扶正解毒化瘀方通过NLRP...菌慢性肺炎肺损伤的作用机制_崔兰凤.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 588 扶正解毒化瘀方通过NLRP3炎性体减轻多重耐药铜绿假单胞菌慢性肺炎肺损伤的作用机制崔兰凤1，李富增2，王玉婷3，赵世同4，王成祥5（1清华大学附属北京清华长庚医院，清华大学临床医学院，北京 102218；2北京市昌平区中医医院，北京 102200；3北京市和平里医院，北京 100013；4首都医科大学附属北京朝阳医院，北京 100020；5北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）摘要：目的：观察扶正解毒化瘀方通过干预NLRP3炎性体减轻多重耐药铜绿假单胞菌（MDRPA）慢性肺炎肺损伤的作用机制。方法：将大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组、中+西组，通过经口气管插管法建立MDRPA慢性肺炎大鼠模型。中药组予扶正解毒化瘀方灌胃，每次1.4 g/mL，2次/d；西药组予哌拉西林他唑巴坦钠腹腔注射，每8小时1次；中+西组为两药联用。观察各时点肺组织病理变化。通过qPCR和Western blot观察NLRP3炎性体相关指标的基因和蛋白表达。结果：与模型组比较，中药组NLRP3 mRNA和Caspase-1 mRNA水平在第14天和21天显著降低（P0.05），中药组、西药组和中+西组第14天时NLRP3、IL-1蛋白表达水平均显著下降（P0.05）。与模型组比较，中药组在第7、14天肺泡结构更完整，免疫细胞浸润更少，第21天时免疫细胞浸润和纤维细胞形成也更少。结论：扶正解毒化瘀方能明显减轻MDRPA慢性肺炎大鼠肺组织损伤，可能是通过调节NLRP3炎性体的表达而发挥作用。关键词：扶正解毒化瘀方；耐药；铜绿假单胞菌；慢性感染；NLRP3炎性体基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.81573924）Mechanism of Fuzheng Jiedu Huayu Formula on lung injury of chronic pneumonia induced by multidrug resistant pseudomonas aeruginosa through NLRP3 inflammatory bodyCUI Lan-feng1,LI Fu-zeng2,WANG Yu-ting3,ZHAO Shi-tong4,WANG Cheng-xiang5(1Beijing Tsinghua Changgung Hospital,School of Clinical Medicine,Tsinghua University,Beijing 102218,China;2Beijing Changping District Hospital of Traditional Chinese Medicine,Beijing 102200,China;3Beijing Hepingli Hospital,Beijing 100013,China;4Beijing Chao-yang Hospital,Capital Medical University,Beijing 100020,China;5Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital,Beijing 100029,China)Abstract:Objective:To investigate the mechanism of Fuzheng Jiedu Huayu Formula in alleviating lung injury in rats with multidrug resistant pseudomonas aeruginosa(MDRPA)chronic pneumonia by intervening NLRP3 inflammatory body.The rats were divided into the normal group,model group,Chinese medicine group,western medicine group,Chinese+western group randomly.The rat model of MDRPA chronic pneumonia was established by oral tracheal intubation.The Chinese medicine group was given Fuzheng Jiedu Huayu Formula by gavage,1.4 g/mL per time,2 times/d.The western medicine group was given piperacillin tazobactam sodium by intraperitoneal injection,q8 h.The Chinese+western group was given the two medicine.The pathological changes of lung tissues were observed at various time points.The expression of genes and proteins related to NLRP3 inflammatory body was observed by qPCR and Western blot.Results:Compared with the model group,the levels of NLRP3 mRNA and Caspase-1 mRNA in the Chinese medicine group decreased significantly on the 14th and 21st days(P0.05),NLRP3 and IL-1 protein expression decreased significantly in the traditional Chinese medicine group,western medicine group and Chinese+western medicine group on the 14th day(P0.05).Compared with the model group,the Chinese medicine group had more complete alveolar structure,less immune cell infiltration on the 7th and 14th days,and less immune cell infiltration and 论著通信作者：王成祥，北京市朝阳区安定门外小关街51号北京中医药大学第三附属医院，邮编：100029，E-mail： 内文1.indd 5882023/2/10 16:56:51中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 589 铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是院内感染最常见的致病菌之一，且多引起慢性感染。生物膜的形成是慢性感染发生和持续的重要因素1。PA通过生物膜黏附在器械表面，增加院内感染发生率，研究显示呼吸机相关肺炎患者PA分离率为9.3%2。同时，PA存在较高的耐药率。中国细菌耐药监测网显示，2019年PA对碳青霉烯类药物的耐药率已达23.5%27.5%。鉴于PA耐药问题亟待解决，WHO在 2017年将其列为亟需开发新抗菌药的病原菌之一3。固有免疫是机体抵御感染的重要防线，其中NLRP3炎性体（NOD-like receptor 3 inflammatory body，NLRP3）是PA慢性感染引起免疫炎性损伤的重要途径。NLRP3炎性体可感知感染、组织损伤、应激等信号而被激活4。NLRP3和适配器凋亡相关蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）是NLRP3炎性体的基本结构，是激活胱天蛋白酶-1（cysteine-aspartase protease-1，Caspase-1）对ATP和某些毒素的反应所必需。激活后的Caspase-1能诱导产生白介素（interleukin，IL）-1和IL-15-6。同时，该途径与Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子-B（nuclear factor-B，NF-B）通路相互作用，促进炎性反应级联式进展7。扶正解毒化瘀方对于老年耐药菌肺炎作用肯定8-9，并且能作用于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺巨噬细胞，下调NLRP3的表达10。因此本研究建立多重耐药铜绿假单胞菌（multidrug resistant pseudomonas aeruginosa，MDRPA）慢性肺炎大鼠模型，深入探索该方通过调节NLRP3炎性体减轻MDRPA慢性肺炎肺损伤的作用机制。材料1.动物 SPF级雄性SD大鼠200只，68周龄，体质量170200 g。实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0006，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。购置动物在P2实验室适应性喂养1周。温度：18，相对湿度30，光照时间每日8 h。本研究通过北京中医药大学东直门医院伦理委员会审核（伦理批号：17-18）。2.药物、菌株与试剂 扶正解毒化瘀方由黄芩、连翘、漏芦、赤芍、瓜蒌、西洋参、败酱草、薏苡仁组成，由北京康仁堂药业有限公司制备成颗粒剂。MDRPA菌株为临床诊断为多重耐药铜绿假单胞菌肺炎的患者深部呼吸道分泌物标本经分离、培养、纯化、鉴定后获取，-80 冰箱保存。菌株编号：1607106，由北京中医药大学东直门医院检验科细菌室提供。哌拉西林他唑巴坦钠（Piperacillin tazobactam sodium，TZP）（批号：AKGD/11）由Wyeth Lederle S.R.L.生产。TRIzol Reagent（天根，批号：DP424），荧光定量PCR检测试剂盒（Genecopies，批号：AOPR-1200），BCA蛋白定量试剂盒（弗德生物，批号：FD2001）。3.仪器 微量核酸定量仪（Merinton，型号：SMA4000），荧光定量PCR仪（ABI，型号：7500），基因扩增仪（珠海黑马，型号：9600），磁力搅拌器（常州澳华仪器有限公司，型号：HJ-10-A）。方法1.分组、造模与取材 将大鼠随机分为正常组、模型组、中药组、西药组、中+西组，每组40只，每组每个时间点（第3、7、14、21天）10只。正常组大鼠予无菌0.9%氯化钠溶液0.1 mL，其余组予MDRPA海藻酸钠包被体混悬液0.1 mL（1.5107 CFU），经口气管插管建立MDRPA慢性肺炎模型11。中药组予扶正解毒化瘀方灌胃，每次1.4 g/mL，依据大鼠体质量给药，2次/日；西药组予1.8 mL/kg TZP腹腔注射，每8小时 1次；中+西组为两药联用。各组共给药21 d。造模后第3、7、14、21天留取肺组织。2.qPCR检测肺组织NLRP3炎性体的mRNA 水平 向破碎肺组织中加入1 mL的TRIzol Reagent，充分破碎细胞，与三氯甲烷充分混匀，4 下13 000g 离心8 min，与异丙醇混匀后，再次离心10 min，洗涤，获取总RNA。提取总RNA，逆转录后进行PCR反应。qPCR检测的引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，使用2-CT计算mRNA的相对表达量。引物序列见表1。3.Western blot检测肺组织NLRP3炎性体蛋白 水平 提取肺组织蛋白，测定蛋白浓度，上样，电泳，转膜（200 mA，1 h）。进行一抗和二抗免疫反应，曝光，进行显影和定影。将胶片扫描存档，Image J软件处理系统分析目标带的光密度值。fibroblast formation on the 21st day.Conclusion:Fuzheng Jiedu Huayu Formula can significantly reduce the lung injury in rats with chronic pneumonia caused by MDRPA,which may play a role by regulating the expression of NLRP3 inflammatory body.Key words:Fuzheng Jiedu Huayu Formula;Drug resistance;Pseudomonas aeruginosa;Chronic infection;NLRP3 inflammasomeFunding:General Program of National Natural Science Foundation of China(No.81573924)内文1.indd 5892023/2/10 16:56:51中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 590 4.肺组织病理变化观察 将大鼠右肺下叶组织用4%多聚甲醛溶液固定72 h以上，之后梯度乙醇脱水；脱水后在二甲苯中浸泡，透明后浸蜡、包埋，修整蜡块后切片，厚度约为45 m，将切片固定在清洁玻片上。随后将切片烘烤脱蜡，并再次于二甲苯中浸泡以充分脱蜡。之后将切片依次用不同浓度乙醇浸泡，流水冲净；苏木精染色5 min，流水冲洗，1%氨水反蓝，流水冲洗，随后伊红染色，流水冲洗；使用不同浓度乙醇脱水，随后于二甲苯中浸泡以使切片透明。中性树胶封片后光学显微镜下观察肺组织体积、颜色、质地等的变化，肺组织表面有无出血点、结节、实变等改变。5.统计学方法 采用IBM SPSS 21.0统计软件，统计数据以x-s表示。若数据符合正态分布且方差齐，对数据进行单因素ANOVA分析，组间多重比较采用LSD法。若方差不齐，则对数据进行个案排秩后进行单变量分析。如不符合正态分布，则进行非参数检验。以P0.05为差异有统计学意义。结果1.各组大鼠肺组织NLRP3 mRNA表达情况 见图1。在各时间点，模型组NLRP3 mRNA表达水平均显著高于正常组（P0.05，P0.01）。第3天，中药组与中+西组NLRP3 mRNA水平显著低于模型组（P0.05，P0.01）。第14、21天，中药和西药组NLRP3 mRNA水平显著低于模型组（P0.05，P0.01）。2.各组大鼠肺组织NLRP3蛋白水平情况 见图2-图3。第3、7、14、21天时，模型组NLRP3蛋白水平显著高于正常组（P0.05，P0.01），中药组NLRP3蛋白水平显著低于模型组（P0.05）。西药组和中+西药组NLRP3蛋白水平在第3、14天显著低于模型组（P0.05）。图2 各组大鼠不同时点肺组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1蛋白灰度条带图注：1.正常组；2.模型组；3.中药组；4.西药组；5.中+西组。图10同。第3天第14天第7天第21天11113333222244445555NLRP3120 kDaASC22 kDaCaspase-145 kDaIL-117 kDa-actin42 kDa图3 各组大鼠肺组织NLRP3蛋白水平比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天蛋白相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组2.51.50.52.01.003.各组大鼠肺组织Caspase-1 mRNA水平表达 情况 见图4。在各时间点，模型组Caspase-1 mRNA水平均显著高于正常组（P0.05，P0.01），中药组与中+西组Caspase-1 mRNA水平均显著低于模型组（P0.05，P0.01）。第7、14、21天，西药组Caspase-1 mRNA水平均显著低于模型组（P0.05，P0.01）。图4 各组大鼠肺组织Caspase-1 mRNA水平比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天mRNA相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组0241354.各组大鼠肺组织Caspase-1蛋白水平情况 见图2，图5。第3、7、21天，模型组Caspase-1蛋白水平显著高于正常组（P0.01），各治疗组与模型组比较差异无统计学意义。5.各组大鼠肺组织ASC mRNA水平表达 情况 见图6。在各时间点，模型组ASC mRNA水平表1 引物序列基因名称引物序列（5-3）扩增长度（bp）r-GAPDHF：GCA AGG ATA CTG AGA GCA AGA G98R：GGA TGG AAT TGT GAG GGA GAT Gr-NLRP3F：TCA CCC AAG GAG GAA GAA GA 97R：GTC TGG AAG AAC AGG CAA CAr-Caspase-1 F：CCT GTG CGA TCA TGT CAC TAA A84R：GCC AGG TAG CAG TCT TCA TTA Cr-ASCF：TTG CTG GAT GCT CTG TAT GG112R：AGG CTG GAG CAA AGC TAA Ar-IL-1F：GCA GAT GGG CTG TAC CTT ATC101R：GAA ATG GCA AAT CGG CTG AC 图1 各组大鼠肺组织NLRP3 mRNA表达水平比较（x-s，n=3）注：与正常组同期比较，*P0.05，*P0.01；与模型组同期比较，P0.05，P0.01。下图同。第3天第14天第7天mRNA相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组84620内文1.indd 5902023/2/10 16:57:03中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 591 显著高于正常组（P0.05）。第21天，各治疗组ASC mRNA水平均较模型组显著降低（P0.05）。正常组中药组模型组西药组中+西组图5 各组大鼠肺组织Caspase-1蛋白水平比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天蛋白相对表达量第21天2.51.50.52.01.00图6 各组大鼠肺组织ASC mRNA相对表达量比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天mRNA相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组846206.各组大鼠肺组织ASC蛋白水平情况 见图2，图7。在各时间点模型组ASC蛋白水平均显著高于正常组（P0.01，P0.05）。中药组第3、7、14天，西药组第3、7天和中+西组第7天ASC蛋白水平显著低于模型组（P0.01，P0.05）。图7 各组大鼠肺组织ASC蛋白相对表达量比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天蛋白相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组1.50.52.01.007.各组大鼠肺组织IL-1 mRNA水平比较 见图8。在各时间点，模型组IL-1 mRNA水平显著高于正常组（P0.01）。第3、14、21天，各治疗组IL-1 mRNA水平均显著低于模型组（P0.05）。第7天，中药组和西药组IL-1 mRNA表达显著低于模型组（P0.01，P0.05）。图8 各组大鼠肺组织IL-1 mRNA表达量比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天mRNA相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组5314208.各组大鼠肺组织IL-1蛋白水平比较 见图2，图9。第3、7、14天，模型组IL-1蛋白水平显著高于正常组（P0.05）。第14天，各治疗组IL-1蛋白水平均显著低于模型组（P0.05）。图9 各组大鼠肺组织IL-1蛋白表达量比较（x-s，n=3）第3天第14天第7天蛋白相对表达量第21天正常组中药组模型组西药组中+西组1.50.52.01.009.各组大鼠不同时点肺组织病理变化 见图10。第3天，模型组肺组织可见肺泡腔内大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主；肺泡扩张，肺泡壁增厚，间图10 各组大鼠不同时点肺组织病理表现（HE）注：A.第3天；B.第7天；C.第14天；D.第21天；a.200，b.400。12345内文1.indd 5912023/2/10 16:57:11中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 592 质水肿、渗出。第7天，出现肺泡结构紊乱，并可见较多红细胞。第14天，肺泡结构消失，大量炎性细胞浸润，局部纤维形成。第21天可见较多炎性细胞浸润，肺间质增厚，局部纤维形成。与模型组比较，第3天各治疗组均可见肺泡腔内大量炎性细胞浸润，肺泡扩张，肺间质水肿、渗出，可见红细胞浸润。中药组病变程度较轻。第7天，中药组和西药组肺组织肺泡结构完整，可见较多炎性细胞浸润，肺间质增厚。中+西组肺泡结构紊乱，但紊乱程度比模型组轻。第14天，各治疗组肺泡结构尚完整，较多炎性细胞浸润，可见肺间质增厚，局部纤维形成。第21天，中药组和西药组肺泡结构完整，肺间质增厚，程度较轻。中+西组肺泡结构紊乱，肺间质增厚，局部纤维形成。讨论本课题组前期对303例老年性肺炎进行了临床研究6，结果显示，老年风温肺热病的基本病机为热毒炽盛、毒瘀互结、正气亏虚。其中133例患者感染MDRPA，患者往往从痰热壅肺证向热闭心包证发展，少数病例在初期即迅速演变成邪陷正脱证，病死率高12。同时，标准抗感染联合扶正解毒化瘀方在治疗2周后疗效明显提高，利于排痰，且促进肺炎感染灶吸收8-9。扶正解毒化瘀方对TLR1/NF-B通路和NLRP3炎性体的作用已经在细胞实验中证实。该方作用于LPS诱导的大鼠NR8383细胞，能降低NLRP3蛋白水平和IL-1 mRNA表达，并且明显降低ASC蛋白水平。同时，扶正解毒化瘀方联合TZP能明显降低炎性因子IL-1和IL-18水平10。本研究中，扶正解毒化瘀方干预第3、14、21天时NLRP3 mRNA和蛋白表达水平均有不同程度降低。对于Caspase-1，该方能下调Caspase-1 mRNA的表达。对于ASC，该方能下调第14、21天时ASC mRNA的表达，降低第7、14天时ASC蛋白水平。扶正解毒化瘀方还下调IL-1mRNA的表达。这表明该方可以调节MDRPA慢性肺炎时NLRP3炎性体的激活及免疫炎性反应。在病理方面，扶正解毒化瘀方明显减轻感染第3天的肺间质水肿和渗出。第7和14天，中药组的肺泡结构的完整性均优于模型组，免疫细胞浸润也明显减少。第21天时，能明显减轻免疫细胞浸润和纤维细胞形成。在各个时点，该方对肺组织损伤的修复作用均优于西药组。但是，中+西组并没有显示出协同增效的 作用。结果表明，NLRP3炎性体在MDRPA慢性肺炎时被激活，扶正解毒化瘀方可能通过调节NLRP3炎性体的表达，下调免疫炎性反应水平，从而减轻肺组织损伤。扶正解毒化瘀方和TZP联用并没有表现出协同增效作用，这一结果提示我们，在临床实践中，中西医结合并不是简单的药物联合使用，而应充分考虑疾病不同阶段的特征和各种药物应发挥的作用，灵活配合。参 考 文 献1 Maurice N M,Bedi B,Sadikot R T,et al.Pseudomonas aeruginosa biofilms:Host response and clinical implications in lung infections.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology(Online),2018,58(4):428-4392 Fujitani S,Sun H Y,Yu V L.et a1.Pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa:Part:Epidemiology,clinical diagnosis,and source.Chest,2011,139(4):909-9193 Willyard C.The drug-resistant bacteria that pose the greatest health threats.Nature,2017,543(7643):154 孙丽,鲁卫星,宋欣丽,等.从NLRP3炎症小体途径探讨龙牙楤木总皂苷抗心肌缺血再灌注损伤的作用机制.中华中医药杂志,2020,35(3):1441-14435 Martinon F,Tschopp J.Inflammatory caspases:Linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases.Cell,2004,117(5):561-5746 李猛,王成祥,徐红日,等.正气亏虚、毒瘀互结是老年性肺炎的基本病机.中医药临床杂志,2011,23(4):353-3547 Bauernfeind F G,Horvath G,Stutz A,et al.Cutting edge:NF-kappaB 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