产气荚膜梭菌的主要毒素及其...炎致病机理中的作用研究进展_雷蕾.pdf

18|2023 年第 43 卷第1期 总第300期|禽 业 篇产气荚膜梭菌的主要毒素及其在肉鸡坏死产气荚膜梭菌的主要毒素及其在肉鸡坏死性肠炎致病机理中的作用研究进展性肠炎致病机理中的作用研究进展雷 蕾雷 蕾1 1，帅 柯，帅 柯1 1，杨汉博，杨汉博1 1，肖 昌，肖 昌2*2*(1.四川思来生物科技有限公司，四川 成都 610095；2.西南大学生物技术学院，重庆 400716)(1.四川思来生物科技有限公司，四川 成都 610095；2.西南大学生物技术学院，重庆 400716)肉鸡坏死性肠炎(necrotic enteritis，NE)是 一 种 常 见 的 由 产 气 荚 膜 梭 菌(Clostridium perfringens)引发的一种严重的肠道疾病1。产气荚膜梭菌是肉鸡肠道菌群中的一员，是一种条件性致病菌，也可导致人和动物发病，是一种食源性致病菌。随着全球肉鸡饲养量大幅增长，产气荚膜梭菌诱发的坏死性肠炎已成为持续性挑战，造成了巨大的经济损失。与此同时多国禁止使用抗生素生长促进剂，该病的发病率再次升高，导致肉鸡的体重或增重降低，影响肉鸡的生产力和肉品质。因此，有必要深入了解产气荚膜梭菌及其所产毒素对肉鸡坏死性肠炎的致病机理，从而为该病的防控打下基础。1 产气荚膜梭菌的生物学特性产气荚膜梭菌是一种革兰阳性菌，呈棒状，无运动性，可形成孢子。其大小随生长环境而变化，例如，在淀粉培养基中，菌体较大，而在葡萄糖培养基中则较小。产气荚膜梭菌对寒冷有较强抵抗力，其芽孢耐热2。产气荚膜梭菌可水解明胶，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐；在含硫培养基中，由于硫元素被还原，会产生黑色菌落。其特征性鉴定试验为乳糖发酵试验，即剧烈乳糖发酵，因为其在牛乳中可产生大量气体。该菌能产生大量超氧化物歧化酶，因此可在微氧条件下生长3-4。产气荚膜梭菌能形成芽孢，可以在各种环境中生存，常见于废水、尘埃、空气以及健康的人和动物的肠道5。该菌是肉鸡肠道正常菌群的一员，与其他肠道微生物呈竞争性生长关系，属于条件性致病菌6。产气荚膜梭菌也是常见的食源性致病菌之一，可导致人发生胃肠炎等疾病7。2 产气荚膜梭菌的毒素类型及其所致疾病产气荚膜梭菌释放的毒素在肉鸡坏死性肠炎致病机理中起着重要作用。迄今为止，已经鉴定出 20 多种不同类型的产气荚膜梭菌毒素8。根 据 是 否 存 在 产 气 荚 膜 梭 菌 alpha()、beta()、epsilon()、iota()毒素 以 及 最 近 增 加 的 产 气 荚 膜 梭 菌 肠 毒 素(Clostridium perfringens enterotoxin，中图分类号：S831.4 文献标志码：A 文章编号：1001-0769(2023)01-0018-08摘 要：肉鸡坏死性肠炎(necrotic enteritis，NE)是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)引发的一种严重的肠道疾病，给肉鸡业造成了巨大的经济损失。为深入了解肉鸡坏死性肠炎的致病因子和致病机理，本文对产气荚膜梭菌的主要毒素及其在肉鸡坏死性肠炎致病机理中的作用进行了概述，为该病的临床诊断、监测和防控提供参考。关键词：肉鸡；产气荚膜梭菌；毒素；坏死性肠炎；致病机理作者简介：雷蕾(1985 )，女，硕士，主要从事微生物研究；E-mail：slan_*通信作者：肖昌(1970 )，男，副教授，主要从事病原生物研究；E-mail：文献综述|2023年第43卷第1期 总第300 期|19 禽 业 篇文献综述CPE)、2-毒 素 和 坏 死 性 肠 炎 B-样 毒 素(necrotic enteritis B-like toxin，NetB)编码基因，禽类产气荚膜梭菌可分为 7 种类型(表 1)9-10，与肉鸡密切相关的产气荚膜梭菌类型为 A、C 和 G 型。每种毒素类型与人和动物疾病的关系见表 2。2.1-毒素在所有毒素类型中，-毒素是唯一所有类型产气荚膜梭菌都能产生的毒素。产气荚膜梭菌毒素基因见于染色体和质粒。早期研究发现，-毒素具有酶活性，可以催化在其作用位点发生的反应12。-毒素是一种磷脂酶 C 和神经鞘磷脂酶，可水解细胞膜的磷脂，从而导致细胞死亡。因20|2023 年第 43 卷第1期 总第300期|禽 业 篇文献综述此，-毒素具有细胞毒性、溶血活性、皮肤坏死性和致死性等特性13。-毒素是导致气性坏疽的主要原因，但其对坏死性肠炎的作用尚有争议14。-毒素在 A 型产气荚膜梭菌的致病机理中起重要作用。研究发现，患病鸡体内的-毒素水平高于健康鸡的15。接种 A 型产气荚膜梭菌的肉汤培养上清液或纯化的-毒素接种无特定病原鸡，成功诱导了鸡死亡和肠道病变，而用-毒素抗血清和-毒素后并未导致鸡死亡16。尽管 A 型产气荚膜梭菌通常见于环境和健康肠道，但侵袭性菌株可产生多得多的-毒素。Rehman 等17在体外研究中发现，-毒素可影响肠黏膜的屏障功能。但这些研究使用的是粗制的或部分纯化的毒素，因此，毒素中可能存在其他的蛋白共同发挥作用18。Cooper 和 Songer19研究发现，尽管使用重组-毒素进行免疫可部分保护产气荚膜梭菌诱发的坏死性肠炎，但坏死性肠炎病变的产生与体外-毒素的产量并无关联。但是，使用从发病鸡和健康鸡上分离的产气荚膜梭菌进行的另一项研究发现，-毒素产量并无差异。2006 年以前，研究人员认为坏死性肠炎主要的毒力因子是-毒素，但其后的研究表明，不携带-毒素基因的突变株也能导致肉鸡发生坏死性肠炎18。因此，尚不能确定-毒素是否是坏死性肠炎的主要毒力因子。-毒素可与细胞膜上的一种神经节苷脂 糖-氨 丙 基(ganglioside sugar-aminopropy，GM1a)结合，诱导二酰基甘油在细胞中蓄积，导致酪氨酸激酶 A 被激活，从而诱导释放白介素-820。-毒素可促进胆固醇生成，其可与另一种毒素 产气荚膜梭菌溶素 O(perfringolysin O，PFO，也称为-毒素)结合21。PFO 属于胆固醇依赖性细胞溶素家族。该毒素家族的成员具有 40 80的结构同源性和相似的生物特性22。产气荚膜梭菌产生的这些亚基可在具有胆固醇来源的细胞表面上聚合，然后插入跨膜区，从而产生一个穿孔23，允许细胞膜内外的粒子和大分子穿越24。在利用气肿疽的实验动物模型进行的研究发现，A 型产气荚膜梭菌分泌的 PFO 可损伤宿主组织以及该部位的炎性细胞。该毒素通过传播可扩散进入全身血液循环，使多形核白细胞上的黏附分子发生改变。研究人员认为这会导致白细胞的细胞周期停滞和局部组织缺氧25。2.2 坏死性肠炎 B-样毒素坏死性肠炎 B-样毒素(necrotic enteritis B-like toxin，NetB)是-穿孔毒素中的-溶血素家族成员，分离自发生坏死性肠炎的鸡体内的 A 型产气荚膜梭菌菌株。之所以取名为NetB，是因为其与产气荚膜梭菌-毒素具有相似性。研究发现，某些 A 和 G 型产气荚膜梭菌分离株产生的穿孔毒素 NetB(而非-毒素)是坏死性肠炎致病机理中一种非诱发性毒力因子26。研究发现，野生型菌株与分离自发生坏死性肠炎的肉鸡的-毒素阴性突变株均可诱发相似的坏死性肠炎27。使用鸡肝癌细胞(leghorn male hepatocellular cells，LMH)开展的体外试验也显示，NetB 毒素可导致细胞变圆和裂解。这些结果对以往的一种观点提出了挑战，即-毒素是坏死性肠炎致病机理中的唯一毒力因子。但是，在发生坏死性肠炎的鸡体内也检出了 NetB 阴性细菌28，同时，在另一个实验性坏死性肠炎模型中，NetB阴性产气荚膜梭菌未能诱发坏死性肠炎29。感染不携带-毒素基因突变株的肉鸡在攻毒后发生坏死性肠炎，这表明，-毒素并|2023年第43卷第1期 总第300 期|21 禽 业 篇文献综述不是导致肉鸡发病的唯一致病因素18。NetB毒素的发现开启了肉鸡坏死性肠炎研究的新征程。研究人员已在几个田间病例中鉴定出该毒素30-32。NetB 毒素与其他穿孔毒素的序列相似性不高，如产气荚膜梭菌的-毒素和-毒素(序列相似性分别为 38和 40)，金黄色葡萄球菌的 和-溶血素33。NetB毒素的个亚基在细胞膜上聚合，形成一个穿孔，这与-溶血素的装配和作用相似34。存在胆固醇时，NetB 毒素的毒力增强，不过，该毒素与细胞结合的受体尚不明确22。在不同的国家，健康和患病家禽体内含NetB 毒素的分离株比例不同。研究发现，在澳大利亚，分离自患病鸡的 70的产气荚膜梭菌有NetB基因，所有这些分离株在体外均能产生 NetB 毒素35。在美国，分离自患病鸡的 58产气荚膜梭菌和分离自健康鸡的 9菌株含有NetB基因31。在丹麦开展的一项研究显示，分离自健康鸡的 61的产气荚膜梭菌含有NetB基因；而患病鸡中只有 52的分离株含有该基因30。存在NetB基因并不能说明该细菌会产生NetB 毒素，因为不是所有的NetB基因阳性分离株都会在体外产生该毒素。但是，来自患病鸡的分离株产生该毒素的可能性高于来自健康鸡的分离株36。产气荚膜梭菌中许多独立基因的激活以及毒力因子的释放均受控于一个双组份信号转导系统。该系统包含一个传感器分子 VirS 以及一个效应器分子 VirR。VirS 是一种跨膜蛋白，其胞外域可感受细胞的外部环境，并促进胞内结构域的自体磷酸化，导致细胞质中的 VirR发生磷酸化反应。NetB 毒素受 VirSR(VirS/VirR)系统调控，在接种细菌对数生长后期(培养 4 h 后)产生27。VirSR 的编码基因最初是在 PFO、-毒素和唾液酸酶释放的调控中被发现，其还可以调控几种参与大分子降解(从而为细菌提供营养物质)的基因。通过该系统进行调控的其他基因似乎也参与了营养物质的摄入和代谢37。目前尚不清楚是什么因子激活了 VirS 来促进毒力因子的释放。如果可以抑制毒素释放，就可以预防发生坏死性病变。研究发现，产气荚膜梭菌含有 3 个抗原基因座，这些基因座可能在坏死性肠炎致病机制中起作用。基因座 NELoc1 位于质粒上，长度42 kb。另外两个基因座 NELoc2 和 NELoc3 较短，分别为 11.2 kb 和 5.6 kb，NELoc3 也位于质粒上，NELoc2 位于染色体上38。2.3 产气荚膜梭菌产生的其他毒素研究发现，-毒素与动物的出血性黏膜溃疡形成有关13，具有细胞裂解性、皮肤坏死性等特性。但是，尚不清楚其作用模式。2-毒素基因位于质粒上13，首次发现C 型产气荚膜梭菌，该菌分离于患有坏死性小肠结肠炎的仔猪体内39。目前已从健康和患病的家禽体内分离到了 2-毒素40。但是，2-毒素在动物肠道疾病中的作用尚有争议。2007 年，在荷兰开展的一项研究表明，携带非典型cpb2基因的产气荚膜梭菌与蛋鸡的亚急性坏死性肠炎有关41。某些产气荚膜梭菌分离株中的肠毒素与人的胃肠道疾病相关。肠毒素基因etx位于质粒上，其编码的-毒素以无活性形式分泌，然后通过蛋白酶水解作用转化为毒性形式13。肠毒素是一种穿孔毒素，可与细胞紧密连接的组分闭合蛋白(claudin)结合，在细胞表面形成一个前孔，然后插入细胞42。这些穿孔的形成可使钙离子进入细胞。在低浓度时，该过程可诱导细胞凋亡；在高浓度时，该过程可导致肿瘤病变，细胞体积变大，并能诱发炎性细胞死亡43。这种毒素会导致皮肤坏死，导致犬、22|2023 年第 43 卷第1期 总第300期|禽 业 篇文献综述马和人出现腹泻相关疾病44。肠毒素在产气荚膜梭菌的孢子形成过程中产生，并在蛋白酶消化后被活化，该过程会去除 24 个 N 末端氨基酸44，其特性包括细胞毒性、红斑性和致死性13。-毒素分离自绵羊、山羊和小鼠的 D 型产气荚膜梭菌分离株45，但也见于 B 型产气荚膜梭菌分离株，是产气荚膜梭菌所产生的重要毒力因子之一46。-毒素属二元毒素家族成员，由两个独立的多肽(Ia 和 Ib)构成，这两个多肽协同作用可破坏肌动蛋白细胞骨架，导致细胞死亡44。这些蛋白质以前体分子的形式分泌，需要对 N末端区域进行蛋白水解来激活。Ib 可与宿主细胞脂蛋白相互作用，一旦结合，Ia 可与 Ib发生相互作用，促进-毒素的内吞，从而破坏宿主细胞的细胞骨架47。产气荚膜梭菌产生的其他毒素可能有助于坏死性肠炎的发病过程，如 Perfrin、TpeL和-毒素26。Perfrin 是最近发现的一种细菌素，可能是坏死性肠炎的一种毒力因子。细菌素具有抗菌作用48，Perfrin 对其他产气荚膜梭菌分离株具有抗菌活性，抑制其他分离株的生长，从而促进具有该毒素的侵袭性分离株的生长49。TpeL 毒素(最初发现于 C 型产气荚膜梭菌中)见于 A 型产气荚膜梭菌，研究发现其可以增加坏死性肠炎的严重程度。该毒素至少有A、B、C 和 D 四个活性结构域，其中 B 结构域可与细胞结合。该毒素被细胞内吞后，D 结构域可插入内吞小体膜中。细胞质组分可以激活C结构域，导致毒素被裂解，并释放出A结构域。A 结构域可激活细胞质中的 GTP 酶。TpeL 可修饰 Rac1 和 Ras，以介导其细胞毒性作用29。这些小的 GTP 酶分子可在肌动蛋白细胞骨架重排和细胞增殖中起作用50。A 型产气荚膜梭菌也可能含有-毒素。-毒素是一种透明质酸酶，可降解胞外基质中的透明质酸。研究人员认为其可提高产气荚膜梭菌的毒力，其作用机制是通过提高细胞通透性增强其他毒素的生物学效应51。3 结论与展望产气荚膜梭菌可产生多种毒素，每种毒素类型均与特定的人或动物疾病相关，这提示产气荚膜梭菌毒力与毒素的产生相关52。深入了解每种毒素的结构和功能，对研究肉鸡坏死性肠炎的致病机理至关重要，不仅可以深刻认识肉鸡坏死性肠炎病理变化的发生、发展和转归，还可以为坏死性肠炎的临床诊断或监测工具开发提供理论依据。当前，已经基于这些研究结果建立了基因检测方法53-55和 ELISA 检测方法56-58，此外，找到引发坏死性肠炎的关键致病毒素，将有利于开发有效的亚单位疫苗59-60或抗体61-62，这对无抗生素时代肉鸡坏死性肠炎的防控意义重大。参考文献1 PARISH W ENecrotic enteritis in the 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