单细胞转录组测序在多发性大...脉炎肾动脉病变中的初步探索_高擎.pdf

中 国 医 学 科 学 院 学 报ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE80February，2023基金项目:中央高水平医院临床科研业务费(BJ-2021-196);第一、二位作者对本文贡献一致技术与方法单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索高擎1，吴志远2，李海洋1，李拥军21首都医科大学附属北京安贞医院心血管外科，北京 1000292北京医院血管外科，北京 100730通信作者:李拥军电话:[phone]，电子邮件:摘要:目的探索单细胞转录组测序(scNA-seq)在多发性大动脉炎(TA)肾动脉病变中的初步应用。方法纳入 2 例北京医院血管外科进行肾动脉手术搭桥治疗的 TA 患者，将其肾动脉组织样本分别采用 GEXSCOPE 试剂盒和自配消化液 2 种酶解方式，并进行 scNA-seq 和生物信息学分析。结果共获取 2920 个细胞纳入下游分析。经过无偏聚类分析后，确定 2 种内皮细胞、2 种平滑肌细胞、1 种成纤维细胞、2 种单核巨噬细胞、1 种 T 细胞及 1 种未定义的细胞。其中，2 种平滑肌细胞主要表现为收缩型及分泌型。scNA-seq 分析结果显示试剂盒酶解法获取的细胞以内皮细胞(57.46%)为主，免疫细胞(13.21%)较少，而自配消化液酶解法获取的细胞以免疫细胞(34.64%)为主。结论scNA-seq 可用于区分 TA 患者病变血管的细胞异质性，不同酶解方式会影响获取细胞的种类与数量。关键词:大动脉炎;单细胞测序;细胞异质性;内皮细胞;平滑肌细胞中图分类号:654.3文献标志码:A文章编号:1000-503X(2023)01-0080-08DOI:10.3881/j.issn.1000-503X.15006Preliminary esults of Single-cell Transcriptome Sequencing inenal Arterial Lesions of Takayasu ArteritisGAO Qing1，WU Zhiyuan2，LI Haiyang，LI Yongjun21Department of Cardiovascular Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing 100029，China2Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital，Beijing 100730，ChinaCorresponding author:LI YongjunTel:010-85132266，E-mail:ABSTACT:ObjectiveTo explore the preliminary application of single-cell NA sequencing(scNA-seq)in the renal arterial lesions in Takayasu arteritis(TA)patients.MethodsThis study included 2 TA patientswith renal artery stenosis treated by bypass surgery in the Department of Vascular Surgery，Beijing Hospital.Theobtained 2 renal artery samples were digested with two different protocols(GEXSCOPE kit and self-made diges-tion liquid)before scNA-seq and bioinformatics analysis.esultsA total of 2920 cells were obtained for fur-ther analysis.After unbiased cluster analysis，2 endothelial cell subsets，2 smooth muscle cell subsets，1 fibro-blast subset，2 mononuclear macrophage subsets，1 T cell subset，and 1 undefined cell subset were identi-fied.Among them，the two subsets of smooth muscle cells were contractile and secretory，respectively.The resultsof scNA-seq indicated that enzymatic hydrolysis with GEXSCOPE kit produced a large number of endothelialcells(57.46%)and a small number of immune cells(13.21%).However，immune cells(34.64%)weredominant in the cells obtained by enzymatic hydrolysis with self-made digestive liquid.ConclusionscNA-seq单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索Vol.45 No.181can be employed to explore the cellular heterogeneity of diseased vessels in TA patients.Different enzymatic diges-tion protocols may impact the proportion of different cells.Key words:Takayasu arteritis;single-cell NA sequencing;cellular heterogeneity;endothelial cell;smooth muscle cellActa Acad Med Sin，2023，45(1):80-87多发性大动脉炎(Takayasu arteritis，TA)是一种流行于东亚的具有高度特异性的自身免疫性血管炎性疾病，主要累及主动脉及其一级分支1。TA 患者早期几乎无特定的症状或体征，通常以全身性症状为主，常需借助影像学检查发现或诊断，中晚期病变可引起血管狭窄造成严重的器官缺血甚至坏死，导致脑梗死或心肌梗死等2。前期大量研究发现 TA 是一种涉及 CD4+T 细胞、树突样细胞(dendritic cell，DC)、白细胞介素 6(interleukin 6，IL-6)信号通路和巨噬细胞浸润的自身免疫病3-5。未知抗原通过 DC 表面特异性受体激活这一类抗原提呈细胞 6，分泌多种炎症因子，促进CD4+T 细胞分化为Th17 细胞，诱导IL-17、IL-21、IL-22 的产生参与下游的细胞毒性反应 7。然而，由于该病具体发病机制不明，目前多采用免疫抑制剂或生物制剂等药物治疗。单细胞 NA 测序(single-cell NAsequencing，scNA-seq)技术作为一种新的功能强大的高通量测序技术，可通过分析其捕获的单个细胞的转录组，获取更加详细的细胞信息，进而对比不同状态下细胞的异质性 8。scNA-seq 技术在颈动脉斑块 9、腹主动脉瘤 10 等血管外科疾病中已经得到广泛应用。本团队前期采用 scNA-seq 技术初步探索了 TA 患者与健康人群外周血炎症细胞的占比差异，结果发现 TA 患者CD14+单核细胞比例显著增加 11。但是目前关于scNA-seq 技术应用于 TA 血管壁组织的研究报道较少，不同酶解方式获取的细胞种类亦有不同。因此，本研究旨在探索 scNA-seq 在 TA 肾动脉病变中的初步应用，同时为 TA 的后期多样本单细胞研究提供实验基础。对象和方法对象2019 年 10 月至 2020 年 2 月北京医院血管外科收治的 2 例女性 TA 患者。患者的体征、血清学及影像学检查结果均符合1990 年美国风湿病协会关于TA 的诊断标准12。本研究通过北京医院伦理委员会批准(伦理审批编号:2018BJYYEC-030001)，2 例患者均签署知情同意书。酶解方法采用2 种不同的酶解方法处理 TA 患者的肾动脉样本，其中，TAKA-1 样本采用 GEXSCOPE试剂盒(Singleron Biotechnologies 公司，中国香港)酶解法，TAKA-2 采用本中心配制的纤维蛋白酶+透明质酸酶+DNA 酶的复合消化液(自配消化液)酶解法，相关酶配制方案正在申请专利中。scNA-seq 技术将单细胞悬液加载到微流控芯片上，使用 GEXSCOPE单细胞 NA 文库试剂盒(Sin-gleron Biotechnologies 公司，中国香港)根据 SingleronGEXSCOPE操作说明书构建 scNA-seq 文库。将文库稀释至4 nmol/L，使用 Illumina Novaseq 6000 测序平台进行测序，测序模式为 150 bp 双端测序。数据质量控制、处理和分析采用 studio(Ver-sion 1.4.1717)中的 Seurat 进行单细胞表达矩阵的质量控制、前期处理和数据分析。每个 Seurat 对象都是用在 3 个以上细胞中表达的基因创建的。其他质量控制条件设置为:(1)每个细胞内所包含的 mNA 种类应在 200 至 3000 之间;(2)每个细胞内所包含的粒体基因占全部 mNA 的比值应小于 25%。经过质量控制后，最终获取2920 个细胞。使用 CellCycleScoring 函数计算细胞周期阶段评分。采用 SCTransform 来减少潜在的批次效应或技术变化。主成分分析设置在 120，然后进行无监督的细胞聚类。利用 FindAllMarkers 及其默认参数用于获取每个簇中特定的差异表达基因，然后选择代表性标记(具有高 avg_logFC 和调整 P 0.05 的基因)进行簇标记。内皮细胞与血管平滑肌细胞各自不同亚群之间的差异表达基因采用 FindMarkers进行判定，并将调整 P 0.05 的基因用于京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG)通路分析。结果一般情况共纳入2 例行肾动脉重建术的 TA 患者。2 例患者均接受过药物治疗，但病情仍未控制，影像学检查提示肾动脉严重狭窄，故行肾动脉搭桥手术，并留取肾动脉样本。TA 肾动脉组织的 scNA-seq 及无偏聚类分析TA肾动脉组织样本经 scNA-seq 测序后，共有 2920 个细胞用于下游数据分析，其中1476 个细胞来源于 TAKA-中 国 医 学 科 学 院 学 报82February，20231 样本，1444 个细胞来源于 TAKA-2 样本。无偏聚类分析共获取 2 种内皮细胞(endothelial cell，EC)、2种血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)、1 种成纤维细胞、2 种单核巨噬细胞、1 种 T 细胞及 1种未定义的细胞(图 1A)。2 个样本的分布范围基本相同，但不同区域的分布密度不同(图 1B)。EC 的代表性基因为 ACK1、VWF、PECAM1 等(图 1C)。TA 肾动脉组织的 EC 与 VSMC 的细胞异质性根据不同基因在各细胞亚群的表达情况绘制点图，包括EC-1(ADAMTS1、CSF3、STC1)、EC-2(AMP2、IFI27、FABP4)、VSMC-1(C11orf96、SOBS2、MYL9)、VSMC-2(MYH10、FN1、POSTN)、成纤维细胞(CFD、FBLN1、DCN)、单核巨噬细胞 1(S100A9、S100A12、LYZ)，单核巨噬细胞 2(HLA-DPA1、C1QC、C1QB)，T 细胞(CCL5、IL7、CD69)，未定义的细胞(TAOK1、LINC01681、SPATA22)(图2)。EC 分为2 种细胞亚群，其中，EC-1(n=64)主要高表达 ACK1、ADAMTS4、ICAM1、VWF、IL6 基因，EC-2(n=75)主要高表达CD36、FABP4、ICAM2、CLDN5、TIMP3 基 因(图3);KEGG 通路分析显示，EC-1 细胞主要参与 IL-17、肿瘤坏死因子、核因子 B 等信号通路，而 EC-2 细胞则主要分泌细胞黏附分子等(图 4)。VSMC 分为 2 种细胞亚群，其中，VSMC-1(n=24)呈现经典的收缩型，VSMC-2(n=86)则表达更多与纤连蛋白和胶原相 关 的 基 因 如 FN1、COL1A1、COL3A1 等(图5)，且表达的一些基因参与磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B、晚期糖基化终末产物(受体)等信号通路(图6)。EC:内皮细胞;VSMC:血管平滑肌细胞A.无偏聚类分析发现 9 种细胞亚群;B.两样本细胞分布 UMAP 图;C.各细胞亚群代表性基因表达情况图 1多发性大动脉炎肾动脉组织单细胞 NA 测序结果单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索Vol.45 No.183图 29 种细胞亚群的高表达基因点图不同酶解方式对细胞类型的影响GEXSCOPE 试剂盒酶解方式获取的细胞以 EC(57.4%)为主，其次为 VSMC(16.5%)和免疫细胞(单核巨噬细胞和 T细胞)(13.3%)。自配消化液酶解方式获取的细胞则以免疫细胞(单核巨噬细胞和 T 细胞)(34.6%)为主，其次为成纤维细胞(29.7%)和 EC(27.1%)(表1)。讨论TA 作为一种自身免疫性疾病，其发病机制并不明确。目前 TA 的临床治疗主要是以药物治疗为主，但仍有近20%的患者病情会进展并需采用外科干预 13-14，以改善器官缺血或者肾血管性高血压。在药物治疗方面，主要以激素和免疫抑制剂为主，尚无特异性针对TA 的药物15。尽管前期已有部分研究采用一些生物制剂治疗 TA16-17，但效果并不十分满意。因此，对TA 发病机制进行深入探究并为临床药物开发提供一定的依据仍是现阶段的研究重点。本团队前期采用 scNA-seq 技术对 TA 患者外周血进行分析发现，CD14+单核巨噬细胞的占比较正常人明显升高11，同时与氧化应激密切相关的 TXNIP、AGE 等基因通路的表达也有所升高，提示单核巨噬细胞所参与的氧化应激反应可能与 TA 发病相关。在TA 患者动脉组织研究方面，Hadjadj 等18 发现 TA 患者的血清抗体可以通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路刺激血管 EC 增殖。Dos 等19 发现在 TA 患者病变血管壁中，巨噬细胞的数量远高于 B 细胞、T 细胞及 NK 细胞。Chen 等20 在 IL-6 的诱导实验中证实，TA 患者的成纤维细胞在 IL-6 的作用下可以激活 Janus激酶通路，促进纤维蛋白的合成。scNA-seq 作为一种新型转录组测序方法，可用以分析 TA 患者血管壁的细胞异质性，并发现各种细胞类型潜在的功能与作用8，为探索 TA 发病机制提供有利的线索。目前，scNA-seq 技术应用于 TA 动脉组织的研究报道较少。本研究尝试采用两种酶解方法探索 EC 与 VSMC 的细胞异质性。有研究表明 EC 参与了 TA 的进展，如 EC 增殖及自身抗原等。Inder 等21 通过病理染色发现 TA 患者病变血管上 EC 发生增殖。Mutoh 等22 在 TA 患者 EC 细胞膜表面发现了内皮蛋白C 受体和 B 类型清道夫受体2 种自身抗原，并在患者血清中发现可以结合这 2 种抗原的自身抗体，此外，进一步研究结果显示抗原抗体结合可促进 T 细胞的分化。本研究中 EC-1 表达大量的炎症因子(IL-6，ICAM1)，同时高表达 IL-17，肿瘤坏死因子，晚期糖基化终产物及其受体信号通路;EC-2 高表达 ICAM2，TIMP3 和白细胞跨膜通路，提示EC 在TA 疾病进展中可能发挥着关键作用。VSMC 的表型转换过程在血管疾病中发挥着重要作用 23，已有病例报告提出 VSMC 的凋亡可能参与 TA 的进展24，也有研究显示 VSMC 增殖也促进 TA 炎症反应25，但相关机制未明。本研究中发现2 种 VSMC 细中 国 医 学 科 学 院 学 报84February，2023图 32 种 EC 的高表达基因KEGG:京都基因与基因组百科全书图 4KEGG 通路分析显示 2 种 EC 参与的信号通路图 52 种 VSMC 的高表达基因单细胞转录组测序在多发性大动脉炎肾动脉病变中的初步探索Vol.45 No.185图 6KEGG 通路分析显示 2 种 VSMC 参与的信号通路表 1各细胞亚群的细胞数及占比 n(%)细胞亚群样本 1(n=1476)样本 2(n=1444)EC-1592(40.1)356(24.7)EC-2255(17.3)36(2.5)VSMC-1234(15.9)86(6.0)VSMC-29(0.6)26(1.8)成纤维细胞182(12.3)429(29.7)单核巨噬细胞 111(0.7)163(11.3)单核巨噬细胞 222(1.5)105(7.3)T 细胞163(11.0)232(16.1)未定义细胞群8(0.5)11(0.8)胞亚群，其中 VSMC-1 为经典的收缩型 VSMC，主要高表达 ACTA2、MYH11 基因等;而 VSMC-2 则高表达FN1、COL3A1、COL1A1 基因等，主要编码纤连蛋白和胶原相关的成分。尽管本研究中获取的 VSMC 数量较少，但 VSMC 异质性的结果仍提示在 TA 进展过程中 VSMC-2 也许发挥着更重要的作用，但尚需进一步的实验验证。酶解消化是单细胞测序技术的首要操作步骤，但是由于血管壁结构细胞及免疫细胞对不同酶的反应性与耐受性不同，因此，根据不同的研究目的，需要将消化酶的种类、浓度及消化时间等因素进行综合考虑，选择适合的酶解方案，以获得理想的消化效果。近期一项在人腹主动脉瘤的 scNA-seq 研究中，美国密歇根大学 Gallagher 教授团队针对腹主动脉瘤血管壁的酶解方案结果可获取较多的免疫细胞，而结构细胞如 EC、VSMC 等较少26。本研究中采用的 2 种酶解方法初步结果显示，TAKA-1 样本(GEXSCOPE 试剂盒酶解法)中以结构细胞(包括 EC 和 VSMC)为主，免疫细胞占比较低，而 TAKA-2 样本(自配消化液酶解法)中免疫细胞占比明显升高，说明 GEXSCOPE试剂盒酶解法更适合结构细胞的功能研究，而自配消化液酶解法更适合免疫细胞的功能研究。本研究存在以下局限性:(1)样本数量少，可能出现个体样本差异性误差;(2)样本体积小，由于手术术式的限制，所获取的样本体积较小。综上，本研究结果表明，scNA-seq 揭示了 TA 患者肾动脉组织的细胞异质性，EC 及 VSMC 在 TA 疾病发展过程中可能发挥了重要作用。同时，不同酶解方式可能会造成最后获取细胞的种类与数量的不同，因此需结合研究目的，选择适宜的酶解方案。参考文献 1 陈作观，刁永鹏，刘静思，等.大动脉炎外科分型研究中 国 医 学 科 学 院 学 报86February，2023进展 J 中华医学杂志，2016，96(28):2277-2280.DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.28.019.2 Keser G，Aksu K，Direskeneli H.Takayasu arteritis:an up-date J Turk J Med Sci，2018，48(4):681-697.DOI:10.3906/sag-1804-136.3 Arnaud L，Haroche J，Mathian A，et al.Pathogenesis ofTakayasu s arteritis:a 2011 update J Autoimmun ev，2011，11(1):61-67.DOI:10.1016/j.autrev.2011.08.001.4 Zaldivar Villon MLF，de la ocha JAL，Espinoza L.Takayasuarteritis:recent developments J Curr heumatol ep，2019，21(9):45.DOI:10.1007/s11926-019-0848-3.5 Watanabe，Berry GJ，Liang DH，et al.Pathogenesis ofgiant cell arteritis and Takayasu arteritis-similarities anddifferences J Curr heumatol ep，2020，22(10):68.DOI:10.1007/s11926-020-00948-x.6 Seko 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