miR-M11基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响_王伟东.pdf

河南农业科学，2023，52（1）：134143Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi：10.15933/ki.10043268.2023.01.014miR-M11基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响王伟东1，2，3，滕蔓1，3，郑鹿平1，3，刘金玲1，3，张文凯1，3，4，李林燕1，3，4，张志会1，2，3，樊剑鸣2，罗俊1，3，4（1.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室/农业农村部动物免疫学重点实验室/河南省动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2.郑州大学 公共卫生学院，河南 郑州 450001；3.河南省农业科学院 中英禽病国际研究中心，河南 郑州 450002；4.河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003）摘要：为探究病毒编码的微小RNA前体基因miR-M11对马立克病病毒（MDV）体外复制能力的影响，以MDV国内分离株HN302为研究对象，利用CRISPR/Cas9系统靶向编辑并敲除位于Mid基因簇的miR-M11，构建1株miR-M11基因编辑缺失毒株HN302M11（克隆号C58-8-4）。经过PCR鉴定、测序分析、间接免疫荧光试验（IFA）、实时荧光定量PCR（qPCR）以及传代稳定性分析，证实HN302编码的miR-M11被精确编辑并从病毒基因组中完全缺失，且未发生回复突变。病毒增殖曲线绘制结果显示，miR-M11缺失毒株HN302M11的增殖速度显著高于亲本毒株HN302（P0.05）。综上，miR-M11是MDV复制的非必需基因，且其缺失后可增强MDV的体外复制能力。关键词：马立克病；miR-M11；微小RNA；CRISPR/Cas9；基因编辑；qPCR；复制中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）01-0134-10收稿日期：2022-06-01基金项目：国家自然科学基金项目（U21A20260）；河南省自然科学基金项目（212300410359）；河南省农业科学院自主创新项目（2022ZC65）作者简介：王伟东（1995-），男，河南周口人，在读硕士研究生，研究方向：分子毒理学。E-mail：通信作者：罗俊（1978-），男，河南罗山人，研究员，主要从事动物病毒学研究。E-mail：樊剑鸣（1971-），男，河南罗山人，副教授，主要从事分子毒理学研究。E-mail：Effect of miRM11 Gene Editing on Replication of Marek s DiseaseVirus in VitroWANG Weidong1，2，3，TENG Man1，3，ZHENG Luping1，3，LIU Jinling1，3，ZHANG Wenkai1，3，4，LI Linyan1，3，4，ZHANG Zhihui1，2，3，FAN Jianming2，LUO Jun1，3，4（1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences/Ministry of Agriculture and RuralAffairs&Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology，Zhengzhou 450002，China；2.College of PublicHealth，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001，China；3.UKChina Centre of Excellence for Research on AvianDiseases，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；4.College of Animal Science andTechnology，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China）Abstract：In order to explore the effect of virusencoded miRNA precursor miRM11 on the in vitroreplication ability of MDV，the domestic isolate HN302 of MDV was used as the parental virus，and theCRISPR/Cas9 system was used to targetedly edit and knock out miRM11 located in the Mid gene cluster，to construct a miRM11 gene editing deletion strain HN302M11（clone number C5884）.After PCRidentification，DNA sequencing，indirect immunofluorescence assay（IFA），realtime quantitative PCR（qPCR），and passage stability analysis，it was confirmed that the miRM11 encoded by HN302 was第 1 期precisely edited and completely deleted from the viral genome，and no reverse mutation occurred.Theresults of the virus proliferation curve assay showed that the proliferation rate of the miRM11deletedvirus strain HN302M11 was significantly higher than that of the parental virus strain HN302（P0.05）.In conclusion，miRM11 is a nonessential gene for MDV replication，and its deletion can enhance the invitro replication ability of MDV.Key words：Marek s disease；miRM11；miRNA；CRISPR/Cas9；Gene editing；qPCR；Replication马立克病病毒（Marek s disease virus，MDV）是一类具有细胞结合性和嗜淋巴细胞特性的疱疹病毒，感染宿主鸡可诱发马立克病（Marek s disease，MD），该病以淋巴细胞增生和内脏肿瘤形成为主要特征1。自 1907年该病首次报道2后，目前世界范围内均存在MD的流行，每年给全球家禽养殖业造成了巨大的经济损失3。尽管早期使用疫苗免疫雏鸡来防控MD取得了较好的成效，但随着MDV毒力的增强，部分流行毒株的毒力突破了现有MD疫苗的免疫保护，使得MD疫情仍时有暴发48。MicroRNA（miRNA）是一类小的非编码RNA分子，长度2224 nt。自从LEE等9首次在秀丽隐杆线虫中发现lin-4后，越来越多的miRNA在动物、植物以及病毒中被发现10。这些小分子RNA在细胞的发育与分化、疾病发生、肿瘤形成等生物学过程发挥重要的调控功能1112。目前已鉴定出500多个病毒miRNA，其中绝大多数编码于各种人类或动物疱疹病毒基因组中13。作为疱疹病毒家族的重要成员，血清 1型 MDV（MDV-1）编码 14个 miRNA前体基因，可表达加工生成26个成熟体miRNA，在MDV基因组反转重复序列区中共形成 3 个基因簇，即Meq基因簇、Mid基因簇和LAT基因簇1415。虽然少数几个病毒miRNA已被证明参与调控MDV的基因表达、肿瘤发生或潜伏感染1625，但大部分 MDVmiRNA的潜在功能和分子调控机制仍不清楚。基 于 成 簇 的 规 律 性 间 隔 短 回 文 重 复 序 列（Clusterregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat，CRISPR）和 CRISPR 相关蛋白 9（Cas9）系统的基因编辑技术，自2013年首次应用于哺乳动物真核细胞基因编辑以来，因其设计简单、成本低、效率高而被广泛应用于多种生物学研究领域。在病毒学领域尤其是疱疹病毒的基因功能及疫苗研究中，该技术也已展现出巨大的技术优势2628。随着CRISPR/Cas9系统首次应用于改造 MDV 基因组以来，国内外学者通过该系统成功构建了一系列MDV蛋白质编码基因（如 meq、pp38、gB）和 miRNA 基因编辑缺失毒株2934，为深入研究MDV的基因功能和致病机制提供了新的技术支撑。鉴于此，以MDV国内分离株HN302为研究对象，利用CRISPR/Cas9系统构建 HN302 的 miR-M11 前体基因缺失毒株，探究miR-M11缺失后对MDV体外复制能力的影响，旨在为MDV编码的miRNA的调控功能及分子机制研究奠定基础。1材料和方法1.1试验材料鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast，CEF）由910日龄SPF鸡胚制备；MDV毒株HN3027以及pMD18T-gB/meq/OVO质粒为河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存；pX459 v2.0基因编辑质粒、鼠源抗 MDV-pp38 单克隆抗体和兔源抗MDV-Meq 多 克 隆 抗 体 由 英 国 Pirbright 研 究 所Venugopal Nair教授馈赠；鼠源抗MDV-gB单克隆抗体由山东农业大学崔治中教授馈赠。1.2主要试剂M199、Opti-MEM 培养基购自 Gibco 公司；10Annealing Buffer 购自北京索莱宝科技有限公司；TransIT-X2Dynamic Delivery System购自Mirus Bio公司；TIANamp Genomic DNA Kit 和 TIANgel MidiPurification Kit购自TIANGEN公司；E.Z.N.AEndo-free Plasmid Mini Kit 购自 Omega Bio-Tek 公司；2Easy TaqPCR SuperMix、Trans1-T1 感受态细胞购自北京全式金生物公司；T4连接酶和Bbs-HF酶购自NEB公司；DyLight 488/594 羊抗鼠/兔 IgG购自 Abbkine 公司；pMD-18T 载体、PrimeScript RTMaster Mix 购 自 TaKaRa 公 司；FastStart UniversalSYBR GreenMaster（ROX）购 自 Roche 公 司；TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit、TaqMan Probe、TaqMan Universal Master Mix 、TaqManMicroRNA Assays购自Thermo Fisher公司。1.3试验方法1.3.1gRNA 及 PCR 引 物 设 计 与 合 成利 用Benchling（https:/）在线设计软件，分别设计靶向Mid基因簇miR-M11茎环结构及王伟东等：miR-M11 基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响135河南农业科学第 52 卷其邻近序列的gRNA，其中非G开头的gRNA oligo序列在其5端加上额外的1个G，并在序列5端添加Bbs的酶切位点（表 1），gRNA 靶点见图 1。利用Premier Primer 5.0软件设计聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量PCR（qPCR）引物，基因序列见表1，均由生工生物工程（上海）股份有限公司（上海生工）合成。表1靶向miR-M11的gRNA及用于鉴定miR-M11缺失株的PCR引物序列Tab.1gRNA targeting miR-M11 and PCR primer sequences for identification of miR-M11-deleted viruses引物名称Primer namemiR-M11-gR1FmiR-M11-gR1RmiR-M11-gR2FmiR-M11-gR2RStep2-FStep2-RMid-FMid-Ryg-gB-Fyg-gB-Ryg-pp38-F引物序列（53）Primer sequence（53）CACCGTCTTCCGAGTCTAAGCTACAAAACTGTAGCTTAGACTCGGAAGACCACCGATATGGACATCGCACATTAAAACTAATGTGCGATGTCCATATCGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCCGGGCCATTTACCGTAAGTTATGTAACGTCCGCATTGTGACTCTCAGCAGACATCGTAGAGAAAGCATAAGGTCTAGGGCATGGCACACGACGAATACGGAAACACAGAGCGGCCGAAAGACAAAACCCAAAT引物名称Primer nameyg-pp38-Ryg-meq-Fyg-meq-Ryg-ICP4-Fyg-ICP4-Ryg-RLORF4-Fyg-RLORF4-Ryg-RLORF5a-Fyg-RLORF5a-Ryg-OVO-Fyg-OVO-R引物序列（53）Primer sequence（53）ATGTAACCAGCATATAAGAACGCCGCAGGAAGCAGACGGACTACCATAGGGCAAACTGGCTCATGCACTGCATTCCGAGAGTCATTTGGGAATTTGGAGGGCGTGCTTGTTTTGGGTAATTGGTCTACTGGAACACAAGACTATGAGGACAATACCTCATCGCAGAGACGCCTCGTTCCGTTCGCTCTTTCAAGCAAGAGAAATGGGCTGATAGGAGGGGAAGACATCCAGTA注：下划线为Bbs酶切位点；粗体为额外添加的G/C。Note：The sites of Bbsrestriction enzyme are underlined.The extra added G/C are shown in bold.UL：长独特序列区；US：短独特序列区；TRL：长末端重复序列；IRL：长内部重复序列；TRS：短末端重复序列；IRS：短内部重复序列UL：Unique long sequence；US：Unique short sequence；TRL：Terminal repeat long sequence；IRL：Internal repeat long sequence；TRS：Terminal repeatshort sequence；IRS：Internal repeat short sequence图1MDV编码Mid基因簇miRNA的基因座位及gRNA靶点Fig.1Genomic location encoding MDV miR-M11 in the Mid-cluster and target sites of gRNAs1.3.2pX459-gRNA 质粒的构建使用 Bbs-HF酶切 pX459 v2.0 质粒并胶回收载体。使用 10Annealing Buffer将表1中的gRNA互补双链进行复性，利用 T4 DNA 连接酶将其连接到 pX459 v2.0载体中，转化Trans1-T1感受态细胞，涂布LB平板，过夜培养后挑取单菌落。用Step2-F/Step2-R引物对进行菌液PCR鉴定后，送上海生工测序。鉴定连接成功后提取pX459-gRNA质粒，测定浓度后-20 保存备用。1.3.3基因编辑效果鉴定提前准备好24孔细胞板 CEF 单层，依据 TransIT-X2Dynamic DeliverySystem使用说明，将靶向miR-M11茎环结构上下游的 pX459-gRNA 表达质粒各 250 ng 共转染至 CEF后，培养24 h。随后将HN302病毒按1 000 pfu/孔感136第 1 期染转染后的CEF，48 h后取50%细胞培养物，将其用1DNA提取缓冲液（200 g/mL蛋白酶K、10 mmol/LTris-HCl，pH值8.0、1 mmol/L EDTA、25 mmol/L NaCl）重悬，置于金属浴中65 30 min、95 5 min后获得细胞培养物总DNA。以其为模板，用Mid-F/Mid-R进行 PCR 扩增。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，对目的条带切胶回收后连接pMD-18T载体，并送上海生工测序。1.3.4病毒纯化及鉴定将1.3.3中转染接毒后的24孔细胞板内剩余50%的CEF重悬，用有限稀释法接种至6孔细胞板CEF单层。培养34 d，观察到明显的病毒噬斑后，显微镜下无菌操作挑取单克隆病毒噬斑，分别转接至24孔细胞板CEF单层中。继续培养 2 d后，按照 1.3.3中所述方法进行 PCR鉴定。选取编辑产物电泳条带较亮的孔，进行下一轮噬斑纯化。3轮病毒噬斑纯化后，获得miR-M11编辑缺失的毒株HN302M11。将其连续传代15次，取第15代、第10代、第15代病毒样品，提取DNA后进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定基因缺失毒株的稳定性。1.3.5间接免疫荧光试验（IFA）从液氮中取出HN302亲本毒株和miR-M11缺失毒株HN302M11，分别将其转接至24孔细胞板CEF单层内。3 d后，用预冷的甲醇丙酮（1 1，250 L/孔）固定；室温固定10 min后，用含0.05%Tween-20的PBS（PBST）洗涤 3 遍，甩干；加入含 5%脱脂奶粉的 PBST，放于37 温箱中封闭。封闭30 min后，用PBST洗3遍，甩干；加入稀释的 MDV-pp38 鼠源单克隆抗体（1 5 000，200 L/孔），放于37 温箱中孵育。孵育30 min后，用PBST洗3遍，甩干，加入稀释的荧光二抗 DyLight 488羊抗鼠 IgG（1 1 000，200 L/孔），放于 37 温箱中孵育。孵育 30 min 后，用 PBST 洗3遍，甩干。随后，再按照以上步骤孵育稀释的MDV-gB鼠源单克隆抗体（1 5 000）和稀释的荧光二抗 DyLight 594 羊抗鼠 IgG（1 1 000）。PBST 洗3遍后，每孔加入 200 L PBST，放于倒置荧光显微镜下观察结果。同时，另取一孔平行接毒的细胞，按照上述操作步骤孵育MDV-Meq兔源多克隆抗体（1 5 000）、荧光二抗DyLight 488羊抗兔IgG（1 1 000）、MDV-gB鼠源单克隆抗体（1 5 000）和荧光二抗DyLight 594羊抗鼠IgG（1 1 000）。最后用PBST洗3遍，每孔加入200 L PBST，放于倒置荧光显微镜下观察结果。1.3.6qPCR从液氮中取出 HN302 亲本毒株和miR-M11 缺失毒株 HN302M11，分别将其转接至6孔细胞板CEF单层内，3 d后收取细胞培养物，用TRIzol 法 提 取 细 胞 培 养 物 总 RNA。使 用PrimeScript RT Master Mix制备cDNA，以此cDNA为模板，使用表1中荧光定量引物进行qPCR，检测病 毒 蛋 白 编 码 基 因 gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a和ICP4的相对表达水平。以总RNA为模板，使用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit和 MDV miRNA 反转录引物制备病毒 miRNA 的cDNA，使用购自Thermo Fisher公司的MDV TaqMan探 针 检 测 miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p和miR-M13-3p等6个病毒miRNA的相对表达水平。1.3.7病毒增殖曲线绘制从液氮中取出 HN302亲本毒株和 miR-M11缺失毒株 HN302M11，转接至 6 孔细胞板 CEF 单层内，500 pfu/孔。病毒感染后，每间隔24 h收取1个孔内的全部细胞培养物（约106个细胞），至病毒感染后144 h共收集6次样品。用 TIANamp Genomic DNA Kit 提取上述样品 DNA，测定 DNA 质量浓度后稀释为 50 ng/L，备用。同时，将 pMD18T-meq、pMD18T-gB 和 pMD18T-OVO质粒 10 倍倍比稀释后（108拷贝/L103拷贝/L），构建qPCR标准曲线。取上述病毒感染细胞的DNA样品，使用表1中列示的荧光定量引物进行qPCR，分别测定2个毒株在不同时间点gB、meq和OVO的基因拷贝数，并绘制病毒体外增殖曲线。2结果与分析2.1pX459-gRNA质粒的构建及鉴定根据MDV-1编码的Mid基因簇miRNA基因座位及序列（图 1），针对 miR-M11 前体基因设计 2 条gRNA，通过破坏miR-M11的茎环结构实现miRNA基因敲除的目的。将gRNA上下游互补双链gR1F/gR1R和gR2F/gR2R分别复性后与pX459 v2.0载体连接并进行测序。序列比对分析的结果表明（图2），成功构建了2个靶向miR-M11的gRNA/Cas9表达质粒：pX459-gR1和pX459-gR2。2.2基因编辑效率分析通过 pX459-gRNA 转染细胞+病毒感染的方式，将2个gRNA表达质粒各250 ng共转染至24孔细胞板 CEF单层内，24 h后感染 HN302，病毒感染48 h后检测基因编辑效果。结果显示，感染病毒的阴性对照仅扩增出 1 135 bp 的大条带，而转染了pX459-gR1/gR2 质粒组合并感染 HN302 的 CEF 中王伟东等：miR-M11 基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响137河南农业科学第 52 卷pX459-gR2pX459-gR1图2pX459-gRNA重组质粒gRNA连接区域测序结果Fig.2Sequencing results of the gRNA junction region of pX459-gRNA recombinant plasmidsA：miR-M11基因编辑的PCR鉴定；B：HN302与HN302M11基因编辑序列的比对分析（DSB：DNA双链缺口；PAM：前间隔序列邻近基序）C：基因编辑产物的核苷酸序列分析图谱；D：HN302M11的传代稳定性PCR分析（P1P15：HN302M11传代的次数）A：PCR identification of miR-M11 gene editing product；B：Comparative analysis of HN302 and HN302M11 gene edited sequences（DSB：Doublestranded broken；PAM：Protospacer adjacent motif）；C：The nucleotide sequence analysis map of gene editing PCR product；D：PCR analysis ofpassage stability of HN302M11（P1P15：The passage times of HN302M11）图3miR-M11基因编辑及缺失毒株HN302M11的PCR鉴定及测序分析Fig.3PCR identification and sequencing analysis of the miR-M11 gene editing and the mutant HN302M112 0001 0007505003001001 135 bp841 bpMHN302+gR1/gR2HN302CEFAMHN302HN302+gR1/gR2HN302M11-P1HN302M11-P2HN302M11-P3HN302M11-P4HN302M11-P5HN302M11-P10HN302M11-P15CEF2 0001 0007505003001001 135 bp841 bpDHN302HN302M11BHN302M11Cbpbp除了扩增出 1 135 bp 的大条带之外，还均扩增出841 bp 大小的与预期相符的基因编辑小条带（图3A）。胶回收目的小条带，测序结果显示，该基因片段确为 miR-M11 被编辑剪切后的剩余序列，表明gR1和gR2有效编辑了病毒基因组。其中gR1的切割位点为PAM序列上游4 bp处，而gR2切割位点位于PAM序列上游3 bp处，与预期完全相符（图3B、图3C）。2.3病毒纯化及传代稳定性分析将1.3.3中剩余的50%病毒感染细胞，以不同剂量梯度转接至6孔细胞板内，34 d后置于倒置显微镜下操作，挑取96个单克隆病毒噬斑至24孔细胞板不同孔 CEF 中，培养 48 h 后再次消化取样进行PCR鉴定，选取编辑条带较亮的阳性孔，如上所述138第 1 期进行第2轮和第3轮的病毒单噬斑纯化，各随机挑取48个和24个单噬斑，最终获得1株纯化的miR-M11基因编辑缺失毒株，命名为HN302M11（克隆号C58-8-4）。再次测序鉴定的结果与之前相一致（图3B、3C）。将HN302M11连续传代15次，然后分别取样进行基因编辑稳定性分析，PCR扩增鉴定的结果显示，第 15、10、15 代样品中均只扩增出841 bp大小的基因编辑小条带（图3D），表明基因缺失毒株HN302M11的稳定性良好。2.4病毒miRNA和蛋白质编码基因的表达分析为分析 Mid基因簇 miR-M11的缺失是否影响其他 miRNA 以及病毒蛋白编码基因的表达，用HN302和HN302M11分别感染CEF，3 d后收取细胞培养物，提取总 RNA 后反转录为 cDNA。使用TaqMan 探针法检测 Mid 基因簇中 miR-M11-5p、miR-M11-3p、miR-M31-3p、miR-M1-5p、miR-M4-5p 和 miR-M13-3p 的相对表达水平。使用 SYBRGreen 法检测 gB、meq、pp38、RLORF4、RLORF5a 和ICP4 的相对表达水平。以 miR-M13-3p 为内参分析的结果显示，亲本株 HN302 的 miRNA 均可正常表达，而HN302M11的miR-M11-5p和miR-M11-3p均未检测到表达，其余miRNA均可表达（图4）。以 ICP4 为 内 参 基 因 分 析 的 qPCR 结 果 显 示，HN302M11和亲本株的 gB、meq、pp38、RLORF4和RLORF5a均正常表达（图5）。*表示差异显著（P0.05）*indicates significant difference（P0.05）图4HN302和HN302M11感染CEF中部分病毒miRNA的相对表达水平Fig.4Relative expression levels of MDV miRNAs in HN302 or HN302M11-infected CEFs2.52.01.51.00.50.0miR-M11-5pHN302HN302M11相对表达水平Relative expression levelmiR-M11-3pmiR-M31-3pmiR-M1-5pmiR-M4-5p*图5HN302和HN302M11感染CEF中部分病毒蛋白编码基因的相对表达水平Fig.5Relative expression levels of MDV protein-coding genes in HN302 or HN302M11-infected CEFs2.01.51.00.50.0相对表达水平Relative expression levelHN302HN302M11gBpp38meqRLORF5aRLORF42.5miR-M11基因缺失毒株的IFA鉴定结果为分析miR-M11的缺失是否影响MDV噬斑形成及病毒蛋白的表达，用特异性抗MDV gB、pp38和Meq 蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体分别孵育HN302 和 HN302M11 感染的 CEF 细胞，进行 IFA染色。结果显示，在荧光显微镜下，HN302 和HN302M11的绿色荧光染色的pp38蛋白或Meq蛋白均与红色荧光染色的gB蛋白所指示的病毒噬斑形成良好的共定位（图 6）。以上结果表明，miR-M11的编辑缺失不影响MDV的噬斑形成及gB、Meq和pp38蛋白的正常表达。王伟东等：miR-M11 基因编辑对马立克病病毒体外复制的影响139河南农业科学第 52 卷2.6miR-M11基因缺失毒株体外增殖曲线绘制结果为测定 miR-M11 的缺失是否影响 MDV 的增殖，将 HN302 和 HN302M11 分别感染 6 孔细胞板CEF单层，并在感染后24144 h内每间隔24 h收集1份样品，提取总DNA后检测不同时间点MDV基因gB、meq以及宿主 OVO基因的拷贝数，计算等量细胞内病毒基因拷贝数并绘制病毒体外增殖曲线。结果显示，与亲本毒株HN302相比，HN302M11的增殖速度更快，在等量接种感染 CEF 后 96 h 和120 h，基因缺失毒株的病毒增殖量均显著高于亲本毒株（图 7）。表明 miR-M11的编辑缺失显著增强了MDV的体外复制能力。图6HN302和HN302M11感染CEF中的gB、Meq和pp38蛋白表达的IFA分析Fig.6IFA analysis of the gB，Meq and pp38 protein expressions in HN302 or HN302M11-infected CEFspp38gBMergeMeqgBMergeHN302M11HN302HN302M11HN30250 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m50 m*表示差异显著（P0.05）；*表示差异极显著（P0.01）*indicates significant difference（P0.05）；*indicates very significant difference（P0.01）图7HN302和HN302M11在CEF中的增殖曲线Fig.7Growth kinetics of HN302 and HN302M11 viruses in CEFs321024487296120144HN30211HN302感染时间/hHours postinfectionmeq基因拷贝数meq genomic copiesA54321024487296120144HN30211HN302感染时间/hHours postinfectiongB基因拷贝数gB genomic copiesB140第 1 期3结论与讨论作为一种致瘤性疱疹病毒，MDV在研究病毒致病和肿瘤形成机制中扮演重要角色。过去几十年里，为研究MDV编码的基因功能，利用细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome，BAC）技术，已构建了多种不同毒株的感染性BAC克隆3537。随后利用Rec E/T同源重组技术，可在BAC克隆的基础上进一步对目的基因进行敲除或敲入。近年来，利用该技术对MDV编码的miRNA功能进行研究也陆续报道16，1819。但是，疱疹病毒基因组很大，BAC克隆的构建过程比较耗时费力，操作步骤烦琐且Rec E/T同源重组的效率较低。为方便突变体的筛选，往往还会在病毒基因组中插入外源的抗性筛选基因，如果作为疫苗候选毒株还需要进一步将其从基因组中剔除。此外，在研究miRNA功能时，因剔除抗性筛选基因后残余的重组序列元件如FRT的大小与 miRNA 相似，也会对 miRNA 重组毒株的筛选和鉴定造成很大的困难。CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现解决了BAC克隆和Rec E/T同源重组技术的一些难题，因其构建过程简单，可直接靶向病毒基因组且编辑效率非常高，不会将外源片段残留至病毒基因组内，很快在病毒学领域的基因功能研究及疫苗研发中得到了广泛的应用2628。本研究利用CRISPR/Cas9系统，采用双重敲除策略，构建2个gRNA靶向MDV国内分离株HN302编码的miR-M11基因，构建了1株稳定的miR-M11基因编辑缺失毒株HN302M11。病毒体外增殖曲线测定的结果显示，HN302M11在感染CEF后96 h和120 h的病毒基因组拷贝数均显著 高 于 其 亲 本 毒 株 HN302，这 与 此 前 报 道 的GXmiR-M11 和 RB-1BmiR-M11 基因缺失毒株的相关研究结果一致19，33。上述研究进一步证实，miR-M11不仅不是病毒复制的必需基因，将其编辑缺失反而可以显著增强MDV的体外复制能力。但是miR-M11编码的miRNA是直接调控MDV的病毒基因从而影响病毒增殖，还是通过靶向宿主基因及相关信号通路来调控细胞的增殖和/或凋亡以调节病毒复制，仍需要进一步深入研究。在 MDV-1 编码的 3 个 miRNA 基因簇中，研究较多的是Meq基因簇的miRNA。其中miR-M4-5p已被证实是宿主癌基因miR-155的病毒同功分子，可能作为MDV促癌因子参与肿瘤的形成；敲除Meq基因簇的其他miRNA（miR-M2、miR-M3、miR-M5、miR-M9和miR-M12）后，肿瘤的发生率也都显著降低，表明Meq基因簇的miRNA在MD肿瘤形成过程中发挥着重要作用1618。Mid基因簇和LAT基因簇的miRNA研究较少，其中Mid基因簇miR-M31-3p的缺失也可显著降低病毒的致病性和致瘤率，显示出与 miR-M4-5p相似的调控功能19。前人研究表明，敲除 GX0101 的 miR-M4-5p 后，miR-M11 的表达水平明显增加18。而本研究中发现 miR-M11被编辑缺失后，miR-M4-5p和miR-M31-3p的表达水平则显著提高（P0.05），这表明 miR-M11 与另外2个miRNA的表达水平在MD发病或肿瘤发生过程似乎保持着相互的制约和平衡，miR-M11很可能作为抑瘤基因参与调控MD肿瘤的形成。总之，本研究利用 CRISPR/Cas9 基因编缉技术对 HN302 的miR-M11 进行编辑和缺失，构建 1 株稳定的 miR-M11缺失毒株，为后续研究 MDV编码 miRNA的调控功能及分子机制奠定了重要基础。参考文献：1 NAIR V，GIMENO I，DUNN J.Marek s disease M/SWAYNE D E，BOULIANNE M，LOGUE C M，et al.Disease of poultry.New Jersey：John Wiley&Sons Inc.，2020：550587.2 JZSEF M.Multiple nervenentzuendung（polyneuritis）bei Huehnern J.Deutsche Tierarztliche Wochenschrift，1907，15：417421.3 KENNEDYDA，CAIRNSC，JonesMJ，etal.Industrywide surveillance of Marek s disease virus oncommercial poultry farms J.Avian Diseases，2017，61：153164.4 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