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糖尿病与并发症 糖尿病新世界 2023年9月DIABETES NEW WORLD 糖尿病新世界基于网络药理学对参芪地黄汤治疗糖尿病视网膜病变的主要活性成分及潜在基因分析林称心，李光智海南省中医院内分泌科，海南海口 570203摘要 目的 运用网络药理学研究方法对参芪地黄汤治疗糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）主要活性成分及核心基因进行分析。方法 采用中药系统药理学分析平台筛选出参芪地黄汤组成药物的有效活性成分及作用靶点基因，通过Gene Cards数据库收集DR疾病基因，然后对药物作用基因及疾病相关基因进行韦恩分析，确定药物作用潜在基因，进而构建蛋白相互作用和活性成分-基因相互作用网络，并进行细胞功能注释和通路富集分析。结果 研究得到了如槲皮素、山奈酚、豆甾醇、-谷甾醇和异鼠李素等179种可直接作用于DR疾病基因的活性成分，以及丝氨酸/苏氨酸激酶1、肿瘤坏死因子-、白细胞介素-1、白细胞介素-6、血管内皮生长因子等 143个潜在基因，并通过通路富集分析确定了 101条作用通路，细胞功能注释确定了976种细胞功能。结论 参芪地黄汤中的药物活性成分，可通过调节DR病程中的炎症反应对DR产生治疗效果。关键词 网络药理学；参芪地黄汤；糖尿病视网膜病变；血管内皮生长因子中图分类号 R587.1 文献标识码 A 文章编号 1672-4062（2023）09（b）-0179-04Analysis of the Main Active Ingredients and Potential Genes of Shenqi Dihuang Decoction in Treating Diabetic Retinopathy Based on Network PharmacologyLIN Chengxin,LI GuangzhiDepartment of Endocrinology,Hainan Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Haikou,Hainan Province,570203 ChinaAbstract Objective To use network pharmacology research methods to analyze the main active ingredients and core genes of Shenqi Dihuang Decoction in treating diabetic retinopathy(DR).Methods The traditional Chinese medicine systems pharmacology analysis platform was used to screen out the effective active ingredients and target genes of the drugs composed of Shenqi Dihuang Decoction.DR disease genes were collected through the Gene Cards database,and then Wayne analysis was performed on drug-action genes and disease-related genes to determine potential genes for drug action.Then,protein interaction and active ingredient-gene interaction networks were constructed,and cell function annotation and pathway enrichment analysis were performed.Results The study obtained 179 active ingredients that can directly act on DR disease genes,such as quercetin,kaempferol,stigmasterol,-sitosterol and isorhamnetin.As well as 143 potential genes such as serine/threonine kinase 1,tumor necrosis factor-,interleukin-1,interleukin-6,and vascular endothelial growth factor.And 101 action pathways were identified through pathway enrichment analysis,and 976 cell functions were identified through cell function annotation.Conclusion The active pharmaceutical ingredients in Shenqi Dihuang Decoction can produce therapeutic effects on DR by regulating the inflammatory response in the course of DR.Key words Network pharmacology;Shenqi Dihuang Decoction;Diabetic retinopathy;Vascular endothelial growth factorDOI：10.16658/ki.1672-4062.2023.18.179基金项目 海南省卫生健康行业科研项目（21A200392）。作者简介 林称心（1983-），女，本科，副主任医师，研究方向为中西医结合治疗内分泌疾病。179 糖尿病与并发症 糖尿病新世界 2023年9月糖尿病新世界 DIABETES NEW WORLD糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病的主要并发症之一，可导致患者视力下降，甚至失明，是糖尿病患者致残的主要原因之一1。在中医学理论里 DR 属于“消渴目病”范畴，是因素体阴虚，虚火旺盛，耗气伤津致使目睛失养所引发的疾病2。所以治疗上应当扶正固本、益气养阴。参芪地黄汤就是基于这一治法开发而来。参芪地黄汤的前期临床随机对照研究表明，DR 患者规律服用该方 12 周，能显著降低眼底检查评分3。然而，由于参芪地黄汤治疗DR的作用机制尚未明确，这也限制了该方的进一步推广。为初步探讨参芪地黄汤治疗 DR 的机制，给进一步的实验室研究做好前期铺垫。本研究采用网络药理学方法，分析出了参芪地黄汤治疗 DR 的药物-化合物-靶基因机制，现报道如下。1 材料与方法1.1 参芪地黄汤主要活性成分和药物作用靶基因的筛选本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）(http:/ 选 条 件 设 置 为 口 服 利 用 度 30%和 类 药 性 0.184。此外，本研究还通过 TCMSP 检索出活性成分的靶基因。1.2 DR疾病基因的获取以及交集基因的筛选本 研 究 通 过 基 因 卡 数 据 库（https:/www.genecards.org/）中输入关键词：Diabetic Retinopathy，检索DR的疾病基因并建立数据集。然后将疾病基因与 1.1 筛选出的药物靶基因取交集，得到两者的交集基因，并利用文氏图展示。1.3 交集基因中的核心基因筛选STRING 数据库(http:/string-db.org)能够通过人类已知的蛋白相互作用信息，预测出所检索蛋白中的核心蛋白5。基于这一点，本研究通过 STRING数据库建立交集基因的蛋白互作网络（protein-protein interaction network,PPI）（参数设置为：a.物种限制为人类；b.隐藏游离点；c.设定置信度0.7；d.其他保持默认设置），对交集基因进行分析，获取蛋白相互作用，并保存其 TSV 格式文件，最后将 TSV格式文件导入 Cytoscape3.9.0 软件绘制 PPI网络，用于后续进一步分析。1.4 中药名-活性成分-交集基因网络的建立为了筛选参芪地黄汤治疗 DR 的关键活性成分，本研究将 1.1 和 1.2 部分得到的中药、中药活性成分和交集基因导入Cytoscape3.6.1软件建立药物-活性成分-交集基因的相互作用网络关系图，并利用该软件中的 CytoNCA 插件分析网络节点的相关拓扑参数。1.5 交集基因的细胞功能注释分析与通路富集分析为获取交集基因的细胞功能注释和信号通路富集分析结果，本研究最后再将 1.2 获取的交集基因导入DAVID在线工具（https:/david.ncifcrf.gov/）进行分析。2 结果2.1 参芪地黄汤有效成分及药物靶点的筛选结果在 TCMSP 数据库本研究共检索到 179 种参芪地黄汤主要活性成分，并获得这些活性成分作用的靶基因320个。2.2 疾病基因和交集基因的筛选结果通过 Gene cards 数据库本研究收集到 DR 的疾病基因3 834个，与2.1的药物基因进行交集分析后得到交集基因143个。2.3 核心基因的筛选结果本研究将 2.2 中获得的交集基因导入 STRING数据库，建立 PPI互作网络。随后将获得的数据录入 Cytoscape 进行网络分析，得到 143 个节点，2 873条边。使用 Cytoscape NCA 插件计算 Betweenness unDir、Closeness unDir、Degree unDir 值，值越高说明该节点在 PPI 网络中越核心4。其中前 5 个核心基因为丝氨酸/苏氨酸激酶1（protein kinase B,AKT1）、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-alpha,TNF-)、白细胞介素-1(interleukin-1 beta,IL-1)、血管内 皮 生 长 因 子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)。2.4 中药-活性成分-交集基因网络本研究利用 Cytoscape 3.9.0 软件，构建了一个包含中药名-活性成分-交集基因的关系网络。通过对该网络的拓扑分析，发现度值最高的前五个活性成分分别是槲皮素、山奈酚、豆甾醇、-谷甾醇和异鼠李素。2.5 细胞功能注释及通路富集分析结果在 DAVID 平台，本研究根据错误发现率（false 180 糖尿病与并发症 糖尿病新世界 2023年9月DIABETES NEW WORLD 糖尿病新世界discovery rate,FDR）0.01 分别对 143 个交集基因的细胞功能和通路富集情况进行了分析。结果显示：细胞功能共有 976 种，其中涉及生物过程的有 767种；涉及细胞组成的有 81 条；涉及分子功能的有128 条。通路富集分析方面，本研究还找到了 101条信号通路，根据FDR由小到大排名前十的有癌症通路、糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体信号通路、脂质与动脉粥样硬化、流体剪切力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、胰腺癌、癌症中的蛋白聚糖、前列腺癌、内分泌耐药、膀胱癌。根据 FDR0.01 分别列出了前 10 条 GO 条目和 KEGG 通路，见表1、表2。3 讨论在本研究中，通过 Cytoscape 3.9.0 软件筛选出的参芪地黄汤治疗 DR度值最高的前 5个活性成分为槲皮素、山奈酚、豆甾醇、-谷甾醇、异鼠李素。其中，槲皮素被发现可以对 DR 模型小鼠的炎症反应产生抑制作用，而且该研究还指出，这种作用是通过抑制 TNF-、IL-6 和 IL-1 产生的，这与本研究的研究结论基本一致，从侧面证实了本次研究的可靠性6。山奈酚有研究证实靶向调控 VEGF，抑制 AKT1/外来信号调节激酶 1/2信号通路的激活从而对 DR 产生治疗作用7。异鼠李素也有研究发现可以通过抑制线粒体蛋白激酶/核因子-B 信号通路，减轻 DR 大鼠视网膜损伤及细胞凋亡8。而豆甾醇和-谷甾醇对于DR的干预作用，目前暂无相关研究报道，可以作为下一步的研究方向。通过 PPI 网络图，本研究筛选出参芪地黄汤治疗 DR 的前 5 个核心基因为 AKT1、TNF-、IL-1、IL-6、VEGF。AKT1 属于蛋白激酶 B 家族，是磷脂酰肌醇 3-激酶下游信号通路的主要效应器之一，对调节糖脂代谢具有重要作用，根据其不同功能，AKT 还可细分为 AKT1、AKT2 和 AKT3 三个亚型。在这些亚型中，AKT1在人体各类组织器官中表达广泛9。AKT1通过与同源结构域的信号蛋白和磷脂酰肌醇依赖激酶结合，并与磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸结合，从而转移到细胞膜上，调节细胞的糖原合成、糖异生和葡萄糖摄取10。这些功能使得AKT在细胞内维持糖平衡方面扮演着关键的调节者角色。所以AKT对人体糖代谢有着重要影响，参芪地黄汤可能通过对该基因的调控，稳定糖代谢，从而对DR产生治疗效果11。最近的研究表明，炎症反应在 DR 病程中扮演着重要角色，许多炎症因子例如：TNF-、IL-1、IL-6和VEGF等都对DR的发展起着促进作用12。TNF-是机体炎症反应的先导因子，一旦TNF-与其特异性受体结合，便能够通过促进其他炎 症 因 子 的 释 放，从 而 介 导 炎 症 反 应 过 程13。TNF-广泛分布于视网膜组织中的血管内皮细胞，激活后会提高视网膜血管通透性，并加速血管内皮细胞增殖及血管外基质形成14。一份临床队列研究显示，DR 患者的泪液中 TNF-水平显著超过健康人水平，并且TNF-水平与视网膜病变程度正相关15。IL-1 和 IL-6 同属于趋化因子家族。过度释放的 IL-1 和 IL-6 可能是视网膜疾病发展的一个表1潜在基因的细胞功能注释结果（FDR0.01）类别生物学过程分子功能生物学过程生物学过程生物学过程细胞组分分子功能生物学过程生物学过程生物学过程编号0010628001989900430650043066000941000056150042802000166600082840045893名称基因表达的正向调节酶结合细胞凋亡过程的正向调节细胞凋亡过程的负向调节对异物刺激的反应细胞外空间同源蛋白结合对缺氧的反应细胞增殖的正向调节DNA模板转录的正向调节基因数37312732235149192932FDR4.4410-221.1410-197.0810-177.0810-176.5910-151.2910-142.8810-146.6910-149.1010-143.3710-13表2通路富集分析结果（FDR0.01）编号hsa05200hsa04933hsa05417hsa05418hsa05161hsa05212hsa05205hsa05215hsa01522hsa05219名称癌症通路糖尿病并发症中的高级糖基化终末产物-受体信号通路脂质与动脉粥样硬化流体剪切力和动脉粥样硬化乙型肝炎胰腺癌癌症中的蛋白多糖前列腺癌内分泌耐药膀胱癌基因数54293328251927202015FDR7.2910-275.9510-267.8610-211.1710-201.6810-152.4410-152.7110-151.1010-141.1910-141.3710-14181 糖尿病与并发症 糖尿病新世界 2023年9月糖尿病新世界 DIABETES NEW WORLD重要潜在因素。据目前的报道，两者可能通过以下几种生物学机制对 DR 产生影响：促进炎症反应，不少研究显示 IL-1 和 IL-6 会促进其他炎症因子的表达以及炎性细胞的募集，从而加重视网膜组织的炎性损伤16；提高视网膜通透性，导致视网膜水肿。IL-1 和 IL-6 可以作用于多种细胞信号通路，从而降低紧密连接蛋白的表达以及减少血管紧张素水平，打破血管收缩平衡，从而造成视网膜血管内皮细胞损伤，最终导致视网膜通透性增加17。VEGF是一种具有高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对DR的影响主要体现在两个方面：能增加血管通透性，导致视网膜水肿18；提高视网膜局部细胞间粘附分子和其它活性物质的释放，导致血管内皮细胞增殖，促进视网膜新生血管生成18。综上所述，本研究通过网络药理学研究，对参芪地黄汤治疗 DR 的作用机制进行了初步的研究，研究发现了槲皮素、山奈酚、豆甾醇、-谷甾醇、异鼠李素等活性成分以及 AKT1、TNF-、IL-1、IL-6和VEGF等药物作用基因。这些活性成分和基因均有相关文献报道与 DR 紧密相关，从侧面证明了本次研究结果的可靠性。参考文献1 中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2017年版)J.中华糖尿病杂志,2018,10(1):4-67.2 张瀚文,石岩.糖尿病视网膜病变中医病机初探J.辽宁中医药大学学报,2018,20(2):121-123.3 林称心,李光智.胰岛素联合参芪地黄汤治疗糖尿病视网膜病变疗效及对血清 C 肽、HbA_(1c)水平的影响J.山东医药,2019,59(14):49-51.4 邓玉勇,赵颀涵,李姗.基于网络药理学研究葛根及半夏对2型糖尿病的改善机制J.糖尿病新世界,2023,26(8):84-90.5 Ellis J,Lewicki M.Cosmic string interpretation of NANOGrav pulsar timing dataJ.Phys Rev Lett,2021,126(4):041304.6 朱素华,张曼,徐圣秋.槲皮素对糖尿病视网膜病变小鼠氧化应激损伤和炎症反应的影响J.药学与临床研究,2023,31(1):48-52.7 Xu XH,Zhao C,Peng Q,et al.Kaempferol inhibited VEGF and PGF expression and in vitro angiogenesis of HRECs under diabetic-like environmentJ.Braz J Med Biol Res,2017,50(3):e5396.8 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