复发性流产患者绒毛组织HI...HL蛋白的表达及其临床意义_娄欢.pdf

东南大学学报(医学版)J Southeast Univ(Med Sci Edi)2023，Feb;42(1):98-103收稿日期2022-07-26 修回日期2022-11-08基金项目河南省医学科技攻关计划项目(2018020801)作者简介娄欢(1985 )，女，河南郑州人，副主任医师，医学硕士。E-mail:louhuan1985l163 com通信作者杨小风E-mail:pkiit12163 com引文格式娄欢，杨小风，武明莉，等 复发性流产患者绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白的表达及其临床意义J 东南大学学报(医学版)，2023，42(1):98-103 论著 复发性流产患者绒毛组织 HIF-1、VHL蛋白的表达及其临床意义娄欢，杨小风，武明莉，郭婷婷，李怡梅(郑州大学附属郑州中心医院 妇产科，河南 郑州450000)摘要目的:检测复发性流产患者绒毛组织缺氧诱导因子-1(HIF-1)、希佩尔林道抑癌基因(VHL)蛋白表达水平并分析其临床意义。方法:选取2019 年5 月至2021 年11 月本院收治的83 例复发性流产患者作为观察组，另选取 80 例行人工流产的正常早孕者设为对照组。收集两组绒毛组织，采用免疫组化法检测绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白表达水平，采用 Spearman 法分析复发性流产患者 HIF-1 与 VHL 蛋白表达的关系，并采用 Logistic 回归分析复发性流产的影响因素。结果:观察组绒毛组织 HIF-1 蛋白阳性表达率高于对照组(P 0 05)，VHL 蛋白阳性表达率低于对照组(P 0 05);观察组 HIF-1 蛋白表达与 VHL 蛋白表达呈负相关(r=0 504，P 0 05);观察组孕妇被动吸烟、人工流产3 次、作息不规律占比均高于对照组(P 0.05);经 Logistic 回归分析可知，人工流产3 次、作息不规律及 HIF-1 蛋白阳性表达率升高均是发生复发性流产的危险因素(P 0 05)，VHL 蛋白阳性表达是其保护因素(P 0 05)。结论:复发性流产患者绒毛组织中 HIF-1 蛋白表达水平异常升高，VHL 蛋白表达水平异常降低，且两者呈负相关，均可能与复发性流产的发生有关。关键词复发性流产;绒毛组织;缺氧诱导因子-1;希佩尔林道抑癌基因 中图分类号714 21 文献标志码A 文章编号1671-6264(2023)01-0098-06doi:10 3969/j issn 1671-6264 2023 01 014Expressions of HIF-1 and VHL proteins in villi of patients with recurrentabortion and their clinical significanceLOU Huan，YANG Xiaofeng，WU Mingli，GUO Tingting，LI Yimei(Department of Obstetrics and Gynecology，Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University，Zhengzhou 450000，China)AbstractObjective:To detect the expressions of hypoxia inducible factor-1(HIF-1)and Von Hippel Lin-dau tumor suppressor gene(VHL)protein in villi of patients with recurrent abortion and analyze their clinical signif-icance Methods:83 patients with recurrent abortion treated in our hospital from May 2019 to November 2021 wereselected into observation group，and 80 normal early pregnant patients with induced abortion were selected into con-trol group The villi tissues of the two groups were collected，and the expressions of HIF-1 and VHL protein in vil-89li were detected by immunohistochemical method The relationship between HIF-1 protein expression and VHLprotein expression in patients with recurrent abortion was analyzed by Spearman method，and the influencing factorsof recurrent abortion were analyzed by Logistic regression esults:The positive expression rate of HIF-1 proteinin villi of the observation group was higher than that of the control group(P 0 05)，and the positive expressionrate of VHL protein was lower than that of the control group(P 0 05)The expression of HIF-1 protein in villiof patients with recurrent abortion was negatively correlated with that of VHL protein(r=0 504，P 0 05)Theproportion of passive smoking of pregnant women，induced abortion 3 times，irregular work in the observationgroup were higher than those in the control group(P 0 05)Logistic regression analysis showed that inducedabortion 3 times，irregular schedule and high positive expression rate of HIF-1 protein were the risk factors forrecurrent abortion(P 0 05)，and the positive expression of VHL protein was the protective factor(P 0 05)Conclusion:The expression of HIF-1 protein in villi of patients with recurrent abortion is abnormally increased，and the expression of VHL is abnormally decreased The expression of the two proteins is correlated，which may berelated to the occurrence of recurrent abortion Key wordsrecurrent abortion;decidual tissue;hypoxia inducible factor-1;Von Hippel Lindau tumor suppres-sor gene复发性流产是指连续发生 3 次或 3 次以上的自然流产，其临床表现为停经后阴道出血和腹痛，部分患者没有临床症状1。在复发性流产的患者中能够明确其病因的约占 50%，主要包括染色体异常、母体生殖道异常、免疫功能异常、内分泌因素、生殖道感染、宫颈机能不全及血栓形成倾向等2-3，但仍有多数患者发生流产的病因尚不明确。因此，积极探索复发性流产的相关影响因素，从而进一步阐明其发病机制至关重要。徐英姬等4 认为，胎盘循环异常可导致胚胎停止发育或发育异常。缺氧诱导因子-1(HIF-1)是一种激活缺氧反应基因转录的调节因子，在胎盘循环过程中具有重要的作用5。此外，Hoefflin 等6 报道，希佩尔林道抑癌基因(VHL)是一种蛋白质编码基因，与 HIF-1的表达水平密切相关，VHL 失活可使 HIF-1 在细胞中表达和活性升高，从而促进血管内皮细胞增殖，但目前国内外少有 VHL 及 HIF-1 蛋白表达水平是否与复发性流产有关的研究报道。鉴于此，本研究通过研究复发性流产患者绒毛组织 VHL 蛋白及 HIF-1 蛋白的表达情况及其与复发性流产的关系，探讨 VHL 蛋白及HIF-1 蛋白在复发性流产中的可能作用机制，现报道如下。1资料与方法1 1一般资料经本院伦理委员会批准，选取2019 年5 月至2021年 11 月本院收治的 83 例复发性流产患者设为观察组，另选取 80 例行人工流产的正常早孕者设为对照组。其中观察组年龄 22 45 岁，平均(30 36 5 54)岁;孕周6 12 周，平均(9 14 2 26)周。对照组年龄20 43 岁，平均(29 25 4 78)岁;孕周 7 12 周，平均(8 87 1 70)周。两组年龄及孕周具有可比性(P 0 05)。纳入标准:(1)观察组均有3 次的无诱因自然流产史，且孕周12 周，就诊时经 B 超检测确诊胚胎无原始心血管搏动;(2)对照组就诊时经 B 超检测可见胚胎有原始心血管搏动;(3)两组均无早产、死产等不良妊娠史;(4)患者及家属均签署知情同意书。排除标准:(1)多胎妊娠者;(2)夫妻双方染色体异常者;(3)生殖道感染或生殖器官异常者;(4)合并心、肝、肾等重要脏器功能障碍者;(5)合并肿瘤或凝血功能障碍者;(6)合并精神疾病或认知功能障碍者;(7)近期接触过重金属等毒物者;(8)近 1 个月接受重大手术者;(9)因各种原因不能全程参与本研究者。1 2方法1 2 1绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白表达检测取流产清宫术后的绒毛组织 5 8 g，无菌盐水冲洗后，依次经过 4 0%的甲醛溶液固定、石蜡包埋及连续切片处理，然后进行免疫组化检测。鼠抗人单克隆抗 VHL 抗体为即用型工作液，试剂盒购自上海研生生化试剂有限公司;鼠抗人多克隆抗 HIF-1 抗体购自上海伊莱博生物科技公司。操作严格按照试剂盒说明进行，具体包括:绒毛组织石蜡切片，常规脱蜡至水，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶，微波修复抗原;磷酸缓冲盐溶液(PBS)液洗 3 次，滴加一抗(VHL、HIF-1，稀释至 1 99娄欢，等 复发性流产患者绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白的表达及其临床意义200)，38 孵育 60 min;PBS 洗涤后再滴加通用型二抗，36 孵育 20 min;最后显色、复染、脱水、封片。1 2 2结果判断HIF-1、VHL 蛋白阳性染色分别位于细胞核和胞浆。所有切片均由 2 名以上经验丰富的医师采用 H-score 评分法为标准对免疫组化结果判定7。每张切片随机选取 5 个高倍视野，细胞内呈深棕黄色计为 3 分，呈棕黄色计为 2 分，呈现淡黄色计为 1分，均无着色计为 0 分;着色细胞数5%为 0 分，5%且25%为 1 分，25%且50%为 2 分，50%为 3 分。将以上两项得分相乘，进行判断:0 分为阴性()，1 3 分为弱阳性(+)，4 5 分为中度阳性(+)，6 分及以上为强阳性(+)。1 2 3资料收集收集两组年龄、合并高血压、孕前体质量指数(BMI)24 0 kgm2、丈夫饮酒、孕期被动吸烟、人工流产3 次、作息不规律、HIF-1 蛋白及VHL 蛋白阳性表达率等资料，将上述指标作为自变量，另将流产情况记为因变量，均进行赋值，见表 1。表 1变量赋值结果Tab 1Variable assignment results变量赋值变量赋值年龄实测值人工流产3 次否=0，是=1合并高血压否=0，是=1作息不规律否=0，是=1孕前 BMI24 0 kgm2否=0，是=1HIF-1 蛋白阴性表达=0，阳性表达=1孕期被动吸烟否=0，是=1VHL 蛋白阴性表达=0，阳性表达=1丈夫饮酒否=0，是=1流产情况人工流产=0，复发性流产=11 3观察指标(1)比较两组绒毛组织中 HIF-1、VHL 蛋白表达情况;(2)复发性流产患者 HIF-1 与 VHL 蛋白表达水平的相关性分析;(3)复发性流产发生的影响因素分析，记录比值比(O)、95%可信区间(95%CI)等。1 4统计学处理采用 SPSS 27 0 软件对数据进行分析处理。经检验符合正态分布的计量资料，以 x s 表示，采用 t 检验;计数资料以 例(%)描 述，采 用 2检 验;采 用Spearman 等级相关分析复发性流产患者 HIF-1 与VHL 蛋白表达的关系，采用 Logistic 回归分析法分析影响复发性流产发生的因素。P 0 05 为差异有统计学意义。2结果2 1两组绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白表达水平比较观察组绒毛组织 HIF-1 蛋白阳性表达率高于对照组(P 0 05)，VHL 蛋白阳性表达率低于对照组(P 0 05)，见表 2、图 1。表 2两组绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白表达情况比较例Tab 2Comparison of expressions of HIF-1 and VHL protein in villus tissue of two groupscases组别nHIF-1VHL+阳性+阳性观察组8321(25 30)15(18 07)25(30 12)22(26 51)62(74 70)56(67 47)9(10 84)12(15 00)6(7 23)27(32 53)对照组8047(58 75)11(13 75)14(17 50)8(10 00)33(41 25)31(38 75)19(23 75)17(21 25)13(16 25)49(61 25)2值18 74513 502P 值0 0010 001注:括号内为百分比001东南大学学报(医学版)2023 年 2 月，42(1)A 观察组 HIF-1 蛋白表达;B 对照组 HIF-1 蛋白表达;C 观察组 VHL 蛋白表达;D 对照组 VHL 蛋白表达图 1两组绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白表达情况(免疫组化法200)A HIF-1 protein expression in observation group;B HIF-1protein expression in control group;C VHL protein expression in observationgroup;D VHL protein expression in control groupFig 1Expressions of HIF-1 and VHL protein in villus tissue of two groups(immunohistochemical method，200)22复发性流产患者绒毛组织 HIF-1 与 VHL 蛋白表达的相关性83 例复发性流产患者中绒毛组织 HIF-1 和 VHL蛋白均呈阳性表达 6 例，均呈阴性表达 9 例，HIF-1蛋白表达与 VHL 蛋白表达呈负相关(r=0 504，P 0 001)。2 3复发性流产发生的影响因素分析观察组年龄、孕前 BMI24 0 kgm2、合并高血压、丈夫饮酒占比与对照组比较，差异均无统计学意义(P 0 05)。观察组孕妇被动吸烟、人工流产3 次、作息不规律占比及 HIF-1 蛋白阳性表达率均高于对照组，VHL 蛋白阳性表达率低于对照组(P 0 05)，见表 3。经 Logistic 回归分析可知，人工流产3 次、作息不规律及 HIF-1 蛋白阳性表达率升高均是发生复发性流产的危险因素(P 0 05)，VHL 蛋白阳性表达是其保护因素(P 0 05)，见表 4。3讨论随着社会经济的发展、人们行为生活习惯及生活环境的改变，近年来自然流产发生率呈现逐年上升趋势8。相关研究9 表明，1%5%的妇女经历流产，流产的频率越高，复发性流产的发病率就越高，且有一部分流产的发生原因至今不明，严重影响患者的身心健康。因此，积极探索与复发性流产相关的因素有助于进一步了解疾病，指导临床早期诊断及治疗。HIF-1 是缺氧条件下广泛存在于人体的一种转录因子，可调节多种基因的表达，具有参与红细胞生成、血管形成等生物学效应的功能，同时还对胚胎及胎盘发育起重要作用10，但关于复发性流产患者 HIF-1 蛋白表达水平高低尚存在争议。余艳茹等11-12 报道复发性流产患者 HIF-1 蛋白表达水平高于正常早孕者，但苏倩等13 报道复发性流产患者 HIF-1 蛋白水平低于正常早孕者，这可能与检测孕周不同有关。本研究中观察组绒毛组织 HIF-1 蛋白阳性表达率高于对照组，表明复发性流产患者中 HIF-1 蛋白呈高表达。本研究还发现，观察组绒毛组织 VHL 蛋白阳性表达率低于对照组，且观察组 HIF-1 蛋白表达与 VHL蛋白表达呈负相关，表明在复发性流产患者中 VHL 蛋白低表达，且其与 HIF-1 蛋白水平密切相关，可能共同参与了复发性流产的发生。VHL 作为一种肿瘤抑制基因，可调控血管的生成，而胚胎及胎盘的生长发育与血管生成密切相关14。VHL 的关键组成部分 E3 连接酶复合体可泛素化和降解 HIF-1 蛋白，VHL 蛋白水平升高会加快 E3 连接酶复合体，从而降低 HIF-1蛋白的表达，VHL/HIF-1 信号通路对胚胎的发育和101娄欢，等 复发性流产患者绒毛组织 HIF-1、VHL 蛋白的表达及其临床意义表 3两组临床资料比较Tab 3Comparison of clinical data between the observation group and the control group临床资料观察组(n=83)对照组(n=80)2或 t 值P 值年龄/岁30 36 5 5429 25 4 781 3670 173孕前 BMI24 0 kgm2/例是39(46 99)34(42 50)否44(53 01)46(57 50)0 3320 565合并高血压/例是9(10 84)7(8 75)否74(89 16)73(91 25)0 2020 653孕妇被动吸烟/例是12(14 46)3(3 75)否71(85 54)77(96 25)4 3820 036丈夫饮酒/例是26(31 33)17(21 25)否57(68 67)63(78 75)2 1290 145人工流产3 次/例是21(25 30)10(12 50)否62(74 70)70(87 50)4 3340 037作息不规律/例是28(33 73)16(20 00)否55(66 27)64(80 00)3 9000 048HIF-1 蛋白阳性表达/例62(74 70)33(41 25)18 7450 001VHL 蛋白阳性表达/例27(32 53)49(61 25)13 5020 001注:括号内为百分比表 4复发性流产发生的影响因素分析Tab 4Analysis of influencing factors of recurrent abortion因素SEWald 2P 值O95%CI孕妇被动吸烟0 8280 5712 1030 0962 2890 612 4 587人工流产3 次1 3270 4628 2500 0063 7702 294 5 872作息不规律0 9800 3786 7220 0212 6641 593 4 998HIF-1 蛋白阳性表达1 0920 3559 4620 0042 9801 619 5 347VHL 蛋白阳性表达0 4350 1627 2100 0090 6470 458 1 157机体组织的生长等均有重要的调控作用15。本研究进一步采用 Logistic 回归分析复发性流产发生的影响因素，结果显示 HIF-1 蛋白阳性表达增高是危险因素，VHL 阳性表达是保护因素。妊娠成功与否取决于有无足够的绒毛血管提供充足的血供，在妊娠早期子宫胎盘界面血管生成较慢，母体血供尚处于缺乏状态，HIF-1 蛋白水平偏低，此时胚胎处于相对低氧环境，适度低氧可诱导血管分化，促进滋养细胞发育，但若过度缺氧，HIF-1 蛋白表达异常升高，以上调节机制可能会发生紊乱，导致血管和滋养细胞分化失败11。徐201东南大学学报(医学版)2023 年 2 月，42(1)峰等16 报道，HIF-1 蛋白表达水平过度增高可导致下游因子活化，还可刺激 Fas/FasL 的表达，抑制滋养细胞增殖分化，促进细胞凋亡，导致流产。VHL 蛋白具有调节细胞周期及保持微血管稳定性的功能，可调节细胞周期依赖性激酶抑制剂蛋白的稳定性，当其水平异常降低时可致使胚胎滋养细胞及血管发育不稳定，从而导致绒毛血管生成和血管生成因子异常表达，引发流产17。另郝乐乐等18 报道，VHL 蛋白缺失可抑制 HIF-1 蛋白的降解，通过 VHL/HIF-1 通路可促进小鼠胎盘血管生成，减少流产率。此外，本研究结果显示，人工流产3 次、作息不规律均是复发性流产的危险因素，与既往国内外报道相符19-20。作息不规律等不良生活习惯可造成胎儿脑细胞损伤，使脑细胞发育停止，引发胎儿脑组织功能障碍受损，影响其生长发育，从而引发流产;多次人工流产可损伤子宫内膜，使子宫内膜变薄，影响胚胎的发育，从而导致复发性流产。所以应针对复发性流产患者加强相关知识教育，针对上述危险因素积极进行干预，以达到降低其复发性流产发生风险，提高成功妊娠率的目的。综上所述，VHL 蛋白表达在复发性流产患者绒毛组织中下调，而 HIF-1 蛋白表达上调，两者表达呈负相关，且可能参与复发性流产的发生。参考文献 1AKBAI S，SHAHSAVA F，KAAMI，et al ecurrentspontaneous abortion(SA)and maternal KI genes:a com-prehensive meta-analysisJ JBA Assist eprod，2020，24(2):197-213 2袁惠芝，郑玉华，冯敏清，等 复发性流产与调节性 T 细胞及 IL-10 的相关性分析J 现代医学，2019，47(12):1487-1490 3 DEVALL A J，COOMAASAMY A Sporadic pregnancy lossand recurrent miscarriageJ Best Pract es Clin ObstetGynaecol，2020，69(2):30-39 4徐英姬，周红燕 补肾化瘀固胎方辅助治疗复发性流产血栓前状态的临床观察J 中国中医药科技，2021，28(4):669-671 5李光苗，陈飞，王燕 丹参川芎嗪与硫酸镁对妊娠期高血压疾病大鼠的治疗效果及对胎盘组织缺氧诱导因子-1、可溶性血管内皮生长因子受体-1 表达的影响 J 解剖学杂志，2021，44(5):389-393 6HOEFFLIN，HALANDE S，SCHFE 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