基于网络药理学研究四物汤对阿尔茨海默病的作用机制及实验验证.pdf

基金项目：国家自然科学基金项目（）；中央高校基本科研业务费专项资助项目（）；中医药传承与创新“百千万”人才工程项目（岐黄工程）岐黄学者项目；国家重点研发计划项目（）基于“道术结合”思路与多元融合方法的名老中医经验传承创新研究作者简介：张秀文（），女，博士研究生在读，研究方向：脑病，：通信作者：时晶（），女，博士，主任医师，研究方向：脑病，：中药研究基于网络药理学研究四物汤对阿尔茨海默病的作用机制及实验验证张秀文魏明清倪敬年李婷时晶田金洲（北京中医药大学东直门医院，北京，）摘要目的：基于网络药理学方法，探讨四物汤治疗阿尔茨海默病（）的作用机制。方法：通过中药系统药理学数据库（）得到四物汤中药物的化学成分，并预测其作用靶点，使用 构建成分 靶点图，从 和 数据库得到 的疾病靶点，构建蛋白质相互作用网络（），进行基因本体（）与基因相互作用（）富集分析；并通过体外细胞实验进行初步验证。结果：网络药理学研究共得到四物汤活性成分 个，潜在靶点 个。构建 网络并进行拓扑学分析，前 位核心靶点有蛋白激酶 （）、胱天蛋白酶 （）、原癌基因（）、肿瘤坏死因子（）、前列腺素内过氧化物合酶 （）。富集结果显示，其主要与神经元凋亡过程的正调控等生物过程有关，可能作用于细胞凋亡、样受体（）信号通路等。体外实验显示，四物汤能够显著增加 细胞淋巴瘤 （）的表达。结论：本研究说明了四物汤对 多靶点、多通路的整体调节特点，总结了应用四物汤的理论依据，初步揭示了可能的分子机制，为后续的临床应用和实验研究以更进一步的理论支持。关键词阿尔茨海默病；四物汤；网络药理学；血证；作用机制；中医；细胞；凋亡 ：，（，）：（）：（），（）（），（）（）：（），（），（），（），（）（）：，；中图分类号：；文献标识码：阿尔茨海默病（，）是一种慢性进行性的神经退行性疾病，是导致痴呆的最常见的原因，占痴呆患者总数的 。年国际阿尔茨海默病协会估计：全世界有超过 万的痴呆症患者，到 年将增加到 亿 。随着老龄化社会的到来，预测 年我国的患病人数将超过 万 。这将给社会、医疗和家庭带来沉重的负担。同时，的发病机制尚未完全明确，目前已知的发病机制有 淀粉样蛋白（，）异常沉积、蛋白过度磷酸化导致的世界中医药 年 月第 卷第 期神经纤维缠结（，）、神经炎症反应、线粒体功能障碍、氧化应激以及细胞凋亡等 。但不幸的是，针对单一发病机制的一系列药物研究在临床试验阶段都没有获得很好的临床效果 。故而目前认为 是由多因素共同作用引起的，治疗也应当针对多种因素进行多靶点治疗。中医以整体观念和辨证论治为基本特点，是一种多靶点治疗的方法，随着近年来国外药物研究的失败，中医疗法受到了广大医务工作者的关注。阿尔茨海默病是由髓减脑消、神机失用所导致的神智异常疾病，属于中医学的“痴呆病”，临床以呆傻愚笨、智力低下、善忘等为主要表现 ，病性为本虚标实，本虚在于肾精不足，标实在于痰浊、瘀血蒙蔽脑窍 。阿尔茨海默病的中医诊疗共识 指出 早期以肾虚为主；中期痰、瘀、火并现；晚期为痰、瘀、火日久而化生毒浊所致，治疗方面当遵循补肾原则，分期辨证治疗 。四物汤，出自宋代的 太平惠民和剂局方，主要记载用于妇产科疾病，主要作用为补血和活血，由熟地黄、白芍、当归、川芎等中药组成，逐渐被后世医家认为“可治一切血证”“血证立法”。基于现代药理研究和临床应用研究，基于“虚”“瘀”的病机，四物汤被认为可用于多类病的治疗 。本文探析从“血”论治 的理论依据，并利用网络药理学方法对“调理一切血证”的四物汤用于 的作用机制进行全面研究 ，为后续研究的开展提供依据。材料与方法 材料 细胞人神经母细胞瘤细胞系（细胞株）（由北京中医药大学东直门医院实验室提供）。药 品 四 物 颗 粒（吉 泰 安，批 号：）；盐 酸 多 奈 哌 齐 片（安 理 申，批 号：）。试剂与仪器人工合成 （）（万生昊天，型号：），高糖培养基（，）（，美国，货号：），澳洲胎牛血清（，美国，货号：），青 链霉素溶液（，美国，货号：），试剂盒（碧云天，货号：），检测试剂盒（日本同仁化工，日本，货号：），聚偏二氟乙烯膜（，）（，美国，货号：），细胞淋巴瘤 （，）抗体（，货号：），二抗（，美国，货号：），恒湿培养箱（，新加坡，型号：），离心机（，德国，型号：），倒置显微镜（，日本，型号：），多功能酶标仪（，美国，型号：）。方法 四物汤活性成分筛选使用中药系统药理学数据库与分析平台（，）检索四物汤中白芍、熟地黄、当归、川芎四味中药的所有活性成分。筛选标准为口服生物利用度（，）和类药性（，），同时查阅文献，对四物汤的活性成分进行补充。四物汤“成分 靶点”网络构建 数据库获取四物汤中各个中药的活性成分对应的作用靶 点 信 息。通 过 数 据 库（：）得到四味中药的有效活性成分的标准 号，导入 数据库（：）进行靶点预测，选取 的作用靶点。整合 个数据库所收集到的所有靶点信息并进行去重。通过 数据库（：）查询标准化靶点蛋白名称及对应的人类基因名称，物种选择为“”。将活性成分和靶点导入 软件，构建药物 活性成分 靶点网络。疾病靶点获取及关键靶点筛选在 数据库（：）和 数据库（：）中以“”为关键词进行检索，在 数据库检索结果中选择关联分数（）的疾病靶点，对最终获得 个数据库中的疾病靶点进行整合并去重。最后通过 数据库（：）查询标准化靶点蛋白名称及对应的人类基因名称。通过微生信（：）绘制四物汤活性成分靶点和阿尔茨海默病靶点的韦恩图。蛋白质蛋白质相互作用（，）网络构建将四物汤与 的共同靶点导入 数据库（：），使用“”，物种选择“”，最低相 互 作 用 评 价 阈 值 选 择“（）”，并隐藏网络中没有链接的节点，获得潜 ，在靶点的 网络。再将获得结果导入 软件进行拓扑学分析并构建核心靶点（值前 ）的 网络。基因本体（，）与京都基因和基因组百科全书（，）富集分析利用 （：）对获得的潜在靶点进行 富集分析和 通路富集分析，进一步说明四物汤对应的潜在靶点在基因功能和通路中的作用，导出富集分析结果并绘制 柱状图和 点图。分组与模型制备 干预 建立细胞损伤模型，分为对照组（）、模型组（）、四 物 颗 粒 组（四 物 颗 粒 ）和 多 奈 哌 齐 组（多奈哌齐 ）组。干预方法使用 培养基将四物颗粒与盐酸多奈哌齐片分别稀释为 和 ，细胞贴壁后更换为含四物颗粒或盐酸多奈哌齐 的培养基，干预 。检测指标与方法 活力检测取对数生长期的细胞按 孔接种于 孔板中，过夜贴壁后进行分组干预，后每孔加入 的 试剂，放置于 恒温，恒湿的培养箱中避光孵育 ，使用酶标仪于 波长处读取每孔的吸光度（，）。蛋白质免疫印迹法检测细胞中裂解得到的匀浆，置于，离心 ，取上清，经 试剂盒定量。用 的凝胶电泳（，）分离蛋白，转移至 膜，使用快速封闭液封闭，然后在与特异性一抗孵育过夜：细胞淋巴瘤（，。随后使用含吐温 的 清洗次，次，然后与二抗（）室温下孵育 ，然后免疫反应条带可视化，使用分析软件（）进行分析。统计学方法采用 统计软件对研究数据进行统计分析，实验数据以均数 标准差（珋 ）表示，组间比较使用单因素方差分析，方差齐性用采用 检验；方差不齐性使用 检验。以 为差异有统计学意义。结果 四物汤活性成分筛选借助 数据库和查阅文献共搜集白芍化合物 个，熟地黄化合物 个，当归化合物 个，川芎化合物 个，去重后共得 个。见表 。表 四物汤各药物活性成分药物编码化合物口服生物利用度（）类药性代称白芍 ，（芍药新苷）（芍药苷元）（，），（芍药苷）（芍药苷 ）（芍药内酯苷 ）（苯甲酰芍药苷）（白桦脂酸）（谷甾醇）（谷甾醇）（山柰酚）（）（儿茶素）川芎 （亚油酸乙酯）（杨梅酮）（川芎哚）（洋川芎醌）（川芎萘呋内酯）（谷甾醇）熟地黄 （植物甾醇）（谷甾醇）当归 （植物甾醇）（谷甾醇）世界中医药 年 月第 卷第 期 药物 活性成分 靶点网络构建最终获得活性成分靶点 个、白芍 个、熟地黄 个、当归 个、川芎 个，构建药物 活性成分 靶点网络，主要活性成分有植物甾醇、山柰酚和 谷甾醇等，节点面积越大，值越大。见图 。图 四物汤 活性成分 靶点网络注：白芍，川芎，熟地黄，当归；白芍、川芎、熟地黄共有活性成分，白芍、当归共有活性成分，当归、熟地黄共有活性成分 疾病靶点获取及与四物汤靶点交集预测获得四物汤靶点 个。获得疾病靶点 个。其中，疾病靶点 个，四物汤作用靶点 个，共有靶点 个。见图 。图 四物汤靶点与疾病靶点的韦恩图 网络构建共有相互作用连线 条，节点 个，其中浅蓝色线表示从已知数据库得来的，紫色线代表经拓扑学分析获得 值前 的核心靶点信息。见图 。其中蛋白激酶 （，）、胱天蛋白酶 （，）、原癌基因（，）、肿瘤坏死因子（，）、前列腺素内过氧化物合酶 （，）为 值前 位。见表 、图 。图 四物汤和阿尔茨海默病潜在靶点 网络表 值前 的核心靶点序号基 值序号基因 值 图 网络核心靶点（）注：由上至下为 值由大至小 富集分析经富集分析，生物过程（，）显著富集在药物反应、雌二醇反应、脂多糖介导的信号通路、神经元凋亡过程的正调控、一氧化氮合成过程的正调控等。见图 。细胞 ，组分（，）显著富集在细胞质、小凹、线粒体、细胞膜、轴突、神经元胞体、细胞核、神经元投射等。见图 。分子功能（，）显著富集在酶结合、蛋白质同源二聚化活性、血红素结合、激酶活性、药物结合、蛋白复合物结合、蛋白结合、蛋白激酶活性、类固醇激素受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与凋亡过程等。见图 。图 四物汤 富集分析生物过程注：颜色代表 值，红色表示 值显著图 四物汤 富集分析细胞组分注：颜色代表 值，红色表示 值显著图 四物汤 富集分析分子功能注：颜色代表 值，红色表示 值显著 通路富集分析与 密切相关的通路 个，包括 信号通路、多巴胺能神经突触、促分裂原活化的蛋白激酶（，）信号通路、血管内皮生长因子（，）信号通路、细胞受体信号通路、细胞凋亡、样受体（，）信号通路等。见图 。图 四物汤 通路富集 点图注：圆点大小代表基因数，圆点面积越大，基因越多；颜色代表 值，红色表示 显著 四物颗粒对 致 细胞活力的影响与 组比较，其余组的细胞活力 值差异有统计学意义（），四物颗粒组与多奈哌齐组与对照组比较，差异无统计学意义（）。见图 。图 四物颗粒对 诱导的 细胞活力的影响（）注：四物颗粒；多奈哌齐；与对照组比较，；与 比较，世界中医药 年 月第 卷第 期 四物颗粒对 致 细胞 的影响与 组比较，四物颗粒显著增加 的表达（），与对照组比较，差异无统计学意义（）。见图 。图 四物颗粒对对 诱导的 细胞 表达的影响（）注：四物颗粒；多奈哌齐；量化分析；和 代表性蛋白免疫印迹；与对照组比较，；与 比较，讨论 是痴呆最常见的原因之一，临床以认知障碍为特征，记忆障碍最为突出 。随着目前针对单一作用机制研发的药物的失败，越来越多的研究者认为 为多因素共同作用的疾病，包括 异常沉积、蛋白过度磷酸、神经炎症反应、线粒体功能障碍、氧化应激以及细胞凋亡等 。因此，目前迫切需要寻找多靶点、多通路的治疗方法。中医的整体观念在这一方面优势明显，田金洲教授以补肾为主，分早（补肾精、益脾气）、中（泻火、祛瘀、化痰）、晚期（解毒通络）辨证治疗痴呆的方式取得了很好的临床效果 。这显示了中医在防治 领域的广阔前景。四物汤是一切血证的立法方剂，活血而不伤血，补血而不滞血，实为 患者见血虚血瘀证者的良方，研究显示，盐酸多奈哌齐联合以四物汤为立法的养血清脑颗粒比单用盐酸多奈哌齐能够更好地改善患者的记忆力，尤其是在回忆、再认及背数方面，能更有效地提高简易智能状态评定表评分和神经精神症状问卷评分 。本研究从 中得到的主要活性成分有芍药苷、山柰酚、谷甾醇、谷甾醇、儿茶素、亚油酸乙酯、杨梅酮、川芎哚、洋川芎醌等。已有研究显示，芍药苷显著抑制了 诱导的 质细胞一氧化氮的产生并通过调节核因子 通路抑制炎症介质的产生 ，从而改善炎症反应。山柰酚在中枢神经系统疾病中有抗氧化作用，并对 的形成和聚集起调节作用 ；川芎哚及其类似物具有一定的降低血液黏度及改善血液流变学的作用 。通过构建 网络得到四物汤和 的 个共同靶点基因，拓扑学分析 值前 位的有 、。等 研究显示，脑 磷酸化与 的神经病理和认知功能下降有关；已被确定为神经元细胞死亡的关键中介因子，并被认为是 早期药物治疗的潜在靶点 ；则是参与神经炎症反应的主要炎症介质；蛋白连接到 上组成的 参与细胞生长、细胞增殖、细胞调亡等多种细胞活动 。富集分析表明药物反应、丝氨酸肽基磷酸化、脂多糖介导的信号通路、神经元凋亡过程的正调控、一氧化氮合成过程的正调控等多个生物过程与四物汤作用于 有关。通路富集分析发现作用靶点主要富集在 信号通路、多巴胺能神经突触、信号通路、信号通路、细胞受体信号通路、细胞凋亡、信号通路等，这表明四物汤对 的干预是多靶点、多通路的。和辅受体被激活可诱导 摄取或炎症反应，纤维性 可与 、和 直接作用，在 开始阶段可以促进对 吞噬作用，但在后期增加或加速神经元凋亡 ，并有研究表明，神经干细胞移植能够抑制 转基因小鼠小胶质细胞上 介导的炎症通路激活 。被激活后，可使核因子 和其他蛋白激酶等多种底物磷酸化，在细胞凋亡过程中起重要作用 。黄德弘等 研究显示，加味当归芍药散可抑制 大鼠模型的炎症介质及磷酸化 信号分子的过表达，从而抑制脑内炎症。经细胞实验初步验证显示，四物颗粒能够显著增加 诱导的 细胞模型的活力以及抗凋亡蛋白 的表达。以上研究表明，四物汤可能通过多靶点介导的多个重要信号通路发挥对 的治疗作用。本研究探讨中医“血证”理论防治阿尔茨海默病的理论基础和现代理论依据，发现呆病本质仍是“虚”，瘀血是其不可忽视的主要病理因素之一，所以，虚瘀合证者，补血活血的四物汤是防治呆病的良方。此外，本研究通过网络药理学探索四物汤多成分、多靶点、多通路防治 的作用机制，发现四物汤的活性成分可能通过抗氧化、抗细胞凋亡、减少炎症反应和保护神经元细胞等机制发挥治疗 的作用。因此，对四物汤防治 的深入研究是具有临床意义的，后续需要进一步进行实验验证，为阿尔茨海默病的防治提供新的方法。，利益冲突声明：无。参考文献 ，（）：，：，：王英全，梁景宏，贾瑞霞，等 年中国阿尔茨海默病患病情况预测研究 阿尔茨海默病及相关病，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：世界中医药学会联合会，中华中医药学会 国际中医临床实践指南阿尔茨海默病（）世界中医药，（）：闫敬来，陈燕清 老年痴呆病机的中医学认识概述 中华中医药杂志，（）：阿尔茨海默病中医诊疗联合共识小组 阿尔茨海默病的中医诊疗共识 中国中西医结合杂志，（）：张则业，杨佳迪，颜倩，等 基于网络药理学结合体内实验研究探讨四物汤的植物雌激素样效应及其分子机制 中国中药杂志，（）：世界中医药学会联合会 网络药理学评价方法指南 世界中医药，（）：，（）：李陶然，周小青，刘宏栋，等 治疗阿尔茨海默病的皂苷类成分及其作用机制研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：袁玉娇，时晶，田金洲 田金洲分期治疗痴呆经验 北京中医药，（）：刘南，邓艳春，周彬，等 多奈哌齐联合养血清脑颗粒改善轻度认知功能障碍的效应 中风与神经疾病杂志，（）：程新旺，臧大维 养血清脑颗粒联合多奈哌齐对 患者认知功能及精神行为学异常的影响 山东医药，（）：，（）：，：，：周昊言，孙若岚，季千惠，等 基于网络药理 分子对接解析川芎赤芍药对干预脑缺血的作用机制 中国中药杂志，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，（）：，（）：李雅莉，杨翠翠，张兰 参芪醒脑浸膏对阿尔茨海默病模型小鼠认知功能障碍的改善作用及机制研究 中国医药，（）：黄德弘，刘孟渊，闫小峰 加味当归芍药散对纤丝状 诱导脑内炎症因子及磷酸化 信号分子表达的影响 中国实验方剂学杂志，（）：（收稿本文编辑：吴珊）世界中医药 年 月第 卷第 期