基于多金属氧酸盐的类酶活性研究及谷胱甘肽传感应用.pdf

年 月第 卷 第 期山 东 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)().收稿日期:基金项目:国家自然科学基金资助项目()通讯作者:杨国海男副教授博士基于多金属氧酸盐的类酶活性研究及谷胱甘肽传感应用于凡珍 付丽杰 渠陆陆 黄 鹏 杨国海(江苏师范大学化学与材料科学学院江苏徐州)摘要 多金属氧酸盐是一类纳米级的金属氧化物簇化合物其由于具有可调节的酸碱、氧化还原、磁性、催化和光化学等特性在催化、医学、表面科学和材料科学等领域引起了广泛的关注.通过大量实验数据的支撑详细地分析了多金属氧酸盐材料(以为代表)的类酶性质进行了催化动力学与催化机制研究 结果显示其具有三种类酶活性:类过氧化物酶 类氧化物酶类过氧化氢酶活性 基于多酸材料可催化 并氧化 四甲基联苯胺生成蓝色氧化产物的原理进一步建立了通过测定吸光度变化检测谷胱甘肽含量的方法线性范围为 检测限为.所开发的基于多酸纳米酶的谷胱甘肽传感方法在比色检测领域拥有巨大的应用潜力关键词 多酸 类酶 传感 谷胱甘肽中图分类号 .文献标识码 :./.目前酶广泛应用于食品加工、环境治理、医药和生物化学等领域是一种重要的生物催化剂 天然酶虽然能高效且选择性地催化代谢过程中的化学反应但因稳定性较低和价格昂贵故在实际应用中极大地受到限制 因此研究人员致力于合成与天然酶具有相似性能的人工模拟酶 近几十年来随着纳米技术的快速发展和对酶促机理的深入研究人们在开发新型模拟酶方面开展了大量工作 年阎锡蕴等发现 磁性纳米颗粒可催化氧化不同过氧化物酶底物与天然辣根过氧化物酶作用时颜色变化一致因此报道了首例发现基于四氧化三铁纳米颗粒的无机纳米材料具有类似过氧化物酶的催化活性的工作系统地研究了无机纳米材料的类酶特性建立了一套测量纳米酶催化活性的标准方法并应用于疾病诊断和治疗的相关研究 纳米酶具有易制备、成本低、稳定性强和催化活性可调节等优点其在生物传感、环境保护、抗菌和癌症治疗等方面还有广阔的研究前景多酸化学的发展历程已有 多年多酸即多金属氧酸盐()是一类含有等元素的金属氧合物 正因其结构多变多酸拥有丰富多样的性质在吸附、催化、生物等领域有着重要的应用 多酸的基本结构单元主要是八面体和四面体各个多面体之间通过共角、共边或共面相连而产生大量不同的多阴离子结构 多酸的催化工艺在化工生产过程中占有重要地位 作为一种经典的多酸材料的类酶活性还没有被开发报道过 经研究发现合成的多酸材料 具有优异的类酶性质如图 所示谷胱甘肽()是一种二肽化合物是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合形成的通常以还原型和氧化型两种形态广泛存在于动植物体中 在人体各组织中广泛分布着具有重要生理功能的还原型 其对人体代谢起到重要的调节作用如抗氧化应激、解毒排毒、消除炎症、抗辐射损伤、参与氨基酸的转运吸收抗衰老等 由此可见 在生物医学领域具有广泛的用途 因此探索建立一种简单、灵敏、准确的还原型 检测方法具有重要的现实意义 目前 的检测方法主要有酶循环法、荧光法、高效液相色谱法、高效液相色谱质谱联用法等这些检测方法虽然灵敏度较高但同时也存在试剂成本高、仪器设备昂贵、检测步骤繁琐、对操作人员专业素养要求较高等缺陷 与上述检测方法相比比色法是一种实验成本低、仪器设备要求低、操作快速简单的测定方法 在本文中利用多酸材料 的高第 卷山 东 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 期类酶活性让 在活性氧存在的情况下转化为其氧化形式()从而抑制四甲基联苯胺()的氧化导致吸光度降低和蓝色变浅并在此基础上提出了一个简单、快速、灵敏的基于选择性比色法检测 的方法 该方法为我们提供了一种新的纳米酶模拟生物传感应用平台图 的类酶活性示意图 实验部分.试剂和仪器、尿素()、氯化铜()、氯化镁()、氯化钠()、()、四甲基联苯胺()、乙酸、乙酸钠、无水乙醇购自阿拉丁(中国上海)所有购买的试剂均为分析纯 实验过程中使用的超纯水采用 制备(电阻率为.)紫外可见光谱图在 型紫外可见分光光度计(美国 公司)上测量获得 扫描电子显微镜()图像采用 扫描电子显微镜(日本)拍摄 实验中还用到 恒温混匀仪、酸度计(计雷磁上海仪电科学仪器股份有限公司)、电子分析天平(美国奥豪斯公司).的制备 在 中加入(./)固体搅拌制成悬浮液再加入 (/)固体继续搅拌 过滤后在 锥形瓶中加入.(./)硫酸联氨 下搅拌处理溶液然后将溶液在 的加热板上放置(盖上玻璃片)过滤将墨绿色溶液在烧杯中冷却至 加入 丙醇振荡 将在 沉淀析出的黑色固体在 的条件下过滤出来用 的丙酮洗涤在滤纸上晾干.条件优化.材料浓度的优化 对材料过氧化物酶活性与浓度的关系进行研究具体操作如下:分别量取/多酸材料 、于三个试管中分别加入 /四甲基联苯胺溶液、.溶液和 的醋酸缓冲溶液定容至 将混合液置于 条件下孵育 反应后测定 处的吸光度 具有氧化物酶活性的多酸活性研究与上述的过氧化物酶活性所用第 期于凡珍等:基于多金属氧酸盐的类酶活性研究及谷胱甘肽传感应用第 卷方法一致但是不加入 溶液.反应温度和 的优化通过改变实验反应时的温度来研究温度对材料活性影响 分别量取/多酸材料 于七个试管中分别加入 /四甲基联苯胺溶液、./溶液和 的醋酸缓冲溶液定容至 分别在 、下孵育 测定 处的吸光度 条件实验保持其它条件相同但是醋酸缓冲溶液的 改变分别控制醋酸缓冲溶液 在、条件下进行实验 具有氧化物酶活性的多酸活性研究与上述的过氧化物酶活性所用方法一致但是不加入 溶液.类酶活性研究.类过氧化物酶活性 为了研究材料的类过氧化物酶活性在三个试管中分别进行实验为试管进行编号 在 号试管中加入 醋酸缓冲溶液依次加入 溶液、./溶液和 /溶液充分混合均匀后在 条件下反应 波长 下测量吸光度 平 行 测 定 次 取 平 均 值 在 号 试 管 中 加 入 醋 酸 缓 冲 溶 液 依 次 加 入 ./溶液和 /溶液充分混合均匀后在 条件下反应 波长 下测量吸光度平行测定 次取平均值在 号试管中加入 醋酸缓冲溶液依次加入 溶液和 /溶液充分混合均匀后在 条件下反应 波长 下测量吸光度平行测定 次取平均值 比较三个试管中反应的变色情况及吸光度值的关系.类过氧化氢酶活性 为了研究材料的类过氧化氢酶活性准备两个试管编号、在 号试管中依次加入 醋酸缓冲溶液、溶液和 ./溶液充分混合均匀后在 条件下反应 波长 下测量吸光度平行测定 次取平均值在 号试管中依次加入 醋酸缓冲溶液和 溶液充分混合均匀后在 条件下反应 波长 下测量吸光度平行测定 次取平均值 比较两个试管中反应吸光度值的关系.类氧化物酶活性 为了研究材料的类氧化物酶活性三个试管中皆依次加入 醋酸缓冲溶液 溶液和 /溶液充分混合均匀后分别通入、和 在室温下反应 波长 下测量吸光度每个试管平行测定 次取其平均值 比较三个试管中反应的变色情况及吸光度值的关系.稳态动力学分析 对 纳米酶类过氧化物酶活性进行稳态动力学分析通过在.醋酸缓冲溶液中恒定 浓度下改变 浓度(./)或者固定 浓度下改变 浓度(/)用紫外可见分光光度计检测含有、和 的醋酸缓冲溶液在 下孵育 后 处的吸光度.的测定配制所需浓度的 溶液在一系列离心管中依次加入 溶液、/溶液、.溶液 不同浓度的 用 的醋酸缓冲溶液定容至 充分摇匀用恒温水浴的方式使混合液在 环境下反应 反应后测定反应体系的吸收光谱并记录 处的吸收光度值进行 次平行测定为验证该材料对 的选择性选取尿素、氯化铜、氯化镁、氯化钠等作为干扰物质进行实验/的干扰物质和 分别加入显色体系测定反应体系的吸收光谱并记录 处的吸收光度值进行 次平行测定.实际样品的测定 人血样由徐州市第一人民医院提供 首先将血样在 下离心得到的上清液稀释 倍 取 样品加入到 混合溶液根据溶液在 处吸光度的变化测定 的含量 结果与讨论.材料的表征 根据 的(图)图像我们可以观察到 为层状结构有利于 吸附于其表面其氨基上的孤对电子通过 转移给 加速电子供体 与电子受体 之间的第 卷山 东 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 期电子转移提高 分解成强氧化性羟自由基()能力图()和()不同放大倍率下 的 图像.的模拟酶活性 以 为底物、吸光度为指标考察 浓度、温度以及 值等因素对 氧化的影响 的浓度越高 处吸光峰强度逐渐增强 但因浓度过高会导致测量的吸收峰参差不齐不利于实验结果的分析当 加入量为 时吸收峰平滑且吸收值在分析范围内便于实验数据的分析(图()固定其它条件在 温度区间内考察了温度对吸收峰的影响(图()图()紫外可见吸收光谱(从左往右依次为加入 /溶液体积为 、)温度对 类过氧化物酶活性()和类氧化物酶活性()的影响缓冲液 对 类过氧化物酶活性()和类氧化物酶活性()的影响第 期于凡珍等:基于多金属氧酸盐的类酶活性研究及谷胱甘肽传感应用第 卷和()当温度低时反应速度慢生成氧化态 的量少可知过氧化物酶活性低当温度高时被氧化的 减少可知过氧化物酶活性逐渐降低这是由于 会直接分解生成 并从反应体系中释放导致产生()的量减少 即温度过高或过低都会导致氧化物酶活性降低 当温度为 时材料表现出的过氧化物酶活性和氧化物酶活性的稳定性最好 因此选择在 进行实验 图()和()表明随着 值升高 处过氧化物酶相对活性逐渐减小当 时过氧化物酶活性较高氧化物酶活性也处于最大值 因此选择在 的 缓冲液中进行显色反应.的类酶活性 通过考察催化 的能力评估 的类过氧化氢酶催化活性 分别将、溶液体系在 下反应 测定反应体系的吸收光谱并记录 的吸收光度值 次平行测定 对应如图 ()的光谱曲线应在 附近有一个强吸收峰其吸光度和 的含量呈正比 在相同反应时间下溶液体系在 处吸光度高于加入 的溶液体系 实验结果表明存在的情况下能够快速氧化 可较好的催化 分解因此 具有类过氧化氢酶活性图 紫外可见吸收光谱()类过氧化氢酶活性()()类过氧化物酶活性(从左到右依次为:和)()类氧化酶活性(通入不同气体从左到右依次为通入)利用 作为显色底物我们研究了 过氧化物酶活性 分别将、溶液置于三个试管中在 下反应 测定反应吸收光谱并记录其在 处的吸收光度 次平行测定 号试管中在存在 条件下能快速氧化 生成氧化态 光谱曲线(图 ()曲线)表明有一个强吸收峰在 溶液呈蓝色(图 ()内插图)号试管中在溶液在紫外光谱 内未出现吸收峰(图 ()曲线)溶液呈现无色说明在短时间内 氧化 效果十分不明显 号试管中 溶液呈浅蓝色(图 ()内插图)反应催化速度远远低于 号试管 由实验结果可知存在的情况下能够快速氧化 因此 具有类过氧化物酶活性且可能具有类氧化酶活性利用 作为显色底物研究 的氧化物酶活性 用紫外可见分光光度计扫描其吸收光谱(图 ()在 处三条曲线都有一个强吸收峰通入 的吸收光度值最大且在允许范围内 实验结果表明具有类氧化物酶活性.稳态动力学分析 采用酶动力学理论和方法进一步探究 的类过氧化物酶活性在保持 或 浓度不变的条件下通过改变另一物质的浓度获得动力学参数表达出 和 的浓度对反应速度的影响(图 ()和()结果表明在底物浓度允许范围内的催化反应为典型的动力学模型 稳态动力学参数最大初始反应速率()和 常数()可通过拟合 方程获得方程如下:/第 卷山 东 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 期其中 为通过 定律计算所得的不同底物浓度下的初始反应速率为底物的浓度即米氏常数其值等于反应速度达到最大速度一半时的底物浓度 通常用于表示酶与底物的亲和力越小亲和力越强 如图()和()所示/与/双倒数图呈线性关系根据斜率和截距可求得催化反应的表观动力学常数 和 对于 ././对于././.表 数据表明对底物 和 的 值均低于天然酶和其他一些已报道的纳米酶说明 对 和 的具有较好的亲和力此外对底物的 值更低说明与上述催化剂相比只需较低浓度的 就能达到最大反应速度图 纳米酶以 为底物的动力学曲线()及相应的双倒数作图()纳米酶以 为底物的动力学曲线()及相应的双倒数作图()表 纳米酶与其他催化剂 和 的比较(/)(/).第 期于凡珍等:基于多金属氧酸盐的类酶活性研究及谷胱甘肽传感应用第 卷.的测定 基于 的类酶性质在优化的条件下我们将不同浓度的 加入到/溶液体系中检测结果如图()所示 随着 浓度的增加 在 处的吸光度逐渐下降该体系在 处的吸光度与 的浓度仍保持了良好的线性关系线性范围为/相关系数为.检测限可以达到./(/)性能优于一些已有的工作(表)同时通过加入干扰物质进行实验我们发现 对 的选择性较好(图()因此具有较好的催化活性并且基于比色检测 方法操作简便成本低灵敏度高可作为理想的纳米材料用于传感分析图()不同浓度 溶液加入反应体系后吸光度的线性曲线(从左往右 溶液浓度依次为 /、/、/、/、/的光学图片)()反应体系中加入浓度为 /的干扰物及 后吸光度的变化情况表 不同材料检测 的线性范围和检测限 (/)(/)./.稳定性是评价类酶催化剂实际应用的重要参数如图 所示即使储存半个月后的催化活性依然大于 实验结果表明在苛刻的反应条件下具有良好的稳定性图 的催化活性随存储时间的变化第 卷山 东 师 范 大 学 学 报(自 然 科 学 版)第 期为了探讨传感器的可行性用稀释的人血清作为实际样品进行 的含量检测 如表 所示测得人血清 浓度为./为了进一步验证该方法的准确性将标准浓度的 加入血清样本中 测得样品的回收率为分别为.和.相对标准偏差均小于 显示了高的准确度和巨大的潜力表 血液中 的测定(/)(/)(/)()().结 语研究结果表明合成的多酸材料 展现了三重模拟酶活性:类氧化酶、类过氧化物酶和类过氧化氢酶 同时材料具有较高的类酶活性且对底物具有良好的亲和力表现出优异的催化活性能够使 检测体系得到优化 利用其类酶活性以及 定量抑制酶促反应的特性成功建立了 含量测定新方法此外由于 的低成本和高稳定性该纳米材料有望应用于生物催化、免疫检测和环境监测等方面为人类健康效应相关因子检测提供新技术和新思路 参考文献 .():.():.():.:.():.():.():.():().():.():.:.():.:.():.():.():.():.():.():.:.():.():.:.():.第 期于凡珍等:基于多金属氧酸盐的类酶活性研究及谷胱甘肽传感应用第 卷 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