端粒与骨关节炎软骨细胞衰老的研究进展_刘浪.pdf

第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023209 DOI:10.13463/ki.cczyy.2023.02.022端粒与骨关节炎软骨细胞衰老的研究进展刘 浪1，赵 双1，张炳华1，赵长伟2*，赵文海2*（1.长春中医药大学，长春 130117；2.长春中医药大学附属医院，长春 130021）摘要：骨关节炎是以软骨退变为特征的慢性退行性疾病，软骨细胞衰老在其发展中起着重要作用，但调控软骨细胞并决定衰老的具体机制尚未完全阐明。本文通过对端粒、端粒酶的结构和生物学效应，端粒在调节软骨细胞衰老过程中的关键机制，包括以慢性炎症、氧化应激、p53、pRb 为标志的端粒缩短机制以及端粒酶活性降低所导致的端粒侵蚀，并对以SIRT6、MMP13、SA-Ga 为主的软骨细胞衰老标志物的相关分子作用机制进行阐述，以期为骨关节炎的防治提供新的理论支撑。关键词：软骨细胞衰老；端粒；骨关节炎中图分类号：R684.3 文献标志码：A 文章编号：2095-6258(2023)02-0209-08Research progress of telomere and chondrocyte senescence in osteoarthritisLIU Lang1,ZHAO Shuang1,ZHANG Binghua1,ZHAO Changwei2*,ZHAO Wenhai2*(1.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;2.Affi liated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130021,China)Abstract:Osteoarthritis is a chronic degenerative disease characterized by cartilage degenerations,and chondrocyte senescence is known to play an important role in the development of osteoarthritis,but its more specifi c mechanisms on regulating chondrocytes and determining their aging have not been fully clarified.This paper reviews the structure and their biological effects of telomere and telomerase,the key roles of telomeres in regulating the chondrocyte senescence,including the telomere shortening through the expressions of chronic inflammation,oxidative stress,p53,pRb and the telomere erosion caused by decreased telomerase activities,and summarizes the molecular mechanisms of SIRT6,MMP13 and SA-Ga as the main markers of chondrocyte senescence,hoping to provide a new theoretical support for the prevention and treatment of osteoarthritis.Keywords:chondrocyte senescence;telomere;osteoarthritis基金项目：国家中医药管理局天池伤科流派工作室建设项目（第二轮建设）；吉林省发展和改革委员会产业技术研究与开 发项目（2020C033-6）作者简介：刘 浪（1993），男，博士研究生，主要从事骨疾病方面研究*通信作者：赵长伟，男，教授，主任医师，硕士研究生导师，电子信箱-zcw_ 赵文海，男，教授，主任医师，博士研究生导师，电子信箱- 细胞衰老这一概念在 1961 年被海弗利克首次发现并创造，实验发现体外培养的人类体细胞在有限的传代后停止复制1，这一发现引起了科学界相当大的兴趣，并为今后理解衰老背后的细胞和分子特征奠定了基础。细胞衰老指的是一种高度稳定的细胞周期阻滞，且所有组织类型的衰老细胞都在分子、形态和功能上表现出相似的特征2。骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种与年龄相关的慢性疾病，软骨细胞衰老是其发生的主要危险因素之一3，然而，调控软骨细胞决定衰老的因素仍有待完全阐明。目前的证据表明，细胞衰老与端粒 DNA 的结构变化有关，且衰老过程中细胞也会经综述第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023210历独特的表型改变，其中一个突出的分子现象是衰老细胞中端粒的逐渐缩短4，这表明端粒损耗除了是决定细胞预期寿命的一个潜在因素外，也是衰老的标志5。因此，越来越多的学者开始关注端粒在软骨细胞衰老的调控作用。本文重点探讨了端粒缩短导致 OA 软骨细胞衰老的分子机制，并总结了一些软骨细胞衰老的主要标志物。1 端粒的结构和生物学效应 “端粒”一词来自希腊语，意思是“部分的结束”。穆勒6在 1938 年对果蝇的研究中首次发现端粒的结构，且自端粒发现以来，对它的研究一直未曾间断。端粒是定位于真核生物染色体末端的 DNA-蛋白质结构，人类的端粒主要由 TTAGGG 的双链重复序列组成，可以保护染色体末端，对维持生物基因组的稳定性至关重要7-8。哺乳动物的端粒是特殊的核蛋白结构，由端粒DNA 重复序列和结合蛋白组成，不编码任何基因产物9。端粒的二级结构中有富含 G 的 DNA 重复序列和相关蛋白10，其中在端粒 3 端有一个由 G 链悬垂末端形成的单链序列，这个 G 链悬垂折叠形成一个 T 环（T-loop），随后侵入 5 端 DNA 双链，形成D 环（D-loop）11-12，通过这种结构能有效地隐藏端粒的尾部，保护染色体末端不被 DNA 损伤修复机制识别为DNA双链断裂，避免了染色体融合的发生7。G 链端粒 DNA 重复序列也可以折叠成稳定的二级结构即 G-四聚体结构（G-quadruplex）13，该结构由多个鸟嘌呤碱基对连接在一起，可以导致复制的延迟和基因组的失稳14。端粒的另一个大分子成分是长链非编码 RNA 即 TERRA（telomeric repeat-containing RNA，TERRA）15，TERRA 可 以 由 G-四聚体转录形成，来源于靠近染色体末端的区域，部分由串联的 UUAGGG 重复序列组成，在维持端粒完整性方面发挥着重要作用。Shelterin 蛋白复合体是结合蛋白的核心成分，由 6 个端粒蛋白组成，包括端粒重复结合因子 1 和 2（telomere repeat binding factor 1 and 2，TRF1，TRF2）、端粒保护蛋白 1（protection of telomeres 1，POT1）、POT1 结合 蛋 白 1（telomere-binding protein POT1-interacting protein 1，TPP1）、TRF1 相互作用蛋白 2（TRF1-interacting nuclear protein 2，TIN2）以及 TRF2 相互作用蛋白 1（TRF2-interacting protein 1，RAP1）16，其中任何一种缺失都可能导致端粒功能障碍和细胞衰老的发生。此外，Shelterin 蛋白复合体与端粒结构结合，在染色体末端组成一个完整的冒状结构，以维持端粒长度，调控端粒酶活性17。端粒酶是一种特殊的核糖核蛋白复合物，其催化核心由端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）和 端 粒 酶 RNA（telomerase RNA component，TERC）组成18。端粒酶与端粒DNA 的 3 端结合，并使用其内部 TERC 作为端粒延伸的模板进行TERT催化的逆转录反应，延长端粒19。人类的端粒酶仅在胚胎发育过程和高增殖的成年体细胞，如生殖细胞、干细胞和祖细胞中保持高活性，而在体细胞组织中的表达受到抑制20，因此，随着年龄的增长，大多数体细胞组织中的端粒会逐渐缩短，从而导致必然的细胞衰老。端粒酶复合物是端粒酶激活及端粒延长所必需的，TERT 是端粒酶复合物的核心组成部分之一，它通过在端粒前导链的 3 端添加特定的重复核苷酸序列来延伸端粒。TERT 在人类细胞中的转录受到多种肿瘤抑制途径的严格抑制，被认为是端粒酶活性的限速器21-22。端粒酶复合物的另一个组成部分是TERC，它是一种功能性的 lncRNA（long non-coding RNA，lncRNA），作为端粒延伸的模板包含一个与端粒 DNA G 链互补的短片段23。此外，TERC 在癌症细胞中的广泛上调对癌症的机制研究有重要意义24。再者，端粒酶复合物中还存在其他成分，包括角化不 良 蛋 白（dyskeratosis congenita 1，DKC1）、热激蛋白 90（heat shock protein 90，HSP90）、端粒酶 Cajal 体蛋白 1（telomerase Cajal body protein 1，TCAB1）和富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子11（serine and arginine rich splicing factor 11，SRSF11）等25，在维持端粒稳态，调节细胞衰老中发挥重要功能26。2 软骨细胞衰老与 OA 细胞衰老最初是指细胞在稳定的培养过程中，由于细胞分裂能力耗尽而进入的一种稳定的细胞周期阻滞状态1，在这种阻滞状态下细胞停止生长和增殖，但仍保持着活跃的代谢功能，这种复制性衰老的过程也被称为 Hayfl ick 界限27。目前，认为细胞衰老是成熟细胞的一种应激反应，他限制了受损细胞的无限增殖，是机体成长发育中不可或缺的过程。然而，各种组织中衰老细胞的积累是引发衰老相关疾病的重要因素28。OA 的主要病理特征是软骨细胞的变性和细胞外第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023211基质的降解29。软骨细胞控制着关节软骨的稳态，它的衰老会导致细胞外基质合成和降解的失衡，也会使软骨细胞维持和恢复关节软骨的能力下降30。软骨细胞是稀疏分布于关节软骨上的一层高度特化细胞，缺乏自我更新的能力，且衰老的软骨细胞会随着年龄的增长逐渐积累进而加速 OA 的发展31。目前，软骨细胞有 2 种不同的衰老机制：以端粒侵蚀为标志的复制性衰老和应激诱导的过早衰老32。软骨细胞衰老的确切分子机制尚不清楚，但它与炎症因子、细胞周期阻滞相关基因和软骨细胞表型维持基因高度相关，如白细胞介素-1（IL-1）、p16INK4a、p21、p53、SOX9（SRY-related high mobility group-box 9，SOX9）、骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）等参与诱导软骨细胞衰老33。p53、p21 和 pRb 基因遵循端粒缩短途径诱导软骨细胞衰老和凋亡，而p16INK4a 通过应激诱导途径在衰老过程中发挥协同作用34。p53 是一种典型的肿瘤抑制因子，在大多数肿瘤中并不活跃，但在衰老细胞中上调，p21 是p53 的第一个下游靶点，它可以阻断 pRb 蛋白磷酸化，并可以与 E2Fs 转录因子结合，导致细胞周期阻滞在 G1 期35，而端粒缩短及 DNA 的损伤也会激活 p53，使 p21 表达增加，从而阻止了细胞周期的进程而引起衰老36。此外，表达 p53 的软骨细胞与OA 的软骨细胞形态相似，而下调 p53 的表达则可防止软骨细胞发生衰老，这表明通过激活 p53-p21-pRb 通路而实现的细胞衰老可以在随后的 p53 失活时被逆转37。另一个与软骨细胞衰老相关的基因是p16INK4a，表达 p16INK4a 的软骨细胞会迅速失去正常的表型，从而表达出更多的炎症因子和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）38，p16INK4a 还通过阻断细胞周期蛋白依赖性激酶 4 和6（cyclin-dependent kinase 4 and 6，CDK4/6）及 维持 pRb、p107、p130 的非磷酸化形式，参与 G1 期的细胞周期阻滞39。此外，软骨细胞衰老也受到多种信号通路的调控，包括 p38MAPK、NF-B 通路和Akt 信号通路，其中 Akt 信号的长期激活导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累，触发软骨细胞衰老并导致 OA40。软骨细胞的端粒缩短会导致 OA 局部组织发生衰老41，而慢性炎症或氧化应激等刺激同样可以引起端粒缩短，由于软骨细胞几乎不更新，因此应激诱导的端粒缩短比复制性的端粒缩短更有可能发生42。衰老细胞的另一个关键特征是促炎细胞因子、趋化因子和蛋白酶等数百种因子的释放，这些因子被称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP），可改变周围组织微环境，抑制干细胞或祖细胞诱导的组织再生，最终导致邻近细胞的衰老43。衰老的软骨细胞停滞在细胞周期的 G1期，此时 SASP 的积累导致细胞内 MMPs 增加，使细胞外基质受损而引起组织衰老42。研究44-45发现，衰老细胞的清除降低了 OA 中慢性炎症标志物 IL-6和 IL-1 的水平，这表明 SASP 可能是慢性炎症的部分原因，SASP 还可以将衰老的软骨细胞转化为促炎细胞，参与到 OA 的进展中，且清除衰老的软骨细胞对 OA 有明显的防治作用。3 软骨细胞衰老与端粒长度 端粒磨损被认为是衰老和导致与年龄相关疾病的重要原因。研究10已经证实，端粒长度（telomere length，TL）与一些慢性疾病相关，尤其是以 OA 为代表的肌肉骨骼疾病。许多动物实验也表明 TL 和衰老之间有很强的相关性，端粒缩短的小鼠表现出过早衰老的表型，尤其对细胞周转率较高的组织器官产生影响，具体表现为脾萎缩、B 淋巴细胞和造血干细胞数量减少46，而逆转小鼠端粒的长度可以延长小鼠的寿命，延缓身体的衰老47。人类的 TL 随着细胞的复制而逐渐缩短，此时端粒会失去其保护结构和蛋白质，当端粒变得非常短时，细胞将停止增殖并通过 DNA 损伤途径触发复制性衰老，因此 TL 一直被认为是细胞衰老的标志2，而这种不完全的复制并不是端粒缩短的唯一原因。成年人 TL 的变化很大程度上也归因于遗传和环境因素48，作为细胞的“分子时钟”49，端粒理论认为，端粒缩短引发的细胞衰老是导致生物老化的触发因素之一，当端粒缩短到极限长度后，细胞衰老机制被激活，以驱动细胞进入细胞周期阻滞，然而，端粒缩短导致的生物体老化机制仍需要进一步研究。端粒随着软骨细胞年龄的增加而缩短，在人类关节软骨细胞中，端粒缩短的平均速率约为每年 40 个碱基对，且端粒的变化与复制诱导的衰老样表型漂移有关50。研究发现，软骨细胞外基质合成下降、相关细胞因子改变和较长的体外增殖时间等软骨细胞的衰老表型变化早在达到 Hayfl ick 界限之前就已经第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023212开始出现51，这意味着，在连续传代的软骨细胞培养达到其复制寿命的相对早期，即端粒磨损到达临界长度之前，软骨细胞就已经开始向衰老漂移。除了复制性衰老诱导的端粒缩短外，应激诱导的衰老同样可以导致端粒缩短。而软骨细胞更容易受到如创伤等外部应激源的影响，从而引发过早的衰老。成熟软骨细胞的端粒缩短可能是由于 ROS 引起的 DNA 损伤所致，创伤后的关节负荷、炎症和持续的氧化应激等刺激会引起软骨细胞 ROS 水平增加，导致 DNA 的氧化损伤，从而诱导染色体末端端粒侵蚀，最终加速软骨细胞衰老52。此外，HARBO等53记录了平均 TL 和超短端粒（低于 1 500 个碱基对）与 OA 严重程度和衰老的相关性，发现软骨细胞染色体端粒缩短与 OA 的生物学衰老和发病机制呈正相关。端粒酶活性同样是影响细胞衰老和细胞复制能力的重要指标。端粒通过阻止染色体末端融合来维持染色体的稳定性，它的复制及延长是一种与基因组复制相协调的复杂机制，需要一种特殊的逆转录酶即端粒酶参与。然而，端粒酶只在胚胎干细胞及某些免疫系统细胞中活跃，在大多数体细胞中没有端粒酶表达的情况下，端粒随着每一轮复制而缩短，当端粒缩短达到临界值时将被识别为双链 DNA 断裂，且端粒酶的活性会随着时间的推移而耗尽，使端粒侵蚀更容易发生54。此外，成人软骨细胞中的端粒酶含量及活性并不能延长细胞的复制寿命，即使酶的活性水平足以防止端粒侵蚀55。软骨细胞端粒酶的缺失与 OA 的发展密切相关，对马关节软骨细胞端粒酶的分析表明，随着年龄的增长，端粒酶活性降低，且青春期前的马存在端粒酶活性，青春期后则不存在端粒酶活性，这意味着软骨细胞的端粒侵蚀、衰老和对 OA 易感性开始于青春期的结束56。端粒酶会优先延长最短的端粒，以防止 DNA 突变、重排或融合，这是维持长期基因组稳定性所必需的57。端粒酶也可用于 OA 的治疗，OA 进展时会使细胞出现不可逆的衰老或死亡，而端粒酶可以刺激足够数量的细胞生长，对抗疾病58。端粒酶随着年龄的推移而逐渐减少所导致的端粒缩短是细胞衰老最具代表的特征，因此端粒酶可以做为维持 TL 和延缓软骨细胞衰老的重要靶点。MARTIN 等59通过对衰老软骨细胞的研究证实了用TERT 转导的软骨细胞能够刺激端粒酶的活性，增加TL，从而延长细胞的寿命，提高关节软骨的修复能力。事实上，OA 患者的软骨细胞在外源性端粒酶逆转录病毒的转导下可以使细胞的寿命得到延长，这意味着端粒酶的外源性表达在软骨细胞增殖和特异性表型的维持上有着巨大潜力60。4 软骨细胞衰老的主要标志物4.1 SIRT6 沉 默 信 息 调 节 因 子 6（silencing information regulator 6，SIRT6）是位于细胞核的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的组氨酸去乙酰化酶Sirtuins 家族成员之一，参与了一系列生物过程，主要包括 DNA 修复、端粒维持、细胞衰老和炎症61-62。SIRT6是人类软骨细胞衰老过程的关键调节因子63，它的活性随年龄和与衰老相关的氧化应激条件而改变，并且 SIRT6 的过表达可以特异性增加过氧化物还原酶 1（peroxiredoxin 1，Prx1）和硫氧还原蛋白（sulfi redoxin，Srx）两种抗氧化蛋白的水平，以维持软骨细胞的氧化还原稳态平衡64。最近的一项研究发现，SIRT6 在预防代谢综合征引起的关节软骨降解和髌下脂肪垫炎症上有着重要作用，为探索 OA的作用机制提供了方向65。4.2 MMP13 促炎细胞因子诱导的 MMP13 积累同样是 OA软骨细胞衰老的重要中枢调节因子66。MMP13 是MMPs 家族的一员，在人类 OA 软骨细胞中高度过表达，并在软骨聚集蛋白聚糖的降解中发挥重要作用，是 OA 进展的主要胶原酶67。软骨 II 型胶原是构成大多数细胞外基质的主要成分，衰老中的软骨细胞会产生较多的 MMP13，同时促进 II 型胶原和聚集蛋白聚糖等关节软骨的主要蛋白降解68。MMP13长期以来一直被认为是软骨侵蚀的主要酶，同样也是软骨细胞 SASP 中的一员，且 MMP13 的分泌还与软骨细胞合成代谢和分解代谢的平衡功能有关。4.3 SA-Gal 自 1995 年，DIMIRI 等69在 pH 为 6 时检测到衰老细胞表达的衰老相关-半乳糖苷酶（senescence-associated-galactosidase，SA-Gal）时起，它就已经成为应用最广泛的衰老细胞生物标志物。溶酶体-Gal 是 SA-Gal 活性的来源，在衰老细胞中检测到的 SA-Gal 活性的增加显然是溶酶体酶编码基因GLB1 表达增加的结果70。SA-Gal 活性易于检测和观察，传统上，SA-Gal 活性使用 5-溴-4-氯-3-第 39 卷第 2 期2023 年 2 月长春中医药大学学报Journal of Changchun University of Chinese MedicineVol.39 No.2Feb.2023213吲 哚-D-半 乳 糖 苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside，X-gal）作为底物进行细胞化学检测时可观察到不溶的蓝色化合物71。在 OA 病变附近的软骨细胞中，SA-Gal 的活性水平与疾病的严重程度呈正相关72。CHUNG等73研究发现，SA-Gal 活性在低剂量砷暴露诱导的人软骨细胞和大鼠关节软骨中均显著增加。尽管如此，一些研究已经发现，以 SA-Gal 活性标志的衰老也存在局限性，例如，在 pH 为 6 时的-GAL 活性也可能反映了自噬的活性74。因此，为了确定细胞的衰老，仍然需要补充其他标记物。4.4 其他 衰老相关基因（p16INK4a、p53）的表达是评估细胞衰老的重要标志，其中，p53 是衰老程序的核心组成部分，在软骨细胞衰老过程中 p53 的表达和乙酰化增加75。p16INK4 是软骨细胞功能障碍的生物标志物，在小鼠软骨和体外原代人类软骨细胞中，p16INK4 的表达随着年龄的增长而显著上调76。此外，除了软骨细胞，在 OA 滑膜成纤维细胞中p16INK4 的表达上调也提示着滑膜成纤维细胞已衰老77。细胞通讯网络因子 3（cellular communication network factor 3，CCN3）又称为肾母细胞瘤过表达 因 子（nephroblastoma overexpressed，NOV）是CCN 家族的经典成员之一，参与软骨内成骨、软骨发育、分化和代谢调节等多种生理功能78。CCN3可以作为软骨细胞衰老的一个新的标志物，在衰老小鼠和人类关节软骨中的表达上调，并且通过诱导p53 和 p21 来加速细胞衰老79。再者，酪蛋白激酶2（casein kinase 2，CK2）在软骨细胞衰老过程中是一种至关重要的抗衰老因子。KIM 等80研究发现，抑制 CK2 的活性可诱导原代关节软骨细胞的衰老，且抑制 CK2 介导的衰老与软骨细胞中血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的表达调控有关。5 小结 世界各地老年人口数量的迅速增加给慢性疾病的医疗保健服务带来了越来越大的压力，这一人口趋势强调了从细胞和分子水平上研究衰老的迫切需求。OA 是最常见的慢性疾病，具有较高的发病率和致残率。软骨细胞衰老在 OA 的发生发展中起到直接的作用。衰老是细胞应对分子损伤的一种防御机制，能防止受损细胞或应激细胞的增殖，从而维持机体稳态。近年来对软骨细胞衰老的研究有所扩大，特别是在衰老调节机制和相关衰老标志物方面。端粒磨损和功能障碍长期以来一直被定义为衰老的标志，是正常衰老和许多应激诱导过早衰老的共同特征。越来越多的证据表明，端粒缩短与软骨细胞衰老和 OA 的发病机制密切相关。本文综述了端粒的生物结构和端粒缩短在 OA 软骨细胞衰老过程中的机制。软骨细胞的衰老还涉及多种复杂的信号通路和生物过程，因此筛选出在调节软骨细胞衰老中发挥关键作用的标志物将有利于阐明软骨细胞衰老的分子过程。综上所述，软骨细胞衰老是一个复杂的现象，其中端粒缩短是导致其衰老的主要原因，因此延长端粒或减缓端粒缩短可能是抗衰老的重要干预靶点。衰老细胞的增加和炎症同样在软骨细胞衰老过程中起着突出的作用，所以清除衰老细胞和减少 SASP也是抗衰老的重要策略。此外，为了更好地了解端粒对软骨细胞衰老的影响，还需要在分子水平上进行更多的研究。参考文献：1 HAYFLICK L,MOORHEAD P S.The serial cultivation of human diploid cell strainsJ.Experimental Cell Research,1961,25(3):585-621.2 BERNADOTTE A,MIKHELSON V M,SPIVAK I M.Markers of cellular 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