酶法提取响铃草总黄酮的工艺研究.docx

中文摘要目的 通过酶法提取响铃草中总黄酮，进而对其提取工艺进行优选。黄酮是一类化学物质的简称，在心脑血管系统、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和杀虫等方面具有较强的药理活性。方法 采用纤维素酶辅助提取响铃草中总黄酮，通过单因素试验：控制乙醇浓度、料液比、纤维素酶用量、酶解时间、酶解pH、酶解温度来对响铃草总黄酮提取率进行研究。再进行正交试验，确定最佳工艺。结果对响铃草总黄酮提取率的主次影响顺序：酶解pH酶解时间料液比乙醇浓度;确定了酶法提取响铃草总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1:25、酶解pH4.40、酶解时间150min、酶解温度55C,纤维素酶用量8mg/g,在此最佳条件下，响铃草中黄酮提取率为0.64%o结论利用纤维素酶辅助提取响铃草中总黄酮的工艺具有一定的可行性，可以为响铃草的二次开发提供参考依据。关键词：纤维素酶；响铃草；黄酮类化合物；提取工艺；单因素实验和正交实验AbstractObjective by enzyme extraction of total flavonoids from Bell grass, then theextraction process is optimized. Flavonoids are a class of chemicals called,cardio-cerebrovascular system, anti-inflammatory, antibacterial, antiviral, antitumor,antioxidant free radical and insecticidal has strong pharmacological activity. Methodsusing cellulose enzyme-assisted extraction of total flavonoids from Bell grass.through a single factor: controlling alcohol concentration, the amount of solid-liquidratio, cellulase, enzyme, enzyme solution pH, enzymatic hydrolysis temperature tostudy the rate of total flavone extract of bells. Orthogonal test to determine the besttechnology. Results on Bell grass total yellow ketone extraction rate of primary andsecondary effect order: enzyme solutions pH enzyme solutions time materialliquid than ethanol concentration; determine has enzyme method extraction Bellgrass total yellow ketone of best process conditions for ethanol concentration 60%,and material liquid than 1:25, and enzyme solutions pH4.40, and enzyme solutionstime 150min, and enzyme solutions temperature 55 C, and cellulose enzyme dosage8mg/g, on this best conditions , yellow ketone extraction rate for 0.64%. Conclusionscellulose enzyme-assisted extraction process of total flavones from Bell grass iscertainly feasible, Hoping can provide the reference for the secondary development ofBell grass.Key words： cellulase； Bell grass； flavonoid compounds； extraction technology ；single element and orthogonal experiment酶法提取响铃草总黄酮工艺研究响铃草为豆科植物假地蓝的干燥全草，作为民间中草药，响铃草有着悠久的药用历史，它主要分布在四川、贵州、云南、等地。功能主治：耳聋耳鸣、扁桃体炎、久咳痰血、疗毒恶疮、淋巴腺炎、月经不调等。史载于明代慎南本草,其味苦微酸、性较寒，归肺、肝、肾经。其主要的化学成分为生物碱、黄酮、有机酸、香豆素、昔类和箭醇等。目前，国内外也已经有许多学者对响铃草黄酮提取物进行研究。但是文献检索未发现有对响铃草进行酶法辅助提取的报道。研究的目的旨在为响铃草的开发利用提供参考，为响铃草更好的应用于临床提供理论依据。1材料、仪器与试剂1.1材料响铃草，购于安微省毫州市三义堂药业有限责任公司；纤维素酶（湖州米线生物科技有限公司）芦丁（中国药品生物制品检定所）；1.2试剂亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、柠檬酸、氢氧化钠、磷酸氢二钠均为分析纯。1.3仪器AUY220电子分析天平，PHS-3E pH计；XPF型（pl75圆盘粉碎机（天津市华联矿山仪器厂）；科瑞电动缩分机（中国镇江市科瑞制样设备有限公司）；HH-4恒温水浴锅（江苏金坛宏华仪器厂）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱（上海秣马恒温设备厂）；科瑞快速压紧制粉机（中国镇江市科瑞制样设备有限公司）；V-5800型可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；2实验方法2.1工艺流程准确称取响铃草粉末1.00g,用一定的料液比的乙醇溶液在酶解pH、酶解温度、纤维素酶用量的条件下酶解一定时间后，在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤，减压浓缩，用60%乙醇定容于50ml容量瓶中，得到总黄酮提取液。2.2总黄酮含量测定方法2.2.1对照品溶液的制备 准确称取芦丁 0.0950g,用60%乙醇溶解并定容至250mL的容量瓶中，得到浓度为0.38mg/mL的芦丁对照品溶液。2.2.2标准曲线的绘制E 分别精密量取芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠l.OmL摇匀，静置6min,再准确加入10%硝酸铝l.OmL摇匀，静置6min,然后准确加入4%氢氧化钠lOmL,用60%乙醇定容充分摇匀，静置15min后，以缺芦丁溶液为空白，于510mm波长下测定吸光度绘制标准曲线（见图1）。以对照品溶液浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，得线性回归方程为：A=7.3308C-0.0044, R2=0.9997。结果表明芦丁在0.0000-0.0912 mg/mL范围内呈良好线性关系。芦丁浓度（mg/mL）图1标准曲线2.2.3响铃草总黄酮的含量测定 从总黄酮提取液中准确吸取10mL定容于25mL容量瓶中，按照“2.2.2”项下操作于510mm波长下测定吸光度A,利用线性回归方程求得浓度c,再按下式计算黄酮的提取率。黄酮的提取率（%） = （cxVxn） /m xlOO%式中：c为黄酮质量浓度，mg/mL； V为25mL； n为稀释倍数，n=5； m为样品的质量，go2.3提取工艺优化2.3.1单因素试验2.3.1.1乙醇浓度对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份，用15mL的40%、50%、60%、70%乙醇，在酶解pH为4.00、酶解温度45C,纤维素酶用量8.0mg/g,酶解时间60min的条件下酶解后，在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤，得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮提取液的吸光度，由线性回归方程计算总黄酮的浓度，再求总黄酮的提取率，结果如图2所示。图2乙醇浓度对响铃草总黄酮提取率的影响从图2中可看出，随着乙醇溶液浓度的增加，黄酮的提取率增大，在乙醇溶液浓度在60%时提取率最大，后随乙醇溶液浓度的增大而呈下降趋势。原因可能浓度较高的乙醇溶液使得一些亲脂性杂质大量溶出，这些杂质与黄酮类化合物竞争与提取溶剂体系结合，影响总黄酮的吸光度的测定，也可能是高浓度的乙醇导致酶的活性减弱，从而导致总黄酮提取率下降。2.3.1.2料液比对响铃草总黄酮提取率的影响准确称取1.00g响铃草粉末4份,按料液比1:15、1:20、1:25、1:30加入60%的乙醇溶液，在酶解pH为4.00、酶解温度50C、纤维素酶用量8.0mg/g,酶解时间60min的条件下进行酶解后,在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤，得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度，由线性回归方程计算总黄酮的浓度，再求总黄酮的提取率，结果如图3所示。图3料液比对响铃草总黄酮提取率的影响从图3中可看出，随着料液比的增大，黄酮的提取率也随之增大，但料液比为1:25后随料液比的增大黄酮提取率降低，但要考虑到黄酮提取率、溶剂用量以及能耗增加，所选择料液比为1:25是较为理想的提取条件。2.3.1.3纤维素酶用量对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份，分别加入25mL的60%乙醇，在酶解pH为4.00、酶解温度45C,酶解时间60min的条件下，分别加入纤维素酶用量4.0mg/g、6.0mg/g, 8.0mg/g,10.0mg/g进行酶解后，在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤，得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度，由线性回归方程计算总黄酮的浓度，再求总黄酮的提取率，结果如图4所示。图4纤维素酶用量对响铃草总黄酮提取率的影响从图4中可看出，纤维素酶用量在4.0mg/g到8.0mg/g之间，黄酮的提取率增大，但当酶用量大于8.0mg/g的时候，黄酮的提取率基本保持不变，说明响铃草中总黄酮基本提取完全。考虑到黄酮提取率及物料消耗增加等，所以纤维素酶用量8mg/g是较为理想的提取条件。2.3.1.4酶解时间对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份，分别加入25mL的60%乙醇，在酶解温度50C、纤维素酶用量8mg/g,酶解pH为4.00的条件下，分别按酶解时间60、90、120、150min进行酶解后，在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤，得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度，由线性回归方程计算总黄酮的浓度，再求总黄酮的提取率，结果如图5所示。图5酶解时间对响铃草总黄酮提取率的影响由结果（图5）可知，酶解时间在60min到150min之间，提取率升高，但当酶解的时间为120min时黄酮提取率随酶解时间的升高，提取率变化不大，说明响铃草中总黄酮基本提取完全。考虑到黄酮提取率、物料消耗增加以及经济效益等，所以选择酶解时间90150min为正交优化的范围。2.3.1.5酶解PH对响铃草总黄酮提取率的影响准确称取1.00g响铃草粉末4份,分别加入25mL的60%乙醇，在酶解温度50C、纤维素酶用量8.0mg/g、酶解时间90min的条件下，分别在酶解pH值为4.00、4.40、4.80、5.20的条件下进行酶解后，在80C条件下灭酶lOmin,过滤，得到总黄酮提取液。按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度，由线性回归方程计算总黄酮的浓度，再求总黄酮的提取率，结果如图6所示。图6酶解pH对响铃草总黄酮提取率的影响由图6可知，随着酶解pH值的升高，提取率升高，当酶解PH值达到4.40时提取率最高，随后酶解pH值的升高，提取率反而降低。原因可能是PH影响酶的活性，从而使总黄酮的溶出减少，降低了黄酮的提取率。2.3.1.6酶解温度对响铃草总黄酮提取率的影响 准确称取1.00g响铃草粉末4份，分别加入25mL的60%乙醇，在酶解pH为4.40、纤维素酶用量8.0mg/g,酶解时间90min的条件下，分别在酶解温度为45C、50C、55C、60C的恒温水浴锅中酶解后，在80C恒温水浴锅中灭酶lOmin,过滤，得到总黄酮提取液按“2.2.3”项测定黄酮的提取液的吸光度，由线性回归方程计算总黄酮的浓度，再求总黄酮的提取率，结果如图7所示。O. 60图7酶解温度对响铃草总黄酮提取率的影响根据图7可知，温度在45C到55C之间，提取率升高，在温度为55C时提取率最高，随后温度再增加，提取率反而降低。原因可能是高温使蛋白质变性，从而导致酶失活，影响了黄酮类化合物的溶出，从而降低了黄酮的提取率，所以酶解温度为55C是响铃草提取总黄酮较为理想的提取条件。2.3.2正交试验在上述试验的基础上，以黄酮提取率为考察指标，选取乙醇浓度、料液比、酶解pH、酶解时间为考察因素进行正交试验，因素水平表见表1,试验安排及结果见表2。表1因素水平表水平A乙醇浓度B料液比g/mLC酶解pHD酶解时间min1501:204.00902601:254.401203701:304.80150表2正交试验安排及结果实验号ABCD提取率()111110.39212220.61313330.59421230.59522310.56623120.49731320.50832130.54933210.50Ki1.591.481.421.45k21.641.711.701.60k31.541.581.621.72R0.100.230.320.27由表2可知，A、B、C、D四个因素对响铃草总黄酮提取率的主次影响顺序为CDBA,即酶解pH酶解时间料液比乙醇浓度；确定最佳工艺条件为A2B2C2D3,即乙醇浓度60%、料液比1:25、酶解pH4.40、酶解时间150min。2.3.3验证试验正交试验不包括最佳组合A2B2C2D3,因此需要进一步验证试验，在最佳工艺条件下进行3次平行试验，响铃草总黄酮提取率分别为0.63%、0.64%、0.64%,平均为0.64%,结果比正交试验和单因素试验中提取率都高，并且重现性比较好,所以该提取条件可行。3结论3.1通过酶法提取响铃草总黄酮的工艺研究通过单因素试验和正交试验得出，影响黄酮提取率的因素主次顺序为：酶解pH酶解时间料液比乙醇浓度。3.2单因素试验和正交试验研究表明酶法辅助提取技术是可以有效地提取响铃草黄酮类化合物，确定了酶法提取响铃草总黄酮的最佳工艺条件为乙醇浓度60%、料液比1:25、酶解pH4.40、酶解时间150min、酶解温度55C,纤维素酶用量8mg/g,在此最佳条件下，黄酮提取率为0.64%。文献综述黄酮具有较强的生物活性,可延缓细胞的退化、衰老、改善血液循环、降低胆固醇等。响铃草为豆科植物假地蓝的全草或带根全草，黄酮作为其成分之一，具有较强的药理活性，对其的研究已成为新药开发的方向，对其提取工艺进行优选更是国内外学者争相研究的内容。本法采用纤维素酶辅助提取响铃草中总黄酮，通过单因素试验和正交实验，对响铃草中总黄酮提取工艺进行了优选，对工业化大生产有一定的参考价值。1黄酮类化合物的概述黄酮类化合物是广泛存在于自然界的一大类化合物，它在植物的生长过程中起着重要的作用,主要存在于爵床科、唇形科、玄参科、苦苣苔科、杜鹃科和菊科等植物中因其母核上大多含有羟基、异戊烯氧基、甲氧基、等取代基，使该类化合物显黄色，故称黄酮或黄碱素四。黄酮类化合物的经典概念主要是指基本母核为2-苯基色原酮的一系列化合物。现在泛指两个苯环(A与B环)通过三个碳原子相互连结而成的一系列化合物冏。根据黄酮类化合物A环和B环中间的三碳链的氧化程度、三碳链是否构成环状结构、3位是否有羟基取代以及B环(苯基)连接的位置(2位或3位)等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分为以下几大类黄酮和黄酮醇类(2) 二氢黄酮和二氢黄酮醇类(3) 异黄酮和二氢异黄酮类(4) 查耳酮和二氢查耳酮类(5) 黄烷醇类(6) 花色素类橙酮类(8) 双黄酮类(9) 双苯骈此喃酮类(10) 高异黄酮2黄酮类化合物的药理作用2.1黄酮类化合物抗菌活性大量文献表明，大部分的黄酮类化合物对革兰氏阴性菌具有较好的抑制效果，对于真菌的抑制效果较弱。学者们对黄酮化合物的抗菌机制学说有多种，例如：谢鹏等1指出黄酮类化合物属于多酚类化合物，可破坏细胞的细胞壁和细胞膜，从而对微生物的生长产生抑制。2.2黄酮类化合物抗炎活性张成义等侦研究发现，黄酮类化合物对兔耳产生的冻伤性炎症具有较强的抑制作用。其抗炎机制在于它能够抑制过氧化物的产生，从而发挥抗炎作用。2.3黄酮类化合物抗氧化活性黄酮类化合物的抗氧化作用，受到人们的普遍重视。主要机制在于它能够清除自由基，许多常见的病理生理现象，如衰老、肿瘤、突变、变态反应、缺血再灌注损伤等都与氧自由基有密切关系。2.4黄酮类化合物抗肿瘤作用黄酮类化合物的抗肿瘤机制主要与这几个方面有关抑制癌细胞的无限增殖、抑制新生血管的形成、抑制癌细胞的迁移和提高机体的免疫力。2.5黄酮类化合物对心血管系统活性查文献得知，黄酮类化合物的研究取得了很大的进展，目前临床治疗心血管疾病的中成药大多含有黄酮类化合物，去氧黄酮一立可定(Recordil)对冠状血管有较明显的扩张作用，并且能够增加冠状的动脉血流量；舒血宁一由银杏叶制成,临床用于治疗Ml冠心病和心绞痛。2.6黄酮类化合物抗人类免疫缺陷病毒活性现代药理研究表明：很多黄酮类化合物能够抑制HIV病毒与宿主细胞的融台，并且能够对蛋白酶和逆转录酶的生物活性起到抑制作用。从而对HIV病毒发挥抑制作用。2.7黄酮类化合物抗抑郁活性近年来，随着社会的进步，经济的发展，人们生活压力越来越大，抑郁症的发病率也越来越高。此时，人们也越来越关注天然活性成分黄酮类化合物的抗抑郁作用。2.8黄酮类化合物的其他活性黄酮类化合物还具有促进毛发生长、解痉、抗过敏、保肝护肝、止咳祛痰、抗疲劳等作用。3黄酮类化合物的提取方法3.1煎煮法此法成本低、安全、适合于工业大生产.李冬菊SI等从山桔叶中用煎煮法提取出了总黄酮，不产生任何的污染和化学反应，是比较理想的提取途径。此工艺设备简单、安全，但是提取杂质较多，收率较低和费时等缺点16。3.2有机溶剂提取法常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙酵等。此法虽然对设备要求简单，提取率较高，但是成本也高，杂质含量也较高。常见的有冷浸法、渗滤法和回流法等。3.3碱性水、碱性稀醇浸提法黄酮类化合物大多属于多酚类化合物，因其结构中含有酚羟基，呈现弱酸性。所以可以用碱性水或碱性稀醇来提取。但部分黄酮类化合物在酸性稀醇中会有一定的溶解度，故可能降低产品的收率。3.4微波提取法微波提取法的优点：操作简便，很少的耗能耗材、选择性高、提取率高、不产生噪音等。但微波提取法有一定的限制，不适合用于热敏性物质的提取。3.5大孔树脂吸附法研究表明，大孔树脂吸附法与传统的提取方法相比，具有操作简单，有机溶剂耗费少、树脂再生容易和提取率高等优点。3.6酶解法酶解法的基本原理：用相应的酶充分破坏以纤维素为主的植物细胞壁结构，使黄酮类物质最大限度的溶出力。酶解法的优点：具有专一性高、作用温和及催化活性强、不破坏天然产物的构象、立体结构、生物活性，有利于原有药效的保持。缩短提取的时间，提高提取的效率。操作方法简单易行，对设备要求也不是特别高。酶解法作为中药提取的一种新的途径，具有广阔的应用前景。文献检索也未发现有学者进行酶法提取响铃草总黄酮的工艺研究。4黄酮类化合物的应用在临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛等；在食品行业，是重要的功能食品添加剂；在兽药、农药等领域，被用作药品和驱虫、杀虫剂等mi。由此可见，天然黄酮类化合物应用前景广阔，值得我们去研究、去开发。5响铃草的来源及植物形态响铃草为豆科植物假地蓝的干燥全草。子房线形，花柱长，柱头稍斜。荚果膨胀成膀胱状，长2.53厘米。种子2030颗，肾形。花期6-10月。分布山坡、荒地。我国大部分地区有分布，而以西南为多见。夏季采收，晒干，或切断晒干。6响铃草药材形态茎呈圆形，全体有黄棕色茸毛。叶片稍卷曲，多脱落，呈椭圆形或卵形，黄绿色。枝端带有荚果，种子大多脱落。带根者，根蜿蜒稍长，圆形，少分枝，须根细长，表面呈土黄色。7响铃草化学成分张旭i等人对响铃草化学成分进行了研究鉴定出如下化合物：5,7-二羟基-4-甲氧基黄酮-7-O-P-D-葡萄糖昔、二十八烷醇、催吐萝芙木叶醇（3-氧化-6-羟基紫罗兰醇）、染料木素、声谷箭醇、豆箭醇、22豆箭醇-3-0书-DM匕喃葡萄糖昔等。吴贞建RO】从响铃草抗菌活性组分中也分离得到几种化合物有豆笛醇、高山金链花素、正二十三烷、4，,7-二甲氧基-5-羟基黄酮正烷、4，,7-二羟基异黄酮、大豆皂醇B等。以上发现的这些化学成分都以黄酮类为主。8响铃草的药理活性响铃草史载于明代慎南本草，其味苦微酸、性寒，归肺、肝、肾经。目前，国内外也已经有许多学者对响铃草化学成分进行研究。黄酮类化合物是响铃草主要活性成分，响铃草具有增强机体免疫力、抗癌和治疗心脑血管系统疾病作用与其所含染料木素有关。叶敏El等人研究表明，响铃草总黄酮对自由基有很好的清除作用。吴贞建Ml等人通过对响铃草体外抗菌活性研究表明，其对金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用。夏永宾25等人对响铃草抗炎镇痛部位进行了确定。这都将对响铃草的进一步开发利用提供参考依据。9响铃草功用主治清热利湿，因为响铃草味苦，性微寒，从中医学的角度，苦能燥湿，寒能清热，因此有清热利湿的功效，常用于治疗淋证；能够补肺气,因为它能入肺经，可用于治疗久咳，虚喘；能够补肾消水肿，因其能入肾经，有补肾，消水肿的功效；也可用于治疗耳鸣耳聋，遗精，水肿等证。能够清热解毒，可用于治疗疔疮，丹毒等症。10研究的目的与意义黄酮类化合物具有抗肿瘤活性、抗炎、抗氧化活性、抗菌及抗病毒活性，还具有抗衰老、降血脂、泻下、止咳、祛痰、解痉等活性，广泛应用于医药、食品等领域。黄酮类化合物又是响铃草的主要活性成分，作为响铃草药材质量的参考指标。目前对响铃草提取工艺方面的研究非常少，更未见酶法辅助提取响铃草的报道。通过酶法辅助提取，对响铃草的提取工艺进行了优选，增大了原料的提取率。这将对天然黄酮类化合物的开发利用提供参考，将天然黄酮类化合物更好的为人类服务，更多的应用于临床。参考文献I 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