High-throughput sequencing technology and bioinformatics analysis were used to obtain the transcriptomic information characteristics of artificially cultivated C.sinensis sclerotium before stroma development,which laid a foundation for clarifying the regulation mechanism of color formation of artificially cultivated C.sinensis sclerotium before stroma development.Keywords Cordyceps sinensis(BerK.)Sacc.;C.sinensis sclerotium before stroma development;high-throughput sequencing;transcriptome冬虫夏草 Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.是我国传统名贵中药材，具有抗肿瘤、免疫调节、抗菌等作用1-2。随着消费者对冬虫夏草认可度的提升和消费需求的日益增长，过度采挖、资源破坏、气候变化等原因导致野生冬虫夏草产量急剧下降，市场供需失衡3。近年来，人工培殖冬虫夏草技术已取得关键性突破，如人工室内感染蝙蝠蛾幼虫形成冬虫夏草子实体4、低海拔规模化人工饲养寄主昆虫蝙蝠蛾5等。随着高通量技术的飞速发展，基于高通量测序的转录组分析已成为研究功能基因组的重要工具，是挖掘生物学性状的关键功能基因和揭示不同生物学性状分子机制的重要手段，在菌物类、动物类中药材研究中均有应用6-7。本课题组在人工培殖冬虫夏草过程中发现，重庆人工培殖的冬虫夏草颜色较康定基地培殖的冬虫夏草更黑。本研究对康定和重庆人工培殖冬虫夏草僵虫进行转录组测序，分析差异表达基因，为进一步探讨人工培殖冬虫夏草虫体颜色变化提供参考。1材料1.1样品康定人工培殖冬虫夏草僵虫和重庆常规人工培殖冬虫夏草僵虫分别由重庆市中药研究院冬虫夏草研究所康定实验基地和重庆实验基地冬虫夏草人工培殖，温度为（81），相对湿度为50%5%，无光照。上述冬虫夏草的寄主昆虫均为小金蝙蝠蛾Thitarodes xiaojinensis（Tu.），侵染菌种均为冬虫夏草菌 Ophiocordyceps sinensi，冬虫夏草僵虫采集时期均为冬虫夏草菌丝将虫体完全包裹，2种人工培殖冬虫夏草僵虫均采用3个生物学重复（分别命名为 KD1、KD2、KD3、CQ1、CQ2、CQ3），康定和重庆人工培殖冬虫夏草僵虫表型见图1。1.2仪器NanoDrop 2000 型超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司）；2100 Bioanalyzer型生物分析仪（美国Agilent Technologies公司）；HiSeq 2500型高通量测序仪（美国Illumina公司）；CFX Connect型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国 Bio-Rad公司）。1.3试药mirVana miRNA Isolation Kit（美国Ambion公司）；TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit（美国 Illumina 公司）；反转录试剂盒 HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物有限公司）。2方法2.1RNA提取与cDNA文库构建参照 mirVana miRNA Isolation Kit 操作流程提取冬虫夏草僵虫的总 RNA，NanoDrop 2000型超微量分光光度计和生物分析仪检测RNA样品的纯度、浓度和完整性。按照试剂盒TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit操作说明书进行cDNA文库构建。使用2100 Bioanalyzer型生物分析仪进行质检，质检合格后于 Illumina HiSeq 2500 型高通量测序平台对文库进行测序。注：KD.康定；CQ.重庆；图3、图6、图7同。图1康定和重庆人工培殖冬虫夏草僵虫表型1636Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med2.2序列筛选与组装测 序 后 产 生 的 原 始 数 据（raw reads）使 用Trimmomatic8软件进行质量控制，获得高质量的clean reads。使用Hisat29将clean reads比对到物种参考基因组。参考基因组来源于美国国家生物技术信息中心（NCBI，https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000448365.1/）数据库，软件参数为默认参数，通过基因组比对率评估样本的情况。2.3基因功能注释及差异基因筛选对得到的 unigene利用基因本体（GO）数据库（http:/geneontology.org/）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（http:/www.kegg.jp/）进行GO分类和注释、KEGG代谢通路分析，进而获得所有unigene的功能注释信息。利用DESeq软件对差异表达基因进行分析，结合 Benjamini-Hochberg 方法对原有假设检验得到的显著性P值进行校正，并最终采用校正后的P值，即错误发现率（FDR）0.05为差异表达基因筛选的关键指标，以降低对大量基因的表达值进行独立的统计假设检验带来的假阳性10。FC为差异倍数。以FDR1作为筛选标准，并对筛选到的差异表达基因进行GO富集及KEGG通路富集分析。2.4实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析为了验证转录组数据的可靠性，采用真菌 18S rRNA7作为内参基因，对筛选到的9个差异表达基因进行RT-qPCR验证，设计RT-qPCR特异引物（表1），利 用 反 转 录 试 剂 盒 HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 获得 cDNA，采用 SYBR Green Master Mix 荧光定量试剂盒，在 PCR 仪上进行定量检测，每个样品3个重复，采用2Ct法计算差异基因的相对表达量11。2.5数据分析采用Microsoft Excel 2020进行数据整理及作图，运用 SPSS 19.0 软件对数据进行显著性分析。RT-qPCR验证的统计分析采用 Student s t-test，数据值为（x sx）。3结果3.1转录组测序结果RNA样品质量浓度为0.440 51.695 2 g L 1，260 nm 处 吸 光 度（A260 nm）/A280 nm为 2.142.17，A260 nm/A230 nm为1.582.37，RNA完整值（RIN）均高于7，28S/18S为1.22.0（表2），经质检表明RNA质量符合测序要求，可进行cDNA文库构建及转录组测序。测序总计得到raw reads 301.42 M，过滤产生clean reads 293.43 M，clean bases共40.58 G，Q30碱 基 为 94.59%94.95%，平 均 鸟 嘌 呤 和 胞 嘧 啶（GC）占比为59.9%（表3）。从测序产出数据质量评估结果可见，本次测序数据饱和度较高，为后续转录本的拼接提供了良好的数据支撑。3.2差异基因表达水平分析从6个样本文库中，获得21 942条unigenes。6个样品转录本的表达丰度主要集中在FPKM（fragments 表 1康定和重庆人工培殖冬虫夏草RT-qPCR 引物基因CYP51fdhcarDpatEfap1icdAtyr1TYRFBP1内参基因基因IDMSTRG.2450.3-FMSTRG.2450.3-RMSTRG.4165.2-FMSTRG.4165.2-RMSTRG.6110.3-FMSTRG.6110.3-RMSTRG.6971.2-FMSTRG.6971.2-RMSTRG.10284.2-FMSTRG.10284.2-RMSTRG.8498.1-FMSTRG.8498.1-RMSTRG.10501.1-FMSTRG.10501.1-RMSTRG.304.1-FMSTRG.304.1-RMSTRG.7986.1-FMSTRG.7986.1-R18S-F18S-R引物（53）TGACTTTCAGGCCCAACATACTTCCTTACTAAACGCCCATCGCTACGGCACCAGCAAGATGCAGACGGGACTCAAGGATTTCACAGTCCTCAAGCTGGGAACAGTATTGGCACAAGGGCATCGAGCGAGCGAGTCACCGTATCATTTCCACTTTCGGGTAGCGGGAGGCTAAACCTGAACGCTGCCCTTTGTTCCCCAAAGAGCCTTCCTCCTTTCCTCAGACCCTTACCAGGTGATCCGGGTTTCTTCACGGCAGAAATAGGCAAACTTCAAGTCTCGCGTTCCTGCCGTGGAGTGAATAGAGCCGAGGCGAATCGAAGGCTCTCGGCGGAGAAACACTACAAGGCTGCTCCATTACATGACCCTAGATTCAAAGCCAATGCCCCTGGCCACTACCCAAACATCG表 2康定和重庆人工培殖冬虫夏RNA样品检测结果样本KD1KD2KD3CQ1CQ2CQ3质量浓度/g L11.695 20.440 51.380 40.936 31.198 71.093 6A260 nm/A280 nm2.162.172.162.142.162.15A260 nm/A230 nm2.311.582.372.302.312.3228S/18S1.21.31.41.41.92.0RIN7.27.17.27.77.58.31637Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Medper kilobase million）10（高水平表达）和FPKM 110（低水平表达）2个区域，FPKM1（极低表达水平）基因数量则较少12，结果见图2。3.3人工培殖冬虫夏草僵虫差异表达基因分析利用DESeq对重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫转录组进行比较（图3），筛选阈值为FDR1，共获得 1575 个差异表达基因。由火山图、柱状图展示差异基因数目，重庆与康定人工培殖冬虫夏草僵虫存在 1575 条差异表达基因，这些差异表达基因中上调表达有 626 条、下调表达有949条。3.4差异基因GO富集分析对重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫的差异表达基因进行GO富集分析，GO富集被分为3类，生物过程（biological process）有20个小类，细胞组分（cellular component）有 11 个 小 类，分 子 功 能（molecular function）有 12 个小类（P0.05）。由图4可知，在生物过程类别中，差异表达基因主要富集在细胞过程（532 个差异表达基因）、代谢过程（436个差异表达基因）、单一生物过程（388个差异表达基因）；在细胞组分中，差异表达基因主要富集在细胞（564个差异表达基因）、细胞部分（561个差异表达基因）、细胞器（408 个差异表达基因）、细胞器部分（221个差异表达基因）、膜（206个差异表达基因）；在分子功能中，差异表达基因主要富集在结合（421个差异表达基因）、催化活性（464个差异表达基因）。差异表达基因的主要功能分类包含细胞过程、代谢过程、催化活性等，说明不同海拔改变了人工培殖僵虫的代谢和酶的催化功能。图2康定和重庆人工培殖冬虫夏草的基因表达量分布表 3康定和重庆人工培殖冬虫夏转录组测序数据质量统计情况样本KD1KD2KD3CQ1CQ2CQ3raw reads/M50.9448.7551.2750.3051.6248.54clean reads/M49.6247.5349.9548.9750.3647.00raw bases/G7.647.317.697.557.747.28clean bases/G7.016.737.066.967.146.43Q30/%94.8194.8494.8094.7694.8094.59GC占比/%60.3760.2860.2959.9259.9959.83注：A.火山图；B.柱状图；红色和绿色的点表示基因的表达量差异有统计学意义，灰色的点表示表达量差异无统计学意义；Up.基因表达上调；Down.基因表达下调；Filtered.基因表达差异无统计学意义。图3康定和重庆人工培殖冬虫夏差异表达基因的火山图和柱状图1638Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med3.5差异表达基因KEGG通路富集分析对重庆和康定人工培殖冬虫夏草僵虫的差异表 达基因进行 KEGG 富集分析，注释到 273 条unigenes，差异基因显著富集（P0.05）的代谢通路有氨基酸代谢（amino acid metabolism）、折叠-分选-降解（folding,sorting and degradation）、糖代谢（carbohydrate metabolism）、转 运 和 分 解 代 谢（transport and catabolism）、辅酶因子和微生物代谢（metabolism of cofactors and vitamins）。其中，氨基酸代谢、糖代谢、折叠-分选-降解中差异基因数目改变最为明显（图5）。3.6参与冬虫夏草僵虫颜色变化的差异表达基因分析冬虫夏草为昆虫、真菌复合体，而昆虫与食药用菌颜色变化主要受酚氧化酶、过氧化物酶、活性氧、黑化反应、色素沉积、褐变等影响13-19。为挖掘人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化成因的关键功能基因，在差异表达基因中筛选酚氧化酶类、过氧化物图4康定和重庆人工培殖冬虫夏差异表达基因GO富集分析图5康定和重庆人工培殖冬虫夏差异表达基因KEGG富集分析1639Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med酶类、氧化还原酶类，以及活性氧代谢、黑化反应、色素沉积、褐变相关基因，共筛选到66个差异表达基因（35个上调基因和31个下调基因），含46个氧化还原酶活性相关基因、12个过氧化物酶体相关基因、3个单加氧酶活性调节相关基因、3个黑化反应相关基因、2个活性氧（ROS）相关基因（表4）。其中，有9个差异表达基因能显著富集到KEGG通路中，由表5可知，细胞色素P450 51B MSTRG.2450.3（cytochrome P450 51B，CYP51）、甲 酸 脱 氢 酶MSTRG.4165.2（formate dehydrogenase，fdh）、乙醛脱氢酶3B1MSTRG.6110.3（aldehyde dehydrogenase 3B1，carD）、GMC 氧 化 还 原 酶 MSTRG.6971.2（glucose-methanol-choline oxidoreductase，patE）、假定蛋白CDD83_1433 MSTRG.10284.2（hypothetical protein CDD83_1433，fap1）、异柠檬酸脱氢酶NADP MSTRG.8498.1（isocitrate dehydrogenase NADP，icdA）、酪氨酸酶MSTRG.10500.1（tyrosinase，tyr1）、酪氨酸酶 MSTRG.304.1（tyrosinase，TYR）、1,6-果 糖 二 磷 酸 酶 MSTRG.7986.1（fructose-1,6-bisphosphatase，FBP1），进一步分析这9个关键酶基因的表达水平。由图6可知，与康定人工培殖冬虫夏草相比，重庆人工培殖冬虫夏草中patE、TYR、FBP1基因表达上调，CYP51、fdh、carD、fap1、icdA、tyr1基因表达下调。carD在2种人工培殖冬虫夏草中高表达（图6），参与类胡萝卜生物合成（ko00906，carotenoid biosynthesis）；酪氨酸酶基因 tyr1、TYR 能富集的KEGG 通 路 有 酪 氨 酸 代 谢（ko00350，tyrosine metabolism）、异喹啉生物碱生物合成（ko00950，isoquinoline alkaloid biosynthesis）、甜菜素生物合成（ko00965，betalain biosynthesis）。表 4康定和重庆人工培殖冬虫夏草66个差异表达基因的名称、编号及功能注释MSTRG.10046.1MSTRG.10085.1MSTRG.10272.2MSTRG.10287.8MSTRG.10442.5MSTRG.10637.2MSTRG.10917.3MSTRG.11195.3MSTRG.1633.1MSTRG.2450.3MSTRG.2583.1MSTRG.3806.2MSTRG.3866.6MSTRG.4069.2MSTRG.4103.4MSTRG.4107.1MSTRG.4165.2MSTRG.4209.4MSTRG.4278.3MSTRG.4555.11MSTRG.4555.5MSTRG.4635.1MSTRG.4636.1MSTRG.4710.1MSTRG.4810.3MSTRG.4835.5MSTRG.5452.7MSTRG.6110.3xanBalt1egt-1egtHQD2mug72ARB_02372SDACTTS3CYP51SAT17prnCtxl1SDR2asor8ARBfdhIBR11BOA1sdnEASPCADRAFT_517149CYP52A12sorDCYP52A13swnKlcc2BOA17carDpyoverdine biosynthesisphenolpthiocerol synthesis polyketide synthase ppsAhypothetical protein OCS_03037hypothetical proteinhypothetical protein CDD83_2213hypothetical protein CDD83_9991hypothetical protein OCS_06458saccharopine dehydrogenaselovastatin nonaketide synthasecytochrome P450 51BtfdA family Taurine catabolism dioxygenase TauDdelta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenasethioredoxinshort-chain dehydrogenase/reductase family proteinFAD binding domain-containing proteinFAD binding domain containing proteinformate dehydrogenaseacyl-CoA dehydrogenase family member 11hypothetical protein HIM_08700terpenoid synthasetrichodiene oxygenasecytochrome P450 52A12FAD-binding,type 2hypothetical protein CDD83_8795hypothetical protein OCS_01885hypothetical protein CDD83_7130putative oxidoreductasealdehyde dehydrogenase 3B1基因编号基因功能注释1640Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin MedMSTRG.6262.2MSTRG.6774.1MSTRG.6788.1MSTRG.6971.2MSTRG.7359.5MSTRG.7360.2MSTRG.7865.2MSTRG.8112.2MSTRG.8164.1MSTRG.8170.3MSTRG.8816.2MSTRG.9141.15MSTRG.9152.2MSTRG.9524.7MSTRG.956.1MSTRG.956.9MSTRG.958.2MSTRG.9831.2MSTRG.9964.4MSTRG.10284.2MSTRG.10861.1MSTRG.11174.3MSTRG.2786.5MSTRG.3354.1MSTRG.4316.7MSTRG.5632.2MSTRG.7395.2MSTRG.8498.1MSTRG.908.2MSTRG.9669.1MSTRG.7380.1MSTRG.10500.1MSTRG.304.1MSTRG.4612.6MSTRG.7141.2MSTRG.7368.1MSTRG.6507.3MSTRG.7986.1cpaHsirQsorDpatEatnDterHladAalt2CLM2CC1G_03009ZEB1af370IBR3alt5apf7AKT7vrtIMPD1IMA1fap1ATG2ECI1TES1PNC2OPT2PXA1trs85-2icdAmdv1SPBC3E7.11cPPO1tyr1TYRustF1aurFAOSDH8FBP1polysaccharide deacetylasehypothetical protein OCS_05242verprolin-like proteinglucose-methanol-choline oxidoreductasetransaldolaseshort chain dehydrogenase/reductasehypothetical protein XA68_15658hypothetical protein CP533_1202O-methylsterigmatocystin oxidoreductasehistidine kinaseFAD binding domain-containing proteinlovastatin diketide synthase lovfhypothetical protein HIM_06980hypothetical protein HIM_11932hypothetical protein OCS_00763benzoate 4-monooxygenase cytochrome P450hypothetical protein OCS_00765hypothetical protein CDD83_1752hypothetical protein OCS_01045hypothetical protein CDD83_1433autophagy-protein 2hypothetical protein HIM_07786acyl-CoA thioesterase hypothetical protein HIM_04518hypothetical protein HIM_06101lipid transportercis-golgi transport protein particle complex subunitisocitrate dehydrogenase NADPhypothetical protein CDD83_8278DNAJ domain containing proteinhypothetical protein HIM_07253tyrosinasetyrosinase 2flavin-binding monooxygenase-like family proteinflavin monooxygenase-like proteinamine oxidase,flavin-containing superfamilyuncharacterized protein TCAP_03091fructose-1,6-bisphosphatase class 1/sedoheputulose-1,7-bisphosphatase续表4基因编号基因功能注释3.7RT-qPCR验证对筛选到的9个差异表达基因进行RT-qPCR验证。由图7可知，9个差异表达基因的表达水平与转录组测序分析结果相一致，即与康定人工培殖冬虫夏草相比，重庆人工培殖冬虫夏草中 patE、TYR、FBP1 基因表达上调，CYP51、fdh、carD、fap1、icdA、tyr1基因表达下调。由此表明，转录组测序数据可靠。4讨论近年来，随着高通量测序技术的不断发展，利用转录组测序成为研究动物类、菌类中药材功能基因调控机制的新思路。本研究开展了不同海拔人工培殖冬虫夏草僵虫的转录组测序，以求从分子层面1641Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med探讨人工室内培殖冬虫夏草外观品质的调控生物学研究基础。本研究基于高通量转录组学技术对重庆和康定人工室内培殖冬虫夏草僵虫进行测序分析，在差异表达基因中挖掘冬虫夏草僵虫颜色变化相关的关键功能基因并分析其表达情况，共筛选到46个氧化还原酶活性相关基因、12个过氧化物酶体相关基因、3个单加氧酶活性调节相关基因、3个黑化反应相关基因、2个ROS相关基因；carD、tyr1、TYR、patE、FBP1、CYP51、fdh、fap1、icdA 能 显 著 富 集 到表 5康定和重庆人工培殖冬虫夏草差异关键基因的名称、编号及KEGG富集通路基因CYP51fdhcarDpatEfap1icdAtyr1TYRFBP1基因编号MSTRG.2450.3MSTRG.4165.2MSTRG.6110.3MSTRG.6971.2MSTRG.10284.2MSTRG.8498.1MSTRG.10500.1MSTRG.304.1MSTRG.7986.1KEGG富集通路ko00100：Steroid biosynthesisko00630：Glyoxylate and dicarboxylate metabolismko00906：Carotenoid biosynthesisko00260：Glycine,serine and threonine metabolismko00260：Glycine,serine and threonine metabolism；ko00310：Lysine degradation；ko04146：Peroxisomeko00020：Citrate cycle（TCA cycle）；ko00480：Glutathione metabolism；ko04146：Peroxisomeko00350：Tyrosine metabolism；ko00950：Isoquinoline alkaloid biosynthesis；ko00965：Betalain biosynthesisko00350：Tyrosine metabolism；ko00950：Isoquinoline alkaloid biosynthesis；ko00965：Betalain biosynthesisko00010：Glycolysis/Gluconeogenesis；ko00030：Pentose phosphate pathway；ko00051：Fructose and mannose metabolism；ko00710：Carbon fixation in photosynthetic organisms图6康定和重庆人工培殖冬虫夏草僵虫颜色变化相关基因表达分析1642Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin MedKEGG通路中。在这些差异表达基因中，tyr1和TYR属于酪氨酸酶基因家族基因，而酪氨酸酶广泛存在于原核、真核微生物及动植物中，属于多酚氧化酶，是植物及真菌褐变、动物黑色素形成的关键酶，参与多个调控通路，如甜菜素生物合成途径、酪氨酸代谢、黑化反应等20-23。其作用是催化酪氨酸转化为多巴，进而启动一系列生化反应，最终合成各种色素前体物质（包含黑色、白色、黄色）24-25。此外，酪氨酸酶是黑色、白色、黄色3种色素前体物质合成过程中的关键限速酶，具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶2种酶活性，酪氨酸酶活性或其基因表达受影响时，会造成底物大量积累并沿着某一色素合成方向进行反应，不同的比例导致不同的色素合成方向26-27。例如，香菇在贮存过程中由于酪氨酸酶Letyr的前体蛋白受蛋白酶水解变成有活性的蛋白，发生褐变变黑反应，由此表明，酪氨酸酶的活性与褐变相关28。Auffret等29利用多阶段全转录组测序追踪从幼年到养殖珍珠收获阶段与珠母贝白化表型相关的关键基因，其研究表明酪氨酸酶Tyr-1基因与黑色素生物合成相关。Bahraman 等30研究表明，TYR是催化黑素形成的一种重要限速调节酶。黑色素可分为真黑素、类黑色素和异黑色素，通过酚氧注：*P0.05。图7康定和重庆人工培殖冬虫夏草RT-qPCR验证结果（x sx,n=3）1643Aug.2023 Vol.25 No.82023 年 8 月 第 25 卷 第 8 期中国现代中药Mod Chin Med化酶激活系统合成，而酪氨酸、-谷氨酰-4-羟基苯、儿茶酚等是合成黑色素的前体物质。Zhang等31对平菇菌盖颜色调控机制研究表明，菌盖中的色素由真黑色素和棕黑色素组成，并且菌盖颜色不同是由于两者比例不同造成的，同时，还鉴定得到调控白黄侧 耳 菌 盖 颜 色 的 关 键 基 因 酪 氨 酸 酶 基 因（PcTYR）。在鳞翅目昆虫家蚕中，已克隆多个黑色素合成信号通路基因，如酪氨酸羟化酶（TH）32、多巴脱羧酶（DDC）33、漆酶（yellow/laccase2）34等。研究表明，小鼠中出现的白化现象就是由酪氨酸酶基因发生突变所造成的35。同样，米曲霉酪氨酸酶基因也是黑化过程中的关键酶基因36。最新研究表明，平菇菌盖中的色素由真黑色素和棕黑色素组成，并且菌盖颜色不同是由于两者比例不同造成的37。本研究发现，酪氨酸酶基因 tyr1和 TYR在重庆与康定人工培殖冬虫夏草僵虫中差异表达，且显著富集到甜菜素生物合成、异喹啉生物碱生物合成、酪氨酸代谢通路，而这几个通路最终均能产生黑色素，由此表明tyr1和TYR可能是冬虫夏草虫体颜色变化的关键酶基因，并为改良人工培殖虫草品质提供理论基础。参考文献1 YUE K，YE M，ZHOU Z J.The genus Cordyceps：A chemical and pharmacological review J.J Pharm Pharmacol，2013，65（4）：474-493.2 钱正明，李文庆，孙敏甜，等.冬虫夏草化学成分分析 J.菌物学报，2016，35（4）：476-490.3 WEI Y Q，ZHANG L，WANG W W，et al.Chinese caterpillar fungus（Ophiocordyceps sinensis）in China：Current distribution，trading，and futures under climate change and overexploitation J.Sci Total Environ，2021，755：142548.4 韩日畴，吴华，陶海平，等.中国冬虫夏草研发70年 J.应用昆虫学报，2019，56（5）：849-883.5 LI X，LIU Q，LI W J，et al.A breakthrough in the artificial cultivation of Chinese cordyceps on a large-scale and its impact on science，the economy，and industry J