丹皮酚通过TLR4_MAP...W264.7损伤的保护作用_刘玉龙.pdf

海南医学院学报 2023，29（3）Journal of Hainan Medical University丹 皮 酚 通 过 TLR4/MAPK/NFB 通 路 对 LPS 诱 导 的 巨 噬 细 胞RAW264.7损伤的保护作用刘玉龙，孙敏，刘科，颜贵明（安徽中医药大学，安徽 合肥 230012）摘要 目的：探讨丹皮酚对 LPS诱导的巨噬细胞 RAW264.7细胞炎症损伤的保护作用及其机制研究。方法：培养巨噬细胞 RAW264.7，并分成空白组、LPS（1 g/mL）组、丹皮酚（240 mol/mL）组和 TAK242（10 mol/mL）组。采用 CCK8 法检测细胞活性，倒置显微镜观察细胞形态，比色法测定细胞培养液中 GSH、MDA含量，JC-1法检测线粒体膜电位，免疫荧光法检测 F4/80及 p-NF-B蛋白表达分布，Western blotting检测细胞中 TLR4/MAPK/NF-B相关通路蛋白表达。结果：与空白组比较，1 g/mL LPS诱导的细胞活力为0.49720.061（P0.01），接近半数抑制率。与 LPS 组比较，240 mol/mL 丹皮酚预处理的细胞组下调p-NF-B 蛋白表达最显著（P0.01），10 mol/mL TAK242 预处理细胞组抑制 TLR4 蛋白表达最显著（P0.01）。与 LPS 组比较，丹皮酚组细胞形态有所恢复；降低细胞培养液中 MDA 含量、增高 GSH 含量（P0.01）；线粒体膜电位结果中，丹皮酚组红光显著增强，绿光显著减弱（P0.001）；丹皮酚组 F4/80 及p-NF-B 蛋白表达分布显著降低（P0.01），并下调了 TLR4、p-IB、p-p38、p-JNK、p-NF-B 蛋白表达（P0.05）。结论：丹皮酚可改善 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症损伤，其机制可能与 TLR4/MAPK/NF-B 通路相关。关键词 丹皮酚；巨噬细胞 RAW264.7；TLR4；NF-B中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-1237（2023）03-0183-08Protective Effects of Paeonol on LPSinduced Macrophage RAW264.7 Injury through TLR4/MAPK/NFB PathwayLIU Yu-long，SUN Min，LIU Ke，YAN Gui-ming（Anhui University of Traditional Chinese Medicine，Hefei 230012，China）Foundation Project：Anhui Natural Science Foundation（2008085MH300）Author：LIU Yu-long，E-mail：.Correspondence to：YAN Gui-ming，Professor，E-mail：.Received：2022-10-06 Revised：2022-11-29 JHMU，2023；29（3）：183-189View from specialist:It is creative,and of certain scientific and educational value.ABSTRACT Objective：To study the protective effect of paeonol on LPS-induced inflammatory injury of macrophage RAW264.7 cells and its mechanism.Methods：Macrophage RAW264.7 cells were cultured and divided into blank group，LPS（1 g/mL）group，paeonol（240 mol/mL）group and TAK242（10 mol/mL）group.The cell activity was detected by CCK8 method，the cell morphology was observed by inverted microscope，the contents of GSH and MDA in cell culture medium were determined by colorimetry，the mitochondrial membrane potential was detected by JC-1 method，the expression distribution of F4/80 and p-NF-B protein was detected by immunofluorescence method，and the expression of TLR4/MAPK/NF-B related path-way protein was detected by Western blotting.Results：Compared with the blank group，the cell viability induced by 1 g/mL LPS was 0.49720.061（P0.01），which was close to the half inhibition rate.Compared with LPS group，the expression of p-NF-B protein in 240 mol/mL paeonol pretreated cell group was down-regulated most significantly（P0.01），and the expres-DOI：10.13210/ki.jhmu.20221201.002网络出版地址：https：/ 安徽省自然科学基金（2008085MH300）作者简介 刘玉龙，E-mail：。通讯作者 颜贵明，教授，E-mail：。收稿日期 2022-10-06 修回日期 2022-11-29 网络出版时间：2022-12-02 17：26：34183海南医学院学报 Vol.29 No.3 Feb.2023sion of TLR4 protein was inhibited most significantly in 10 mol/mL TAK242 pretreated cell group.Compared with LPS group（P0.01），the cell morphology of paeonol group recovered.Decrease MDA content and increase GSH content in cell culture medi-um（P0.01），In the results of mitochondrial membrane potential，the red light of paeonol group was significantly enhanced and the green light was significantly weakened（P0.001）.The expression distribution of F4/80 and p-NF-B protein in paeonol group decreased significantly（P0.01），and the expressions of TLR4，p-IB，p-p38，p-JNK and p-NF-B protein were down-regulated（P99%）购 自 宣 城 市 百 草 植 物 工 贸 有 限 公 司，货 号（T1903202）；TAK242（TLR4 抑 制 剂）购 自 美 国MedChemexpress生 物 科 技 公 司，货 号（HY-100523）；CCK8 试剂盒、脂多糖（LPS）购自合肥 Biosharp 生 物 公 司，货 号 分 别（BS350B）（BS904）；胎牛血清购自天津康源生物技术有限公司，货号（KY-01000S）；GSH、MDA 生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号分别（A006-1-1）（A003-1-1）；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）购自北京索莱宝公司，货号（M8650）；p38MAPK 抗体购自 武 汉 三 鹰 生 物 技 术 有 限 公 司，货 号（14064-1-AP）；TLR4 抗体购自美国 Affinity 公司，货 号（AF7017）；NF-B、p-NF-B、p-p38、JNK、p-JNK 抗体购自成都正能生物技术有限责任公司，货 号 分 别（380172）（310052）（310091）（201001）（340810）；电泳仪购自北京六一仪器厂；K3 型酶标仪 购 自 美 国 赛 默 飞 世 尔 科 技 公 司；OLYMPUS-BX81倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。1.2实验方法1.2.1 巨 噬 细 胞 RAW264.7 培 养 将 RAW264.7细胞置于含有 10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM 培 养 基 中，放 于 37、5%CO2培 养 箱 中培养。1.2.2CCK8法检测不同浓度 LPS处理后的细胞活性将巨噬细胞 RAW264.7 种在 96 孔细胞培养板中，每孔 100 L，细胞种板浓度 3105/mL，24 h 后分别用 0、0.25、0.5、1、2、4 g/mL LPS，每组 3 个平行孔，置于培养箱中 24 h 后，每孔加入 10 L CCK8溶液，继续培养 2 h 后使用酶标仪在 450 nm 波长处检测每孔吸光度。1.2.3Western blotting 筛选丹皮酚及 TAK242 干预浓度将巨噬细胞 RAW264.7 3105/mL 接种于 6孔板中，每孔 2 mL，培养 24 h 后弃掉培养基，将细胞分成 8组，空白组加入 2 mL培养基、LPS（1 g/mL）组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 培养基、丹皮酚各组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 及丹皮酚浓 度 分 别 为 480、240、120 mol/mL 培 养 基，TAK242各组加入 LPS浓度为 1 g/mL及 TAK242浓度分别为 20、10、5 mol/mL 培养基，置于 37细胞培养箱培养 24 h，弃去培养基，加入 PBS 缓冲液清洗 2遍。加入 1 mL PBS溶液，使用细胞刮刀刮下细胞，12 000 r/min 离心 5 min，弃去 PBS，加入含1%PMSF 及 2%磷酸酶抑制剂的裂解液中，提取组织蛋白。煮沸 10 min变性，冷却后电泳。一抗稀释比例 TLR4、NF-B、p-NF-B 均 1 1 000，二抗稀释 比 例（1 5 000）。蛋 白 条 带 显 色 曝 光 后，使 用Image-J软件进行灰度值分析。1.2.4细胞形态观察将巨噬细胞 RAW264.7 3105/mL 接种于 6孔板中，每孔 2 mL，培养 24 h 后弃184刘玉龙等.丹皮酚通过 TLR4/MAPK/NF-B通路对 LPS诱导的巨噬细胞 RAW264.7损伤的保护作用掉培养基，将细胞分成 4 组，空白组加入 2 mL 培养基、LPS（1 g/mL）组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 培 养 基、丹 皮 酚（240 mol/mL）组 加 入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 及丹皮酚浓度为 240 mol/mL 培养基和 TAK242（10 mol/mL）组加入 2 mL LPS 浓度为 1 g/mL 及 TAK242 浓度为 10 mol/mL 培养基，置于 37细胞培养箱培养 24 h 后，使用倒置显微镜进行拍照（200）。1.2.5细胞培养液中 GSH、MDA 含量检测造模方法同 1.2.4，培养 24 h 后，取出培养基 3 000 r/min 离心 10 min，取上清，按照 GSH、MDA 试剂盒说明书进行测定。1.2.6细胞线粒体膜电位检测造模方法同 1.2.4，培养 24 h 后，弃去培养基，加入 PBS 缓冲液清洗两遍。加入 1 mL 细胞培养液和 1 mL JC-1 染色工作液，置于 37细胞培养箱孵育 20 min。之后吸出上清，加入 JC-1 染色缓冲液洗涤 2 次，再加入 2 mL 细胞培养基在倒置荧光显微镜下拍照（200）。1.2.7免疫荧光法检测 F4/80及 p-NF-B蛋白表达分布造模方法同 1.2.4，培养 24 h 后，弃去培养基，加入 PBS 缓冲液清洗两遍。4%多聚甲醛固定 20 min，PBS 清洗 3 次，0.1%Triton X-100 透化 5 min，PBS 清洗 3 次，10%BSA 封闭 30 min，滴加 F4/80（150）及 p-NF-B（1 100）抗体于 4冰箱孵育过夜，清洗 3 次，滴加山羊抗兔 IgG-FITC（1 100），孵育 1 h，PBS 洗 3 次，滴加 DAPI 工作液，染色 5 min，PBS洗 3次，荧光扛衰减封片剂封片，倒置荧光显微镜拍照（200）。1.2.8Western blotting 检测 TLR4/MAPK/NF-B通路蛋白表达造模方法同 1.2.4，蛋白提取方法同1.2.3。一抗稀释比例 p38、p-p38、JNK、p-JNK、IB、p-IB 抗体均 1 1 000，二抗稀释比例（1 5 000）。蛋白条带显色曝光后，使用 Image-J 软件进行灰度值分析。1.3统计学处理统计分析是以 SPSS 23.0软件进行。计量资料以（x s）表示，组间差异比较采用单因素方差分析，P0.05差异具有统计学意义。2 结果 2.1LPS 致 巨 噬 细 胞 RAW264.7 活 性 最 佳 浓 度筛选当 LPS 浓度在 1 g/mL 时细胞活性 OD 值为0.49720.061，且与空白组比较差异具有统计学意义（P0.01、P0.001），更 接 近 半 数 抑 制 率。见表 1。2.2丹皮酚与 TAK242浓度筛选为了检测丹皮酚、TAK242 对于 LPS 刺激下的巨噬细胞 RAW264.7 的最佳浓度筛选，分别检测了不同剂量下的丹皮酚、TAK242 预处理过的 LPS 刺激 下 的 巨 噬 细 胞 RAW264.7 的 TLR4、NF-B、p-NF-B 蛋 白 的 表 达。与 空 白 组 比 较，LPS 组TLR4、p-NF-B 蛋白表达显著升高（P0.01、P0.001）。与 LPS 组比较，丹皮酚在 240 mol/mL、TAK242 在 10 mol/mL TLR4、p-NF-B 蛋白表达降低更显著（P0.05、P0.01）。见图 1、2，表 2。表 1 LPS致巨噬细胞 RAW264.7活性最佳浓度筛选（n=3，x s）Tab 1 Selection of the best concentration of LPSinduced macrophage RAW264.7 activity（n=3，x s）LPS浓度（g/mL）00.250.50124FP吸光度值1.676 70.0020.694 40.057#0.587 30.062#0.497 20.061#0.261 60.015#0.039 00.001#525.1340.027注：与 0组比较，#P0.01、#P0.001。A：空白组；B：LPS 组；C：丹皮酚 480 mol/mL 组；D：丹皮酚 240 mol/mL组；E：丹皮酚 120 mol/mL组图 1丹皮酚不同浓度下 p-NF-B/NF-B相对表达Fig 1Relative expression of pNFB/NFB in paeonol at different concentrationsA：空白组；B：LPS 组；C：TAK242 20 mol/mL 组；D：TAK242 10 mol/mL组；E：TAK242 5 mol/mL组图 2TAK242不同浓度下 TLR4相对表达Fig 2Relative expression of TLR4 at different concentrations of TAK242185海南医学院学报 Vol.29 No.3 Feb.20232.3细胞形态学变化通过 200倍显微镜观察，空白组细胞体积小，形态圆润；LPS 组细胞分化严重，呈不规则形态，有形似伪足出现；丹皮酚组细胞分化明显改善，细胞大部分恢复近圆润形态。见图 3。2.4细胞培养液中 GSH、MDA含量水平与空白组比较，LPS组细胞培养液中 GSH 含量显著降低，MDA 含量升高（P0.01、P0.001）；与LPS组比较，丹皮酚组细胞培养液中 GSH 含量显著增 高，MDA 含 量 降 低（P0.01、P0.001）。见表 3。2.5细胞线粒体膜电变化JC-I为荧光探针，可快速灵敏检测细胞线粒体膜电位，在线粒体膜电位较高时产生红色荧光，线粒体膜电位较低时产生绿色荧光。通过 200倍荧光倒置显微镜观察，与空白组比较，LPS 组细胞红色荧光弱，绿色荧光强（P0.001）；与 LPS 组比较，丹皮酚组红色荧光相对变强，绿色荧光相对减弱（P0.001）。见图 4，表 4。表 2 丹皮酚与 TAK242不同浓度下 pNFB/NFB与 TLR4相对表达（n=3，x s）Tab 2 Relative expressions of pNFB/NFB and TLR4 at different concentrations of paeonol and TAK242（n=3，x s）组别（mol/mL）空白组LPS组丹皮酚（480mol/mL）丹皮酚（240mol/mL）丹皮酚（120mol/mL）FPp-NF-B/NF-B0.630.0841.050.140#0.720.036*0.700.099*0.800.025*10.4580.164组别（mol/mL）空白组LPS组TAK242（20mol/mL）TAK242（10mol/mL）TAK242（5mol/mL）FPTLR40.340.0560.630.106#0.390.072*0.350.080*0.420.138*4.4760.363注：与空白组比较，#P0.01、#P0.001，与 LPS组比较，*P0.05、*P0.01。图 3细胞形态学变化Fig 3Morphological changes of cells表 3 细胞培养液中 GSH、MDA含量水平（n=4，x s）Tab 3 Content levels of GSH and MDA in cell culture medium（n=4，x s）组别空白组LPS组丹皮酚组TAK242组FPGSH(mol/mg)79.416.8956.378.97#75.005.40*74.028.07*7.4390.853MDA(mmol/mg)3.231.059.341.25#4.521.83*3.870.75*18.9350.522注：与空白组比较，#P0.01、#P0.001，与 LPS 组比较，*P0.01、*P0.001。表 4 细胞线粒体膜电变化红绿荧光比值（n=3，x s）Tab 4 Ratio of redgreen fluorescence of electrical changes in mitochondrial membrane of cells（n=3，x s）组别空白组LPS组丹皮酚组TAK242组FP红绿荧光比值1.360.0540.430.124#1.090.190*1.140.208*23.4480.058186刘玉龙等.丹皮酚通过 TLR4/MAPK/NF-B通路对 LPS诱导的巨噬细胞 RAW264.7损伤的保护作用2.6免疫荧光法检测 F4/80 及 p-NF-B 蛋白表达分布通过 200 倍荧光倒置显微镜观察，与空白组比较，LPS 组 F4/80（红色）、p-NF-B（绿色）表达分布增多（P0.001）；与 LPS 组比较，丹皮酚组 F4/80（红色）、p-NF-B（绿色）表达分布降低（P0.01、P0.001）。见图 5，表 5。2.7Western blotting检测 TLR4/MAPK/NF-B通路蛋白表达与空白组比较，LPS 组 TLR4、p-p38、p-JNK、p-IB、p-NF-B 蛋白表达增高（P0.01）；与 LPS 组比 较，丹 皮 酚 组 TLR4、p-p38、p-JNK、p-IB、p-NF-B 蛋白表达降低（P0.05、P0.01）。见图6，表 6。与空白组比较，#P0.001，与 LPS组比较，*P0.001图 4细胞线粒体膜电变化Fig 4Electrical changes of cell mitochondrial membrane表 5 免疫荧光法检测 F4/80及 pNFB蛋白表达 AOD值（n=3，x s）Tab 5 AOD values of F4/80 and pNFB protein expressions detected by immunofluorescence assay（n=3，x s）组别空白组LPS组丹皮酚组TAK242组FPAOD（F4/80）3.670.1495.350.146#3.960.228*4.060.243*43.2840.569AOD（p-NF-B）4.81330.3288.97330.551#6.02670.399*6.21001.319*23.4480.055表 6 Western blotting检测 TLR4/MAPK/NFB通路蛋白相对表达（n=3，x s）Tab 6 Relative expression of TLR4/MAPK/NFB pathway protein detected by Western blotting（n=3，x s）组别空白组LPS组丹皮酚组TAK242组FPTLR40.490.0070.830.123#0.620.087*0.640.110*6.7780.060p-p38/p380.810.1241.340.064#0.850.224*0.940.081*9.4730.281p-JNK/JNK0.470.1441.160.335#0.600.215*0.610.164*5.2890.466p-IB/IB0.670.1371.260.290#0.780.158*0.700.113*6.4950.157p-NF-B/NF-B0.300.0350.530.037#0.360.030*0.350.090*10.8090.068187海南医学院学报 Vol.29 No.3 Feb.20233 讨论 中药具有功效多、多靶点、毒副作用小等优势，中药单体成分清楚，质量可控，往往起关键作用，现在，基于中药单体的新药研发，是开发具有自主知识产权新药的重要途径之一9。多项研究表明，丹皮酚药理学作用丰富，Li 等10研究发现，丹皮酚可通过 NF-B 途径介导肝癌细胞凋亡；Xu 等11研究发现，丹皮酚可改善 LPS 诱导的肝细胞损伤，其机制可能与改善线粒体功能和 NF-B 易核相关；Guo等12研究表明，丹皮酚通过激活 Nrf2信号通路保护黑 素 细 胞 免 受 H2O2诱 导 的 氧 化 应 激 损 伤。RAW264.7 细胞在免疫应答中发挥重要功能，正常情况下，机体中的 RAW264.7 细胞处于相对静止的状态，仅具有一定的趋化能力和非特异性吞噬能力。当炎性介质被 RAW264.7 细胞膜表面受体识别并激活巨噬细胞，炎症开始后，大量的炎症介质被合成并释放到组织和血液中，引起细胞炎症损伤和功能絮乱13。LPS 是革兰阴性菌细胞壁主要成与空白组比较，#P0.001，与 LPS组比较，*P0.01、*P0.001图 5免疫荧光法检测 F4/80及 p-NF-B蛋白表达分布Fig 5Expression distribution of F4/80 and pNFB proteins detected by immunofluorescence assay与空白组比较，#P0.01，与 LPS组比较，*P0.05、*P0.01图 6Western blotting检测 TLR4/MAPK/NF-B通路蛋白表达Fig 6Expression of TLR4/MAPK/NFB pathway protein detected by Western blotting188刘玉龙等.丹皮酚通过 TLR4/MAPK/NF-B通路对 LPS诱导的巨噬细胞 RAW264.7损伤的保护作用分，可 被 巨 噬 细 胞 膜 表 面 受 体 识 别 诱 导 炎 症 反应14。LPS 诱导的 RAW264.7 细胞是体外研究炎症损伤经典细胞模型，Cheng等15研究发现，柑橘提取物对 LPS 诱导的 RAW264.7细胞具有抗炎作用。Han 等3研究发现，西咪替丁可抑制 LPS 诱导的巨噬 细 胞 RAW264.7 炎 症 反 应，降 低 MAPKs 和NF-B 信号通路相关的因子的表达。Zhu 等4研究发现，大黄素可通过 siRNA PPAR 转染以降低细胞中 PPAR 的表达，从而降低细胞内 NF-B 蛋白表达，降低 LPS 诱导的巨噬细胞 RAW264.7炎症损伤。目前，对于丹皮酚干预 LPS 诱导的 RAW264.7细胞炎症损伤国内外鲜有报道，因此，本研究选用RAW264.7 细胞并使用 LPS 刺激建立炎症模型，观察丹皮酚、TAK242干预后细胞形态、线粒体膜电变化、GSH 水平、MDA水平、TLR4/MAPK/NF-B通路蛋白表达，同时采用 TLR4 抑制剂 TAK242 来验证 LPS 刺激效果，并探究丹皮酚抑制炎症的分子作用机制。GSH 是细胞中的项解毒酶，可清除超氧根离子、自由基及脂质过氧化产物，其水平降低提示细胞清除自由基能力下降，机体产生氧化应激损伤；MDA 是脂质过氧化的产物，它水平变化反应了机体氧化应激受损程度；LPS 可诱导细胞炎症损伤和氧化应激损伤，导致线粒体损伤，而线粒体在细胞代谢、自由基的生成、信号传导及控制细胞膜电位中发挥重要作用，线粒体膜电位水平，提示线粒体受损程度16，17。本研究结果表明，丹皮酚可增加细胞培养液中 GSH 水平、降低 MDA 水平，细胞中线粒体膜电位荧光增强，减轻细胞损伤。多项研究表明，LPS 可被巨噬细胞膜表面受体 CD14 分子识别并结合，随之激活 TLR4，通过 TLR4介导的重要的髓样分化因子 88（MyD88）依赖性途径转入核内激活 NF-B18。NF-B 在 细 胞 内 与 其 抑 制 性 蛋 白（IB）相结合不具有转录活性，当受到上级刺激因子时，IB 激酶（IKK）激活 IB，NF-B 与 IB 发生脱离转移至细胞核，与在 DNA 上的 B 反应元件相结合，调节其下游靶基因，转录表达炎症因子，导致肝脏炎症损伤19。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是NF-B 的上游调控因子，p38MAPK、JNK 是 MAPK信号通路的重要组成部分，其在氧化应激、炎症介质等刺激下通过磷酸化而激活，激活后可增加炎症因子的释放，进一步加重细胞炎症损伤、氧化应激20。免 疫 荧 光 结 果 显 示，丹 皮 酚 可 以 抑 制RAW264.7细胞激活、p-NF-B 蛋白表达分布降低；Western blotting 结果显示，丹皮酚可以抑制 TLR4、p-p38、p-JNK、p-IB、p-NF-B 蛋 白 表 达，降 低RAW264.7细胞炎症损伤和氧化应激损伤。综上所述，丹皮酚干预可改善 LPS 诱导的巨噬细胞 RAW264.7 炎症和氧化应激损伤，其机制与TLR4/MAPK/NF-B 通路蛋白表达下调相关。本研究有助于更好的理解丹皮酚保护炎症与氧化应激损伤，为丹皮酚进一步开发、应用提供了实验依据。作者贡献度说明：刘玉龙、颜贵明：全程参与、指导实验操作并撰写论文；孙敏，刘玉龙，刘科：参与数据分析、荧光拍照、Western blot-ting实验等；颜贵明：所有实验试剂资金支持。所有作者声明不存在利益冲突关系。参考文献1Kang E，Park JE，Seo Y，et 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