保健灸益寿延年研究中衰老动物模型的筛选_谢颖.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 784 研究报告通信作者：韩丽，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学中医学院养生所，邮编：100029，电话：[phone]E-mail：jc_保健灸益寿延年研究中衰老动物模型的筛选谢颖，杨玉媚，和蕊，杨景淇，张高钰，王中钰，方婷钰，王一帆，廖熠蕾，韩丽，赵百孝（北京中医药大学，北京 100029）摘要：当前，衰老相关研究成为人们关注的热点。中医理论和临床认为保健灸能够益寿延年，然其机制尚不清晰。因此选择合适的实验动物，构建合适的衰老动物模型，是研究保健灸益寿延年机制的重要手段。文章结合动物模型衰老表型的相似度、寿命、时间的可操作性等对衰老相关研究中常用的动物模型进行整理归纳。目前广泛应用的衰老模型，涉及酿酒酵母、无脊椎动物、脊椎动物门鱼纲等非哺乳纲动物，以及非人类灵长类、啮齿动物等哺乳纲动物。此外，一些其他特殊动物如蝙蝠、食肉目犬和猫、中国树鼩等也相继成为衰老研究模型。文章从这些衰老动物模型中筛选较为适宜保健灸益寿延年研究中的动物模型，以指导中医灸疗的发展，同时为其他衰老研究中相关动物模型的选择提供依据。关键词：衰老；动物模型；保健灸；灸法；寿命基金资助：国家自然科学基金面上项目（No.82174475）Screening of senile animal models in the study of health-care moxibustion for life extensionXIE Ying,YANG Yu-mei,HE Rui,YANG Jing-qi,ZHANG Gao-yu,WANG Zhong-yu,FANG Ting-yu,WANG Yi-fan,LIAO Yi-lei,HAN Li,ZHAO Bai-xiao(Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)Abstract:Currently,aging related research,has become the focus of peoples attention.Traditional Chinese medicine theory and clinical practice believe that health-care moxibustion can prolong life,but its mechanism is still unclear.Therefore,selecting suitable experimental animals and constructing suitable aging animal models are important means to study the mechanism of health-care moxibustion for longevity.In this paper,the animal models commonly used in aging-related research are sorted and summarized based on the similarity of the aging phenotype,lifespan,and time operability of animal models.At present,the widely used aging models involve non-mammals such as Saccharomyces cerevisiae,invertebrates,vertebrate phylum Fishes,and mammals such as non-human primates,rodents.In addition,some other special animals such as bats,carnivorous dogs and cats,Chinese tree shrews have also become aging research model.We selecte the animal models that are more suitable for the study of health-care moxibustion prolong life from these aging animal models to guide the development of TCM moxibustion,while providing a basis for the selection of relevant animal models in other aging studies.Key words:Aging;Animal model;Health-care moxibustion;Moxibustion;LifespanFunding:General Program of National Natural Science Foundation of China(No.82174475)衰老是生物体在外界环境和内在因素的共同作用下，随着年龄增长出现的体内部分细胞、组织、器官等功能减退甚至逐渐丧失的现象1。近年来，我国人口老龄化已达到较为严重的程度，老龄化导致一系列如心血管疾病、糖尿病、肿瘤、神经退行性疾病的发病率和病死率升高，带动庞大的医疗费用支出。抗衰老研究成为当前老年医学临床研究关注的热点2。自1997年有研究3报道饮食能量限制（caloric or dietary restriction，DR）延缓衰老以来，DR被认为是减少发病率、延长寿命的最好的干预措施，其通过激活体内内源性的保护性的存活反应，通过多途径发挥作用，促进酵母、哺乳动物等多个物种延衰益寿的效应4。艾灸在治疗衰老相关疾病与SIRT1、AMPK、mTORC1等靶点 相关5，表现出与DR相似的生物效应。内文2.indd 7842023/2/28 10:35:48中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 785 灸法是用艾绒为主要材料制成的艾炷或艾条点燃以后，在体表的一定部位直接或间接熏灼以防治疾病的一种疗法。中医理论认为常灸关元等保健穴具有益寿延年的作用，统称为“保健灸”。如扁鹊心书记载：“人于无病时，常灸关元、气海、命门、中脘，虽未得长生，亦可得百余岁矣”。临床研究6也报道保健灸能改善衰老患者的临床症状，具有延缓衰老的功效。但目前笔者尚未见有关保健灸“益寿”的报道，故进行保健灸延年益寿的研究具有重要意义。以人的寿命为研究对象存在试验周期长、干扰因素多等问题，故筛选适用于保健灸的衰老动物模型具有重要意义。本文拟结合最新的研究报道筛选可开展保健灸研究的衰老模型。衰老相关研究随着细胞、分子生物学等实验技术的不断进步，关于衰老机制的研究已取得了重大进展。目前研究较多的学说有自由基学说及氧化应激学说、端粒学说、线粒体损伤学说、免疫学说、神经内分泌学说、信号通路学说、细胞自噬学说等。衰老不可避免地会导致许多疾病的发生。如脑老化导致神经系统功能的下降可能会引起多种神经退行性疾病；心脏衰老导致的心脏结构功能变化是多种心血管疾病的重要危险因素；衰老也是慢性阻塞性肺疾病的重要危险因素之一1；随着年龄的增长，肿瘤的发生率也逐渐攀升7；骨关节炎与衰老导致的关节结构退化密切相关8；衰老导致的代谢功能失调会引起血糖升高甚至导致2型糖尿病。这些疾病均会导致健康寿命的减少和生活质量的下降，因此该模型的筛选应具备诸如以上的一个或多个衰老指标的报道。衰老模型1.非哺乳纲模型 1.1 酿酒酵母模型 作为单细胞，酵母的生活周期短，遗传背景简单，已完成全基因组的测序，并在多年的实验研究应用中积累了丰富的操作经验。其衰老模型主要用于探索细胞衰老机制和筛选抗衰老药物或保健食品，并研究其作用机制9，也常用于神经退行性疾病的相关研究10。1.2 无脊椎动物模型 线虫、果蝇、蜜蜂等无脊椎动物，具有个体微小、结构简单、生命周期短、操作方便、易于培养观察等特点，也常用于衰老研究。秀丽线虫平均寿命仅20多天，常用于进一步探索细胞衰老机制，以及筛选潜在抗衰老药物及神经退行性疾病的临床药物11。果蝇衰老模型在发现通路靶点和筛选小分子药物等方面具有较大价值12。蜜蜂具有复杂的学习记忆行为，其衰老模型为相关的行为生物学研究提供了很好的 参考13。1.3 脊椎动物门鱼纲 水生动物衰老模型也是研究人类疾病的理想模型，其具有个体小、易于饲养、性成熟快、繁殖力强、操作方便、衰老过程与人类相似的特点。目前已建立的水生动物衰老模型有孔雀鱼、斑马鱼、假鳃鳉鱼和青鳉鱼等。斑马鱼因具有强大的再生能力，多用于研究组织修复和延缓衰老的机制14。鳉鱼可用于高通量抗衰老药物的筛选15。酿酒酵母、无脊椎动物、脊椎动物门鱼纲等具有较好的研究价值，但与人具有较远的亲缘关系，生活习性具有较大差异，不适宜本研究的筛选。2.哺乳纲模型2.1 灵长目类 从理论上讲，非人类灵长类（nonhuman primate，NHP）属于灵长目，是进行衰老相关研究最合适的模型。NHP与人类在遗传、生理、神经解剖、认知功能、行为特征和衰老改变等方面极为相近。NHP的研究结果具有极大的参考价值，能最大限度实现临床转化。目前已建立的衰老模型有恒河猴、普通狨猴、灰鼠狐猴、非洲绿猴等。但由于NHP体型较大，来源紧张，寿命较长，衰老相关的病理表现往往在中年以后才出现，若用NHP进行实验研究，需要耗费大量的人力和时间，极大地增加了实验研究的难度，不适宜本类研究的筛选。2.2 啮齿目类 啮齿动物是研究衰老和年龄相关疾病的最常见模型。此外，大鼠、小鼠基因组改造的技术手段成熟，可以培育出免疫缺陷等特殊品种，较为适宜本研究的筛选。具体类型可见表1。2.2.1 自然衰老模型：是指直接在实验室经过较长时间正常饲养，不加干预，培育至所需的年龄。自然衰老模型与人类衰老相似度极高，但也存在着获取难度大、饲养周期长（23年左右）、费用昂贵、干扰因素较多、个体差异大等缺点。2.2.2 快速老化小鼠（senescence accelerated mice，SAM）模型：SAM是日本京都大学培育研究出的自发性小鼠衰老模型，寿命较短，仅有1年左右。SAM目前共有12个亚系，不同亚系的病理表现各有不同，可根据研究目的选择相应的亚系。其缺点是价格不菲且来源不足。2.2.3 化学损伤模型：D-半乳糖衰老动物模型在行为学、形态学、生化水平以及分子生物学等多个方面都能较好地模拟自然衰老，且造模时间短、易于操作、重复性好。然而，目前模型的建立方法与评价缺乏统一的标准，造模剂量、给药途径、给药时间以及判断指标等因素均会对实验结果产生影响29；淀粉样蛋白（-amyloid，A）致衰老动物模型是在D-半乳糖所致动物模型基础上，海马内注射A，常用于对阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）的研究；氯化铝是大脑细胞的损害因子，是老年性痴呆症的因素之一，故氯化铝衰老动物模型主要用于对AD的研究。以上几种化学损伤衰老模型多集中于学习记忆方面，模型各有可选之处，但益寿方面的研究较少，未检内文2.indd 7852023/2/28 10:35:48中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 786 索到具体生存期数据，且均存在化学因子造成的损伤对实验结果也具有一定影响的缺点。2.2.4 物理损伤模型：臭氧是一种强氧化剂，常温下在机体内促进氧自由基的产生，造成细胞变性死亡，进而引发机体内多器官的功能衰退。通过吸入臭氧建立的臭氧致衰老动物模型与自然衰老相似，操作简便，成功率较高。射线致衰老动物模型是利用射线促进大量自由基的产生30。该方法操作简便、快速有效，但辐射剂量过大易引起动物死亡，且射线会对人体造成损伤，若操作不当将对人体造成危害。以上臭氧和射线的衰老表现大多围绕氧化应激学说相应指标。胸腺摘除使机体的免疫反应降低甚至缺失，导致衰老进程加快。但该方法存在着实验时间较长、对操作技术要求较高、操作不当易致表1 啮齿目类衰老模型分类表类型名称造模方法性别衰老出现的鼠龄文献报道的与衰老相关表现自然衰老模型 自然衰老模型16将实验动物饲养在实验室，经正常培育生长至所需的年龄雄小鼠1224月龄为老年期；大鼠1624月龄为衰老早期，3032月龄为衰老晚期在多个方面与人类衰老相似程度高；小鼠寿命1628个月，大鼠寿命2.53年快速老化小鼠模型SAMP817直接选用（购自Japan SLC Inc.）雄2月龄学习和记忆缺陷，情绪障碍（减少焦虑类行为），免疫反应受损；寿命约1年SAMP1017直接选用（购自Japan SLC Inc.）雄4月龄脑萎缩，学习记忆障碍，情绪障碍（抑郁行为），收缩肾，老年性淀粉样变；寿命约1年化学损伤模型 D-半乳糖衰老 动物模型18给实验动物定时、定量注射一定时间的D-半乳糖溶液雌雄 各半3月龄ICR小鼠连续注射 1个月后学习记忆障碍，Na+/K+-ATP酶活力下降，超氧化物歧化酶活力下降，免疫功能下降，胸腺组织萎缩淀粉样蛋白衰老 动物模型19给实验动物双侧海马内定向注射-淀粉样蛋白雄术后30 d后学习记忆功能减退，海马区可见弥漫性神经胶质细胞浸润和局部神经元的大量丢失氯化铝衰老动物 模型20给实验动物定时、定量注射一定时间的三氯化铝雄1月龄小鼠注射30 d后 学习记忆功能下降物理损伤模型 臭氧致衰老动物模 型21长期给实验动物吸入高浓度的臭氧雄12周龄小鼠造模56 d后行动迟缓，活动度明显减少，精神萎靡，呈现衰老状态改变射线致衰老动物 模型22给实验动物连续照射 射线雄10月龄大鼠辐照5 d后SOD活力显著下降、MDA含量显著升高，氧化酶及非氧化酶系统的防御机制减弱，白细胞总数、淋巴细胞和血红蛋白明显降低胸腺摘除致衰老 动物模型23通过外科手术的方法将实验动物的胸腺摘除雄3月龄大鼠胸腺摘除后继续饲养至6月龄大鼠毛色发黄，无光泽外观呈现衰老迹象；御寒能力减弱抗应激能力下降转基因模型APP单转基因模型24将人源性APP（野生或突变）基因导入小鼠，并在小鼠基因组整合、表达和遗传雄68月龄时形成A斑块，3个月时出现空间记忆障碍脑血管淀粉样变性，空间记忆障碍APP/PS1双转基因 模型24将APP转基因小鼠和Tau转基因小鼠进行交配雄68月龄时形成A斑块，6月龄时出现空间记忆障碍脑血管淀粉样变性，空间记忆障碍APP/PS1/Tau三转 基因动物模型24将双转基因小鼠进一步跟PSEN（presenilins）转基因小鼠交配雄4月龄时出现进行性学习 记忆障碍，6月龄时形成A斑块，出现空间记忆障碍，12月龄时出现Tau病理表现脑血管淀粉样变性，进行性学习记忆障碍，空间记忆障碍基因敲除/敲减模型SIRT6基因敲除 模型25将小鼠体内SIRT6蛋白 基因敲除雄2周后加速衰老，寿命缩短，伴有骨密度降低、皮下脂肪减少、淋巴细胞减少等早衰症状；寿命约4周Ercc1-/模型26-27应用ES技术构建ERCC1+/小鼠（引入终止密码子去除7个氨基酸）和ERCC1+/-小鼠（敲除ERCC1的Exon7），然后杂交筛选获得Ercc1-/小鼠雄12周龄自发地发展出多种与年龄相关的疾病，包括骨质疏松症、心血管疾病、白内障、听力和视力丧失、周围神经病变、肝纤维化、脑萎缩伴认知能力下降以及椎间盘退变；寿命 46月载脂蛋白E基因 敲除模型ApoE-/-28将小鼠体内APOE蛋白 基因敲除雄早期泡沫细胞病变可在10周内发生；15周后发展成动脉粥样硬化病变；20周后演变成晚期纤维病变全身性的代谢和功能异常；小鼠发育正常，但显示总血浆胆固醇水平显着增加和自发性动脉粥样硬化病变；寿命约15个月内文2.indd 7862023/2/28 10:35:48中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 787 小鼠死亡的缺点，且胸腺摘除后，衰老的某些免疫学指标将无法进行测定，会对试验的可信度、完整度造成一定影响。2.2.5 转基因模型：当前已有4种基因被广泛证明与衰老常见疾病AD的发病相关，分别是淀粉样前体蛋白基因、早老素1基因和早老素2基因、载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因、Tau基因，这4种基因突变会使动物模型大脑内A沉积，导致神经元衰老死亡。据此，研究者将其作为靶点，建立不同的转基因动物模型，主要分为单转基因模型、双转基因模型和多转基因模型24，常用于抗衰老药物评价和研究特定器官的衰老改变。2.2.6 基因敲除/敲减模型：最新研究中对明确生存期观察记载的有Ercc1-/小鼠、SIRT6基因敲除模型、ApoE-/-小鼠等，当然还有Xpg-/-模型、Werner综合征Werner-/-模型以及早衰综合征lmna-/-、Zmpste24-/-模型，这些模型可引起寿命缩短和神经退行性变等病理改变，同时也表现出多种器官生理性衰老症状。Ercc1-/小鼠与自然衰老小鼠具有相似的衰老细胞负荷广度和深度，具有年龄依赖性的、可比较的衰老状况。该小鼠多个DNA修复系统受损，衰老速度大约是野生型小鼠的6倍，是加速衰老的合适模型31。利用这些小鼠可以加速新的治疗靶点的确定和与年龄相关的干预措施的发展。有研究32将小鼠体内SIRT1 SIRT7 7个蛋白基因依次敲除。只敲除SIRT6的小鼠与其他小鼠相比，出现了寿命缩短的现象，伴有骨密度降低、皮下脂肪减少、淋巴细胞减少等早衰症状。但造模后小鼠寿命约4周，生存期相对较短，不利于较长干预时间实验的进行。ApoE-/-小鼠对于胆固醇极为敏感，多用于动脉粥样硬化、糖尿病、神经退化性疾病、肾脏疾病的研究33。但ApoE基因在各病理生理过程中的记录主要集中于胆固醇和动脉粥样硬化相关，全面的各个系统的表现有待新的报道。2.3 其他目 随着衰老相关研究范围的扩大，一些其他特殊动物也相继成为衰老研究模型。蝙蝠体型小而寿命长，多用于与鸟类进行比较进而探索长寿和抗衰老的机制34。食肉目犬和猫也是一种独特的衰老模型。最常用的衰老犬模型是比格犬，常作为研究人类认知功能与年龄相关的变化的重要工具35。李波等36发现中国树鼩目树鼩相较啮齿目动物，与灵长类动物的遗传亲缘关系更密切，在研究AD等神经退行性疾病方面比灵长类动物更具优势。王亚芳等37发现有独特生理特点的沙鼠可以作为动物模型用于研究抗衰老药物。以上几种动物的寿命周期较久，不利于12年内短期实验的实施。讨论疾病医学已渐向健康医学模式转变，医学的目标已经由疾病为核心向维护人的健康转变38。近年来，中医养生保健凭借独特的优势和特色，获得了国内外较高的关注度、重视度。其中保健灸作为中医药防治疾病与预防保健的一种重要手段，在中医养生方面发挥着十分重要的作用，但其作用机制尚不清晰。保健灸益寿延年研究的实验方式为保健灸关元穴等具有养生保健功效的穴位，需要实验动物有较为标准和规范的穴位定位。该模型应具有以下特点：与人类具有较近的亲缘关系，将动物限定在动物界-脊椎动物门-哺乳动物纲；寿命短，试验周期可控；可操作性强；同时有相应的文献支持该动物模型具有与人类相似的衰老表型。通过目前的研究报道，笔者对现有的衰老模型进行筛选，认为可选择较近亲缘啮齿动物。啮齿动物类衰老模型中自然衰老小鼠观察周期长，生存期23年，运用分子生物学技术对模型进行相关研究的报道31显示，发现Ercc1-/小鼠具有与自然衰老小鼠相似的衰老细胞负荷广度和深度，衰老速度大约是野生型小鼠的6倍，生存期约2025周龄，大大缩短观察周期，可进行高效、成本有效的实验和化疗的老化研究评估。应用Ercc1-/小鼠，可直接观察保健灸的“生存期”指标，直接观察延衰益寿的效应。随着细胞、分子生物学等实验技术的不断进步，期待更为合适的衰老动物模型的产生，将有助于升华中医养生理论，促进主动健康医学模式的发展，为中医养生保健、防治疾病赢得更多社会认可和提供实验数据支持。参 考 文 献1 刘爱玲,吕红,钱家鸣.细胞自噬和衰老及衰老相关疾病.现代消化及介入诊疗,2019,24(4):334-3372 沈干.我国老年医学近年临床研究的热点.中国临床保健 杂志,2016,19(1):1-33 Weindruch R,Sohal R 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