丹参酮ⅡA对人卵巢癌A27...细胞增殖、迁移和自噬的影响_李婉玉.pdf

丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞增殖、迁移和自噬的影响李婉玉1，冯晨2，任春慧2，毛艺纯1，张增雷2，冯华1(牡丹江医学院 1病理生理学教研室;2附属红旗医院，黑龙江牡丹江157011)摘要:目的探讨丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞增殖、迁移和自噬的影响。方法用不同浓度丹参酮A 作用于卵巢癌 A2780 细胞 24 h，CCK8 法测定不同浓度丹参酮A 对 A2780 细胞增殖的影响，计算其 IC50值;依据 IC50值将卵巢癌A2780 细胞分为 4 个组:0 mg/L 组(即对照组)、03 mg/L 组、06 mg/L 组、12 mg/L 组;应用划痕实验检测丹参酮A 对 A2780细胞迁移能力影响;Western Blot 实验检测丹参酮A 对 A2780 细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl2)和自噬相关蛋白(Beclin1、LC3、LC3)表达的影响。结果CCK8 实验结果显示，丹参酮A 能够抑制卵巢癌 A2780 细胞的增殖，且抑制作用呈现浓度依懒性，其 IC50值为(297009)mg/L;划痕结果显示，与对照组相比，丹参酮A 能够抑制卵巢癌 A2780 细胞的迁移能力，呈剂量依赖性关系;Western Blot 结果显示，丹参酮A 可抑制 Bcl2 蛋白表达，增强 Bax 蛋白表达，且 Bax/Bcl2 比值增高，自噬相关蛋白 Beclin1 表达增加，LC3/LC3 比值增高。结论丹参酮A 可抑制人卵巢癌 A2780 细胞的增殖、迁移及促进细胞凋亡和自噬的发生。关键词:卵巢癌;丹参酮A;自噬;凋亡;迁移中图分类号:285;73731文献标识码:A文章编号:10017550(2023)01000605基金项目:牡丹江市应用技术研究与开发计划项目(HT2020JG055);黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目(2019kyywfmy0033;2019kyywfmy0036)作者简介:李婉玉(1996)，女，硕士研究生，研究方向:肿瘤侵袭转移及耐药机制研究。通讯作者:冯华，副教授，研究方向:肿瘤侵袭转移及耐药机制研究。Effects of Tanshinone IIA on proliferation，migration and autophagy of human ovarian cancer A2780 cellsLI Wanyu et al(Department of pathophysiology，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China)Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Tanshinone IIA on the proliferation，migration and autophagy of human ovar-ian cancer A2780 cellsMethodsOvarian cancer A2780 cells were treated with different concentrations of Tanshinone IIA for 24 hThe effect of different concentrations of Tanshinone IIA on the proliferation of A2780 cells was determined by the CCK8 method，andthe IC50values were calculatedOvarian cancer A2780 cells were divided into four groups according to the IC50values:0 mg/L group(iecontrol group)，03 mg/L group，06 mg/L group and 12 mg/L groupThe effect of Tanshinone IIA on the migration ability ofA2780 cells was examined by scratch assayThe effect of Tanshinone IIA on the expression of apoptosisrelated proteins(Bax and Bcl2)and autophagyrelated proteins(Beclin1，LC3 and LC3)was examined by Western BlottingesultsThe results of CCK8 assay showed that Tanshinone IIA inhibitted the proliferation of ovarian cancer A2780 cells，and the inhibitory effect showed con-centrationdependent laziness with an IC50value of(297009)mg/LThe scratch results showed that Tanshinone IIA inhibitted themigration ability of ovarian cancer A2780 cells compared with the control group in a dosedependent relationshipWestern Blot resultsshowed that Tanshinone IIA inhibitted the expression of Bcl2 protein，enhanced the expression of Bax protein，and increased the ratioof Bax/Bcl2，increased the expression of autophagyrelated protein Beclin1，and increased the ratio of LC3/LC3 ConclusionTanshinone IIA could inhibit the proliferation and migration of human ovarian cancer A2780 cells and promoted the development ofapoptosis and autophagyKey words:Ovarian cancer A2780 cells;Tanshinone IIA;Autophagy;Apoptosis;Migration卵巢癌发病率居于女性生殖系统恶性肿瘤第二位1，也是妇科恶性肿瘤的主要死因之一。现阶段对于卵巢癌的早期诊断还未取得有效方法，70%80%的卵巢癌患者在确诊时已为晚期2。根据卵巢癌患者确诊时所处的临床分期，选用不同方式给予对症治疗。目前卵巢癌的治疗以手术切除为主，术后辅以化疗、放疗和靶向基因治疗等手段，但是现阶段常规化疗药物毒性大，易产生耐药性，导致患者生活质量下降，短期内可能出现复发3。中药因其对患者副作用小、不产生依赖、经济廉62023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023DOI:10.13799/ki.mdjyxyxb.2023.01.010价等优势，在卵巢癌治疗上有着较大的优势4。丹参酮A 是从中药丹参中提取的有效成分5，目前在临床上被广泛用于治疗心血管疾病6，现有研究证明丹参酮A 对肿瘤细胞具有明显的抑制作用，但关于丹参酮A 对卵巢癌细胞自噬及凋亡作用的研究相对较少。为了进一步研究丹参酮A 抗癌作用，本研究选用丹参酮A 作用于人卵巢癌细胞株A2780，探讨其是否对卵巢癌 A2780 细胞增殖、迁移、凋亡及自噬产生影响，为其治疗卵巢癌的临床应用提供参考。1材料和方法11材料丹参酮A(美国 Sigma 公司);人卵巢癌 A2780 细胞株(普诺赛生命科技有限公司);CCK8(大连美仑生物技术有限公司);胎牛血清(FBS，维森特生物技术有限公司);Bcl2 一抗、Bax 一抗、Beclin1 一抗、抗微管相关蛋白 1 轻链 3(LC3)一抗(均为万类生物科技有限公司)。12细胞培养待 A2780 细胞复苏后，接种于含有10%FBS、1%双抗(青链霉素)的 1640 培养基中，置于细胞培养箱(37、5%CO2)培养。细胞处于对数生长期进行后续实验。13CCK8 法检测 A2780 细胞活力取对数生长期的 A2780 细胞，调整密度为 1105个细胞/mL，接种于 96 孔板。置于培养箱中培养。设置空白组、对照组、实验设置丹参酮A 不同浓度(04 mg/L、06mg/L、08 mg/L、12 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、32mg/L)，每组 6 个复孔。培养 24 h，每孔加入 10 LCCK8 溶液，继续孵育 2 h，在酶标仪波长 450 nm处检测各孔的光密度(OD)值。细胞活力(%)=(实验组 OD空白组 OD)/(对照组 OD空白组 OD)100%。计算丹参酮A 对 A2780 细胞的半数抑制浓度(IC50)。根据 IC50选取低(03 mg/L)、中(06mg/L)、高(12 mg/L)浓度丹参酮A 用于后续试验。14平板克隆形成实验检测细胞增殖能力取A2780 细胞，调整密度为 1103个细胞/mL，接种于6 孔板，加入 2 mL 完全培养基。轻轻转动 6 孔板，将细胞分散均匀，置于培养箱中进行培养。设置对照组、03 mg/L、06 mg/L 和 12 mg/L 丹参酮A药物组，每 3 d 换液;15 d 后每孔加入 2 mL 4%的多聚甲醛固定 15 min，并用结晶紫染色 15 min，统计克隆形成数并计算克隆形成率。克隆形成率=克隆数/接种细胞数100%。15细胞划痕实验检测细胞迁移能力取对数生长期的 A2780 细胞，按 3105/孔接种到 6 孔板中，待细胞密度达 80%90%时进行实验。在 6 孔板底画一条横线，用 200 L 无菌枪头在孔内垂直横线划痕，PBS 缓冲液清洗去除悬浮细胞，0 h 取样拍照，加入不同浓度丹参酮A 溶液(0 mg/L、03 mg/L、06mg/L、12 mg/L)，于倒置显微镜下 48 h、72 h 取样拍照，记录细胞迁移情况，计算其相对迁移率。16Western blot 检测蛋白表达细胞培养，加入不同浓度丹参酮A 溶液(0 mg/L、03 mg/L、06mg/L、12 mg/L)作用 24 h 后，收集 A2780 细胞并用PBS 洗涤 3 次，以 IPA 细胞裂解液在冰上进行裂解 30 min，进行蛋白提取，BCA 法进行蛋白定量，经SDSPAGE 电泳后转移至 PVDF 膜上，在室温下封闭液封闭 2 h，TBST 洗膜，一抗(Bax、Bcl2、Beclin1、LC3)4 孵育过夜。TBST 洗膜 3 次，每次 10min，加入二抗，室温孵育 1 h，TBST 洗膜。显影液 A液和 B 液按 1 1 配置。暗室用 ECL 化学发光法显影，Image J 软件分析灰度值。17统计学分析采用 GraphPad Prism 80 软件和SPSS 250 统计软件，数值变量资料以“均数标准差”表示。采用单因素方差分析(OneWay ANO-VA)，P005 为有统计学意义。2结果21丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞活力的影响CCK8 实验结果表明，04 mg/L、06 mg/L、08mg/L、12 mg/L、16 mg/L、18 mg/L、32 mg/L、32mg/L 的丹参酮A 处理人卵巢癌 A2780 细胞 24 h后，与对照组相比，丹参酮A 各剂量组均可抑制A2780 细胞的增殖，呈现浓度依赖性，通过计算，丹参酮A 对 A2780 细胞的 IC50值为(297009)mg/L(图 1)。图 1丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞体外增殖的影响22丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞增殖能力的影响通过 Image J 进行计数对照组与03 mg/L、06 mg/L 和 12 mg/L 浓度丹参酮A 药物组细胞72023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023形成的克隆数，发现与对照组相比，随着药物浓度的增加，细胞的克隆形成数降低，差异具有统计学意义(P001)。说明丹参酮A 具有显著抑制 A2780细胞增殖的作用(图 2)。图 2丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞增殖能力的影响注:与对照组比较，P00123丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞迁移能力的影响结果所示，划痕 48 h 及 72 h 后，与对照组相比，丹参酮A 组细胞迁移率随着药物浓度的增加逐渐降低，其抑制作用呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(P001 或 P0001)。说明丹参酮A可显著抑制 A2780 细胞迁移的作用(图 3)。图 3丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞迁移能力影响注:与对照组相比，P001，P000124丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞凋亡相关蛋白的影响为进一步研究丹参酮A 诱导 A2780细胞凋亡的具体作用机制，用 Western Blot 法测定Bax 和 Bcl2 蛋白的表达。随着丹参酮A 药物浓度的逐渐增加，A2780 细胞 Bax 蛋白表达水平逐渐升高，Bcl2 蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P005，图 4)图 4Western Blot 检测各组细胞 Bcl2、Bax 蛋白情况注:与对照组相比，*P00525丹参酮A 对人卵巢癌 A2780 细胞自噬相关蛋白的影响不同浓度丹参酮A 对卵巢癌 A2780细胞自噬相关蛋白 Beclin1、LC3 和 LC3 表达的影响。采用 Western Blot 分析了丹参酮A 对细胞自噬水平的影响，随着药物浓度的逐渐增加，自噬相关蛋白 Beclin1 表达水平逐渐增加，LC3 I 转变为 LC3 II 逐渐增加，LC3/LC3值升高，差异有统计学意义(P001，见图 5)。图5Western Blot 检测各组细胞 Beclin1、LC3 蛋白表达情况注:与对照组相比，P0053讨论卵巢癌具有早期症状不典型、诊断率较低等特点，当患者被确诊时已为中晚期，错过了根治性切除的最佳时机，此时只能选择放、化疗手段去杀伤癌细82023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023胞、延缓肿瘤的继续发展，但由于五年生存率低，使其预后不理想。近年来中药凭借多通路、多靶点等特点成为治疗恶性肿瘤的选择。丹参酮A 是唇形科鼠尾革属植物丹参的提取物之一，具有多重生物学作用，已有体外实验研究证实，丹参酮A 可显著降低肝癌细胞7、宫颈癌细胞8、胃癌细胞9、结肠癌细胞10 及乳腺癌细胞11 的增殖活力。然而其抗卵巢癌中的研究较少且机制不清楚。本研究以卵巢癌 A2780 细胞为研究对象，探讨丹参酮A 对其的作用以及可能的机制。已有研究证实丹参酮 IIA 能够抑制乳腺癌细胞 MDAMB435 迁移及肿瘤血管生成12，闫燕艳等研究显示丹参酮 IIA 可以抑制肺癌细胞 A549 的体外增殖、迁移和侵袭能力13。本研究通过 CCK8 法和平板克隆实验结果显示丹参酮A 可明显抑制 A2780 细胞增殖，划痕实验结果显示丹参酮A 可以抑制卵巢癌 A2780 的迁移能力。表明丹参酮 IIA 在体外可抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移。自噬与凋亡密切相关，是细胞程序性死亡的另一种方式。两者之间相互作用影响细胞的稳态，死亡细胞的清除等。在肿瘤的发展过程中起着重要作用。自噬是将细胞质蛋白质、复合体或细胞器吞噬到自噬小体中。自噬小体与溶酶体结合后将细胞内聚集的蛋白质和受损的细胞器吞噬并降解，产生的降解产物，包括核苷酸、氨基酸、脂肪酸和糖，然后可以运回并循环进入一般细胞新陈代谢1416。Beclin1 介导自噬蛋白定位在自噬泡上，进而调自噬体的形成，其是自噬体形成过程的必要分子。LC3 参与自噬体形成，是高等真核生物唯一已知与自噬体和溶酶体特异性结合蛋白，LC3 表达与自噬体数量相关。当 LC3 I 向 LC3 转化或 LC3 表达增加代表自噬流活化;反之表明自噬抑制。细胞凋亡是由细胞内和/或细胞外信号调节的，其特征是目标死亡细胞的形态变化，包括核碎裂和凝聚、线粒体外膜通透性(MOMP)、膜起泡、细胞收缩和凋亡体形成17。卵巢癌发生与凋亡调控异常相关，通过促进抗凋亡基因表达、抑制促凋亡基因表达，进而阻碍卵巢癌的凋亡，其中内源性凋亡因子 Bax 和 Bcl2 起到了主要调控作用。已有研究证实，Bcl2 与 Beclin1 结合可抑制细胞自噬，两者解离则会促进细胞自噬、抑制细胞凋亡，因此 Bcl2/Beclin1 复合体在细胞自噬与凋亡起到了重要作用18。朱琳琳研究发现蓝萼甲素可通过 Bcl2/Beclin1 靶点调节人肝癌 HCCLM3 细胞自噬与凋亡19。潘鹏宇研究证明，康艾注射液能有效改善 A549/DDP 细胞顺铂耐药性，其机制可能为上调自噬凋亡互作蛋白 Beclin1 蛋白表达水平，调控 Beclin1 介导下的细胞自噬与凋亡互作，从而导致 A549/DDP 细胞自噬性死亡与凋亡20。有研究证实在大肠癌中，自噬活性的上调与凋亡能力的下调并存;自噬相关基因 LC3、Beclin1 与凋亡相关基因 p53、Bcl2 在大肠癌的发生、发展中起协调作用21。本研究 Western Blot 结果表明，丹参酮A作用于 A2780 细胞后减少了抗凋亡蛋白 Bcl2 的表达且增加了促凋亡蛋白 Bax 的表达，且具有一定的剂量依赖性。同时随着丹参酮A 药物浓度的增多，可使 LC3 II/LC3 I 比值显著升高，说明 LC3 向LC3 转化增多，同时 Beclin1 的表达升高。上述结果提示，丹参酮A 可能具有诱导 A2780 细胞自噬及促进凋亡作用。综上所述，丹参酮A 具有促进卵巢癌细胞自噬及凋亡作用，其中 Bcl2 抗凋亡蛋白为其作用的重要靶点，从而起到抑制 A2780 细胞增殖的作用。本研究证实了丹参酮A 可以通过调控人卵巢癌细胞自噬与凋亡，挖掘了中医药治疗卵巢癌的新作用机制，有可能成为临床治疗卵巢癌新的手段，减少卵巢癌患者复发程度，提高患者预后生存率。参考文献 1 SIEGEL L，MILLE K D，JEMAL ACancer statistics，2018J CA:A Cancer Journal for Clinicians，2018，68(1):730 2 WEBB P M，JODAN S JEpidemiology of epithelial ovarian cancer J Best Practice esearch Clinical Obstetrics Gynaecology，2017(41):314 3 ZHOU J，JIANG Y Y，CHEN H，et alTanshinone I attenuates themalignant biological properties of ovarian cancer by inducing apopto-sis and autophagy via the inactivation of PI3K/AKT/mTO pathway J Cell Prolif，2020，53(2):12739 4 张星星，刘琦中医药治疗卵巢癌新进展J 医学理论与实践，2022，35(6):942944 5 郑庆虎，刘萍，陈祯祥，等丹参酮类成分的生物活性研究进展 J 皮肤病与性病，2021，43(2):184187 6 曹慧敏，吴瑾，贾连群，等丹参酮A 对心血管系统药理作用的研究进展 J世界中医药，2017，12(7):17181722 7 赵珍，李明花丹参酮A 对人肝癌细胞 Huh7 增殖与凋亡的影响 J 中医肿瘤学杂志，2020，2(2):3338 8 关崇丽，郑婧，王惠玲丹参酮A 对人宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响J 西部中医药，2020，33(1):3740 9 张拥军，彭伯坚，曹天生，等丹参酮A 通过抑制 STAT3 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临床与实验病理学杂志，2012，28(3):282286(收稿日期:20220706本文编辑:郭丽双)052023 年 02 月牡丹江医学院学报Feb.2023第 44 卷第 1 期JournalofMuDanJiangMedicalUniversityVol.44No.12023