基于流式细胞术的细菌快速分型检测方法_朴莹.pdf

实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 10 期 2023 年 10 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.10 Oct.2023 收稿日期:2023-06-07 基金项目:浙江省公益研究计划-分析测试项目（LGC21B040001）作者简介:朴莹（1988），女，吉林图们，硕士，实验师，研究方向为纳米药，。引文格式:朴莹，江寅申，刘衍朋，等.基于流式细胞术的细菌快速分型检测方法J.实验技术与管理,2023,40(10):70-76.Cite this article:PIAO Y,JIANG Y S,LIU Y P,et al.An efficient flow cytometry-based bacteria sorting methodJ.Experimental Technology and Management,2023,40(10):70-76.(in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.10.011 基于流式细胞术的细菌快速 分型检测方法 朴 莹1，江寅申2，刘衍朋3，余华海1，高小炎1（1.浙江大学 浙江省智能生物材料重点实验室，浙江 杭州 310058；2.浙江大学医学院 附属儿童医院 国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，浙江 杭州 310012；3.西湖大学 附属杭州市第一人民医院 浙江省肿瘤融合研究与智能医学重点实验室，浙江 杭州 310006）摘 要：发现一种三级胺氮氧化物聚合物胶束（OPDEA-PS）具有革兰氏阳性细菌（G+）特异性粘附且对红细胞或其他血液成分粘附相对较弱的特性。利用这一特性研究了一种基于流式细胞术的快速血液细菌分型检测方法。结果显示，将不同比例的金黄色葡萄球菌（G+）和大肠埃希菌（G）或肺炎链球菌（G+）和铜绿假单胞菌（G）与血液混合，加入终浓度为 0.01 mg/mL 的Cy5OPDEA-PS 胶束，孵育 10 min 后用流式细胞术或平板计数法检测，得到流式检测准确率高于 90%，平板计数法准确率低于 80%。相比而言，流式检测法具有操作简单、快速高效、准确率高的优势。这种用流式细胞术快速分辨细菌革兰氏分型的检测方法将有助于临床上菌血症等急性血液细菌感染性疾病的细菌类型初判，达到及时诊断和治疗的目的。关键词：流式细胞术；细菌；血液感染；快速检测 中图分类号：R-331 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2023)10-0070-07 An efficient flow cytometry-based bacteria sorting method PIAO Ying1,JIANG Yinshen2,LIU Yanpeng3,YU Huahai1,GAO Xiaoyan1(1.Zhejiang Key Laboratory of Smart Biomaterials,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.National Clinical Research Center for Child Health,Childrens Hospita,.Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou 310012,China;3.Key Laboratory of Integrated Oncology and Intelligent Medicine of Zhejiang Province,Affiliated Hangzhou First Peoples Hospital,Westlake University,Hangzhou 310006,China)Abstract:OPDEA-PS micelle was found to exhibit specific adhesion to Gram-positive bacteria(G+)and relatively weak adhesion to RBC(Red Blood Cell)and other blood components.A rapid blood bacterial assay by Cy5OPDEA-PS micelle based on flow cytometry was established.The results showed that after adding certain proportions of S.aureus(G+)and E.coli(G),or S.pneumonia(G+)and P.aeruginosa(G)with blood samples,and incubating with Cy5OPDEA-PS micelle(a final concentration of 0.01 mg/mL)for only 10 min,the accuracy of the bacteria type proportions detected and analyzed by Flow Cytometry was higher than 90%,while the accuracy of conventional colony counting method was lower than 80%.Therefore,with the advantages of simplicity,efficiency,and accuracy,this flow cytometry-based bacteria sorting method will shed light on the early detection and diagnosis of bacteremia and other acute hematological infectious diseases.Key words:flow cytometry;bacteria;blood infection;quik detection 1 背景 随着检测技术的快速发展，细菌检测已不限于传统的生化方法如培养基法，或常规的分子生物学技术如聚合酶链式反应（PCR）检测法1-2。流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种测量液相中悬浮细胞 朴 莹，等：基于流式细胞术的细菌快速分型检测方法 71 或微粒的现代化分析技术3。流式细胞仪可对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选。待测细胞或微粒经过荧光染色后制成细胞悬液，在一定的气体压力下，单行排列依次流经检测区域，被激发光源激发后产生散射光及荧光。电子检测系统和分析系统将光信号放大、收集、分析，可得到细胞膜表面和细胞内物质的浓度4-5。基于这个原理，流式细胞术已被大量应用于临床血液样本检测和免疫分型6-7。在此基础上，利用流式细胞术快速检测临床样本的探索也在不断深入，例如姜云涛等应用细菌通用探针 EUB388 和变形链球菌特异性探针 MUT590 并结合流式细胞术成功检测了主要致龋菌变形链球菌8。可见，流式细胞术具有快速、高通量等优势，对于临床急性疾病的快速诊断具有很高的应用价值。菌血症是指细菌通过体表入口进入血液循环并繁殖散播全身，通常由导尿管或体表造口引发并引起多器官转移性感染的疾病，一旦怀疑应立即采血检验，针对感染菌争分夺秒地进行治疗9。有些抗生素例如盘尼西林，对革兰氏阳性菌有很好的杀菌作用，但对革兰氏阴性菌作用较弱，链霉素则恰恰相反10。因此快速确定细菌类型对细菌感染性疾病的治疗至关重要11。革兰氏染色技术发明于 1884 年，是检测未知细菌的重要方法，其把细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。革兰氏染色法的操作过程较为复杂，且容易产生假阳性结果12。新的区分细菌革兰氏性状的检测方法发展迅速。RYU 等于 1938 年报道过利用氢氧化钾溶液快速区分细菌革兰氏性状的方法，但这种方法不适用于含有革兰氏阴性和阳性两种细菌的混合样品13。SIZEMORE 等报道过利用小麦胚芽凝集素（WGA）共轭化合物选择性地对革兰氏阳性菌进行成像14，但有研究表明 WGA 也可以染色革兰氏阴性菌15。还有研究用万古霉素和达托霉素修饰的纳米颗粒靶向革兰氏阳性菌细胞壁，但抗生素易产生细菌耐药，且这种纳米粒子也靶向革兰氏阴性菌，导致结果不准确16。本实验室前期研究合成了三级氨氮氧化物聚合物OPDEA（结构见图 1），发现 OPDEA 在肿瘤治疗上 图 1 OPDEA 结构式 表现出色17。在这项工作的基础上，我们进一步发现，OPDEA-PS 胶束具有对细菌特定的锚定能力，共聚焦显微镜下可见Cy5OPDEA-PS 大量富集于革兰氏阳性菌表面，在阴性菌表面富集较少。本文将探讨基于流式细胞术的Cy5OPDEA-PS 胶束的快速细菌分型方法，为细菌感染性疾病的快速诊断和精准用药提供技术支撑。2 材料与方法 2.1 实验材料 1）细菌种类及来源。金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠埃希菌（E.coli）、铜 绿 假 单 胞 菌（P.aeruginosa）、肺 炎 链 球 菌（S.pneumoniae），均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。用 Luria-Bertani(LB)琼脂培养基培养。2）OPDEA-PS 胶束的合成及荧光标记。OPDEA 聚合物详细的合成方法可参照本实验室前期成果17。将 OPDEA-PS 聚合物 5 mg 溶于 1 mL DMF 中，然后将此 DMF 溶液缓慢滴加到 5 mL 快速搅拌的去离子水中。滴加结束后继续搅拌 30 min，然后置于活化后的截留分子量为 3 500 Da 的透析袋中，用去离子水透析 24 h（2 L3）。透析结束后，用 0.22 m滤头过滤得到 OPDEA-PS 胶束溶液。分别用 Cy5 对 OPDEA-PS 和 PEG-PS 进行荧光标记。将带有氨基保护基的 OPDEA-PS 100 mg 溶于3 mL 二氯甲烷三氟乙酸为 21（v/v）的溶液中，室温搅拌 3 h，旋蒸除去溶剂。将脱去保护基的OPDEA-PS/NH2溶于 2 mL 干燥的 DMF 中，加入100 L 三乙胺作缚酸剂，随后加入 Cy5-NHS 1 mg，室温下避光搅拌 24 h。反应结束后将反应液置于透析袋中，依次用甲醇（1 L3）和去离子水（2 L3）透析 24 h。透析结束后，透析袋内溶液用 G15 葡聚糖凝胶柱提纯，然后用 0.22 m 滤头过滤，冻干得到 Cy5标记的Cy5OPDEA-PS 聚合物 75 mg，产率为 75%（见图 2）。2.2 实验方法 1）细菌培养。取适量上述四种细菌分别涂布于 Luria-Bertani（LB）琼脂培养基，37 孵育过夜，可形成细菌菌落。挑取单个菌落加入 5 mL 无菌 LB 培养基中，在37 下摇晃 1416 h（转速为 225 r/min），使细菌处于对数增长期。利用分光光度计将菌液调节至 OD600 0.5（OD600 0.5 时细菌总数大致为 2109 CFU/mL）备用。2）用 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 不 同 细 菌 上Cy5OPDEA-PS 吸附量的差异。以 S.aureus 为例，挑取 S.aureus 菌落于无菌 LB混悬均匀，225 r/min、37 下培养过夜，约 16 h 后 72 实 验 技 术 与 管 理 图 2 Cy5OPDEA-PS 的合成 肉眼可见液体浑浊。将该菌液稀释至OD600约等于0.5，分装至无菌离心管，每管 400 L，加入Cy5OPDEA-PS或Cy5PEG-PS，使其终浓度为 0.01 mg/mL，再于225 r/min、37 下摇晃孵育 30 min。孵育过后再8 000 r/min 下离心 5 min，弃去上清，用 1 mL PBS 重悬后离心去上清，目的是洗掉未结合的聚合物胶束。加入少量（约 20 L）PBS 重悬沉淀，取约 5 L 滴加至载玻片，盖上盖玻片并将样本压实，在激光共聚焦显微镜下观察。3）流式细胞术检测不同细菌的荧光差异。用共聚焦显微镜观察的样本相同的处理方法将细菌与聚合物胶束孵育 30 min 或不同时间（研究孵育时间对吸附的影响时用不同时间孵育，分别是 10 min、30 min、1 h、2 h），在 8 000 r/min 下离心 5 min，弃去上清保留沉淀，用 1 mL PBS 重悬，经 300 目滤网过滤后用流式细胞仪进行检测和分析。流式检测中阳性率的确定。将不加材料孵育的正常细菌（图 3 中以下标 CTL 表示）作为阴性对照，设门（即阴性和阳性分界线），使 99%以上的细菌落在阴性区域，小于 1%处于阳性区域，如图 3 中虚线所示。Cy5OPDEA-PS 孵育过的样本的峰右移，即向阳性区域偏移，则落在阳性区域的细菌数占被检测细菌总数的百分比为阳性率。流式细胞术准确率=（检测出的阳性率/该比例细菌在拟合曲线中对应的阳性率）100%。4）平板计数法验证流式分析结果。将 S.aureus、E.coli 或 S.pneumoniae、P.aeruginosa按照 37 和 73 的比例混合，再平均分成两份。一份与新鲜血液混合后加入Cy5OPDEA-PS 孵育 10 min，用流式细胞仪检测。另一份倍比稀释后涂板，置于37 培养箱孵育 2448 h，待菌落明显长出，分别计数出不同颜色的菌落数量。S.aureus 为金黄色菌落，E.coli 为白色菌落，S.pneumoniae 为大的圆饼状白色菌落，P.aeruginosa 为半透明淡绿色菌落。将两种检测方法得出的结果与实际细菌比例进行对比分析。平板计数法准确率=（计数出的菌落数目/实际细菌数目）100%。2.3 实验仪器 流式细胞仪为 BD 生产，型号为 FACS Calibur。激光共聚焦显微镜为尼康生产，型号为Nikon A1，细菌培养箱购自天津市宏诺仪器有限公司，型号为 SPX-150B。3 结果与讨论 3.1 OPDEA-PS 对革兰氏阳性菌和阴性菌的吸附差异性检测 1）流式细胞术检测结合共聚焦显微镜观察Cy5OPDEA-PS 对不同细菌类型的吸附差异。选取四种常见细菌，两种革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌（S.aureus）和肺炎链球菌（S.pneumoniae），以及两种革兰氏阴性菌大肠埃希氏菌（E.coli）和铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）。向数量为 1109 CFU 的细菌中加入Cy5OPDEA-PS 或 Cy5 标记的聚乙二醇（Cy5PEG-PS，聚乙二醇即 PEG 是最常见的作为对照的生物医用材料），孵育 30 min 后用流式细胞术对其吸附量进行检测（见图 3）。革兰氏阴性菌 E.coli 和P.aeruginosa 上吸附的Cy5OPDEA-PS 的荧光强度分别为 34.1 和 35.1，Cy5PEG-PS 的荧光强度分别为 11.1 和29.2，说明在革兰氏阴性菌上，Cy5OPDEA-PS 的吸附量明显大于Cy5PEG-PS。但对革兰氏阳性菌 S.aureus 和S.pneumoniae 而言，Cy5OPDEA-PS 的荧光强度分别为129.0 和 83.4，其数值是革兰氏阴性菌吸附量的 23倍，Cy5PEG-PS 的荧光强度分别为 17.1 和 21.5，与阴性菌并无明显差别，说明 OPDEA 具有普通生物材料PEG 不具备的突出的革兰氏阳性菌吸附特性。为进一步验证Cy5OPDEA-PS 在革兰氏阳性菌和阴性菌上的吸附差异，将上述样本用激光共聚焦显微镜对其吸附于不同细菌的状态进行成像（见图 4）。可观察到细菌形态轮廓，红色代表Cy5OPDEA-PS，革兰氏阳性的 S.aureus 和 S.pneumoniae 的细菌轮廓与红色亮点高度重合，表明Cy5OPDEA-PS 大量吸附于细菌上。相比之下，革兰氏阴性的 E.coli 和 P.aeruginosa只有少量红色亮点与细菌重合，表明吸附数量很少。以上结果表明，Cy5OPDEA-PS 具有很强的细菌吸附能力，其在革兰氏阳性菌上的吸附作用远大于革兰氏阴性菌，这种对革兰氏阳性菌特异性吸附的特性有利于细菌的分类型检测。2）Cy5OPDEA-PS 对细菌与红细胞的吸附差异。为了检测Cy5OPDEA-PS 是否与血液其他组分有较强的相互作用，将新鲜血液离心弃去上层血清，沉淀部分主要由红细胞（RBCs）构成。用生理盐水将红细胞重悬并分别加入革兰氏阳性菌 S.aureus 或阴性菌 朴 莹，等：基于流式细胞术的细菌快速分型检测方法 73 注：Mean 表示平均荧光强度。图 3 流式细胞术检测Cy5OPDEA-PS 或Cy5PEG-PS 在四种细菌上的吸附差异 图 4 激光共聚焦显微镜观察Cy5OPDEA-PS 在不同细菌上的吸附情况 E.coli，孵育过后滴于载玻片并在激光共聚焦显微镜下观察。如图 5 所示，S.aureus 与 RBCs 共孵育组可见红色荧光大量吸附于细菌，吸附于红细胞的量相对较少。然而，E.coli 的红色荧光较弱，表明Cy5OPDEA-PS 在E.coli 上的吸附量较少，其荧光亮度与红细胞上的吸附量相当。由此可见，将Cy5OPDEA-PS 加入血液中孵育情况下，Cy5OPDEA-PS 仍可特异性地吸附于革兰氏阳性细菌，其吸附作用明显高于革兰氏阴性菌或红细胞。为了进一步确定Cy5OPDEA-PS 在血液中的选择性吸附能力，先将红细胞与Cy5OPDEA-PS 进行混合孵育，离心去掉未吸附于红细胞表面的Cy5OPDEA-PS，再将S.aureus或E.coli与上述红细胞共孵育后检测细菌竞争性吸附红细胞上Cy5OPDEA-PS 的能力。从图 6 共聚焦显微镜观察发现，原本不带有荧光的 S.aureus 在 图 5 激光共聚焦显微镜观察Cy5OPDEA-PS 在 不同细菌血液混合物上的吸附情况 74 实 验 技 术 与 管 理 图 6 激光共聚焦显微镜观察不同细菌竞争性吸附 RBCs 上Cy5OPDEA-PS 的情况 孵育后表现出较强的红色荧光，而红细胞未观察到红色荧光，只有少部分 E.coli 有较弱的红色荧光。表明S.aureus能 够 竞 争 性 吸 附 原 本 在 红 细 胞 上 的Cy5OPDEA-PS，而 E.coli 竞争吸附Cy5OPDEA-PS 的能力较弱。由此可见，Cy5OPDEA-PS 在血液中仍能保持革兰氏阳性菌特异性吸附特性，为用其鉴定筛选细菌感染的血液样本提供了可行性。3.2 差异性吸附检测时间的条件优化 材料与细菌的孵育条件对吸附量影响显著，利用流式细胞仪快速对细菌样品进行检测的方法突出了检测的时效性，因此主要探讨吸附时间对吸附量的影响。将Cy5OPDEA-PS 与 S.aureus 孵育 10 min、30 min、1 h、2 h，检测吸附量随时间的变化特点。由图 7 可以看出，孵育 10 min 的吸附量与 2 h 的吸附量无明显差异，因此孵育 10 min 后就可以对样品进行流式检测。表明Cy5OPDEA-PS 粘附细菌的速度非常快，体现了这种检测方法的高效性。图 7 流式细胞术检测Cy5OPDEA-PS 吸附量随时间的变化 3.3 流式检测法与平板计数法检测血液细菌类型对比 在实际检测中，通常将含有未知细菌的血液样本进行涂板或 PCR 检测来确定感染细菌种类，尤以平板计数法为金标准。因此，接下来我们在优化流式检测方法后既定的孵育浓度和时间条件下，将不同比例的革兰氏阳性菌 S.aureus 和阴性菌 E.coli 混合后再与小鼠血液进行混合。将细菌血液混合物均分成两份，一份流式检测其中不同细菌占比与阳性率的关系，另一份倍比稀释后涂于琼脂糖平板。将 S.aureus 和 E.coli按照从 S0E10（即 S.aureus 占比为 0%，E.coli 占比100%）、S1E9、S2E8，直至 S10E0。从图 8(a)中可以观察得出，随着 S.aureus 比例的升高，阳性率也不断升高，从 S0E10 时的 26.3%提高到 S10E0 时的57.6%，呈显著线性正相关，相关系数为 0.973 2（见图 8(b)）。与此同时，随着革兰氏阳性菌比例的不断升高，荧光强度也在不断增大，从 15.4 提升至 76.4，也呈线性正相关，相关系数为 0.933 9，低于阳性率的相关系数 0.973 2，因此在后续检测中优选用阳性率进行判断。接下来用流式检测和涂板两种方法对已知混合比例的 S3E7 和 S7E3 进行检测，流式检测法所得阳性率分别为 34.8%和 45.75%，与已知拟合曲线进行对比（见图 8(b)），最接近的比例为 S3E7 和 S7E3，准确率高达95%和 97%。平板计数法中可以观察到金黄色的S.aureus 菌落和白色的 E.coli 菌落，通过菌落计数得出平板计数法的准确率为 79%和 75%。为了进一步验证流式检测法的准确性和适用性，选择另外两种细菌，分别是革兰氏阳性的肺炎链球菌 S.pneumoniae 和革兰氏阴性的 P.aeruginosa。将这两种细菌按不同比例与血液混合后用上述方法进行验证，得到 Sp7P3（即S.pneumoniae 占比为 70%，P.aeruginosa 占比 30%）和 Sp3P7 的阳性率分别为 48.93%和 40.8%，准确率为 朴 莹，等：基于流式细胞术的细菌快速分型检测方法 75 95%和 91%。如图 8(c)所示，S.pneumoniae 菌落呈白色圆饼状，菌落较大，P.aeruginosa 的菌落较小，呈半透明淡绿色，通过菌落计数得出平板计数法的准确率为 79%和 77%。说明利用Cy5OPDEA-PS 的流式细胞细菌分型的检测方法不仅快速高效，准确率也较高。平板计数法对一些肉眼不可见的微小菌落无法准确计数导致准确率较低，流式检测法由于是对单个细菌进行检测，准确率较高，具有更好的实际应用价值4,18。图 8 流式检测法或平板计数法对血液细菌样本进行检测 4 结语 本文发现了一种能够特异性吸附革兰氏阳性菌的OPDEA-PS 胶束，研究了利用该聚合物胶束的基于流式细胞术的细菌革兰氏分型快速检测方法。与平板计数法对细菌分类的准确率进行比较，发现该方法的准确率高于 90%，而平板计数法准确率低于 80%。与此同时，在流式检测法中，将Cy5OPDEA-PS 与待测细菌或血液样本孵育 10 min 即可进行检测，而平板计数法则需要至少 24 h 的培养才能长出菌落，且对于颜色形态相似的菌落难以进行区分，无法达到准确细菌分类的目的。随着医学生物技术的进步，PCR 法也被大量应用于临床进行细菌类型鉴定，准确率较高，时效性较平板计数法也有很大提升，一般几个小时就可得到结果。但 PCR 法需要对样本进行多步骤处理，稍有污染就会使结果产生重大偏差，对操作人员的专业性和技术熟练度有较高要求。另外，血液细菌感染的患者通常是菌血症伴有高热症状，检测时效性非常关键，因 此 如 果 在PCR检 测 基 础 上 配 合 利 用Cy5OPDEA-PS 的流式快速检测法，将有望推动血液细菌感染疾病的早期快速精准诊疗。但这种方法也存在一定的局限性，本文只以两种革兰氏阳性菌和两种革兰氏阴性菌为代表进行了研究，还有待探讨该方法在更多细菌上的普适性。我们已知在大多数情况下，生物材料可以穿过相对多孔的革兰氏阳性菌细胞壁有效杀灭细菌，但由于革兰氏阴性菌具有由脂多糖构成的致密外膜结构，使药物或生物材料不易透过19-20，因此有理由相信 OPDEA-PS 对革兰氏阳性菌的选择性吸附与细菌细胞壁的结构特点紧密相关，具有一定的合理性。总而言之，这项研究为发现更多具有生物医用价值的新材料提供了线索和参考，同时将流式细胞仪与临床检测紧密地结合在一起，将推动生物医用材料与现代检测仪器联合辅助解决临床医学问题的发展。76 实 验 技 术 与 管 理 参考文献(References)1 谢鹏，唐梦君，卜柱.病原性细菌检测方法的研究进展J.江苏农业科学，2015,43(9):253255.XIE P,TANG M J,BU Z.Research progress of detection methods of pathogenic bacteriaJ.Jiangsu Agricultural Sciences,2015,43(9):253255.(in Chinese)2 施开创，李凤梅，张步娴，等.超级细菌 blaNDM-1基因 TaqMan-MGB 荧光定量 PCR 检测方法的建立J.中国预防兽医学报，2015,37(12):952956.SHI K C,LI F M,ZHANG B X,et al.Establishment of TaqMan-MGB real-time PCR for detection of blaNDM-1 gene of superbugJ.Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2015,37(12):952-956.(in Chinese)3 祁岩，游春苹.流式细胞术在乳品微生物检测中的应用J.食品与机械，2023,39(2):221226,235.QI Y,YOU C P.Application of flow cytometry in microbial detection of dairy 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