植物乳杆菌ZJ316中广谱抗菌物质的分离纯化及抗菌机制研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文植物乳杆菌ZJ316中广谱抗菌物质的分离纯化 及抗菌机制研究摘要微生物污染引起的食源性疾病严重危害人畜健康甚至威及生命。抗生素类药物因其抗菌谱广、杀菌能力强而被广泛应用于临床，但是，抗生素的滥用导致药物残留、多重耐药菌出现、二重感染等问题频繁 出现，更可能引发“未来无药可用”的严重后果。因此，寻找天然、高效、无害、安全的广谱抗菌剂迫在眉睫。乳酸菌被公认为安全的食 品级微生物，其代谢产物中的有机酸、细菌素、过氧化氢等对食品中 的致病菌和腐败菌具有抗菌效果。植物乳杆菌ZJ316是本实验室前期 从健康新生婴儿粪便中筛选到的一株乳酸菌，其发酵上清液具有广谱 抗菌性。本研究通过建立完整的分离纯化体系，从该菌发酵上清液中 分离纯化到一种天然的抗菌物质一苯基乳酸，并对苯基乳酸的广谱抗 菌性和抗菌作用机制做了深入研究。主要研究内容如下：1、广谱抗菌物质的分离纯化以植物乳杆菌ZJ316发酵上清液为研究对象，经新建立的三步分 离体系（XAD-2大孔树脂吸附层析、固相萃取、制备型高效液相色 谱）纯化得到一种具有广谱抗菌潜力的物质，其提取量为63.24 mg/L,纯度为98.14%。该抗菌物质能有效抑制对藤黄微球菌10209、肠炎沙 浙江工商大学硕士学位论文门氏菌肠炎亚种ATCC 14028和烟曲霉ATCC 13073。2、抗菌物质鉴定利用电喷雾质谱法（ESI-MS）测得抗菌物质的分子量为166 Da,利用核磁共振谱（NMR）技术分析鉴定其分子式为C9H10O3,并确定 该抗菌物质为苯基乳酸。进一步运用手性色谱技术，确定该物质中 L苯基乳酸和D苯基乳酸的比例为94.043%:5.957%O3、广谱抗菌性研究通过牛津杯法抗菌活性检测和96孔板法最小抑菌浓度实验，测 定苯基乳酸对包括金黄色葡萄球菌D48、肠炎沙门氏菌肠炎亚种 ATCC 14028白假丝酵母、单增李斯特氏菌LM1等病原菌在内的22 种菌的抗菌谱。其中对金黄色葡萄球菌D48、肠炎沙门氏菌肠炎亚种 ATCC 14028的抗菌效果最为显著，最小抑菌浓度分别为1.50mg/mL 和2.00 mg/mLo对白假丝酵母的最小抑菌浓度为3.50 mg/mL。4、广谱抗菌物质（苯基乳酸）抗菌作用机制研究以金黄色葡萄球菌D48和肠炎沙门氏菌肠炎亚种ATCC 14028为 敏感指示菌，通过扫描电镜和透射电镜观察苯基乳酸处理前后细菌细 胞微观形态的变化，发现指示菌的细胞壁和细胞膜均有破损，形成膜 通道，细胞质流出。并且经苯基乳酸处理的金黄色葡萄菌和肠炎沙门 氏菌的胞外电导率急剧升高，胞内ATP水平迅速降低，跨膜电势差（AT）和质子浓度梯度（ApH）瞬间坍塌。综上结果，造成细胞膜 破裂致使膜内容物泄露是苯基乳酸抗菌的作用模式。浙江工商大学硕士学位论文关键词：植物乳杆菌ZJ316；分离纯化；苯基乳酸；广谱抗菌作用;抗菌机制浙江工商大学硕士学位论文I SOLATI ON AND PURI FI CATI ON OF ABROAD-SPECTRUM ANTI MI CROBI AL SUBSTANCEFROM LACTOBACILLUS PLANTARUM ZB 16 AND STUDYON I TS ACTI ON OF ANTI BACTERI AL MECHANI SMABSTRACTFood-borne diseases caused by microbial contamination seriously endanger the health of humans and animals and even threaten their lives.Antibiotics are widely used clinically due to their broad antibacterial spectrum and bactericidal activity.However,antibiotics abusement has led to the frequent occurrence of drug residues,the emergence of multi-drug resistant bacteria and double infection,which are more likely to trigger the serious consequences that there will be no medicine available in the future.Looking fbr natural,efficient,harmless,safe antibacterial substances is imminent.Lactobacillus is generally regarded as safe food-grade microorganism,and its metabolites such as organic acids,bacteriocins,hydrogen peroxide have great antibacterial effects on food pathogens and spoilage bacteria.Lactobacillus plantarum ZJ316 was screened from the excrement of healthy newborn babies in our laboratory in the early stage,and its fermentation supernatant has broad-spectrum antibacterial activity.This study had established a complete system to separate and purify a natural antimicrobial substance一phenyllactic acid(PLA)from the fermentation supernatant of浙江工商大学硕士学位论文Lactobacillus plantarum ZJ316.And then broad-spectrum antimicrobial activity and antibacterial mechanism of PLA were studied further.The research contents are as follows:1.Purification of a broad-spectrum antimicrobial substanceThe fermentation supernatant of Lactobacillus plantarum ZJ316 was selected as the research object.The substance with broad-spectrum antimicrobial potential was purified from it by a new three-step separation system including XAD-2 macroporous resin adsorption chromatography,solid phase extraction(SPE)and preparative high performance liquid chromatography(HPLC).The extraction amount of antibacterial substance from fermentation supernatant was 63.24 mg/L and the purity was 98.14%.Whafs more,the purified substance was able to effectively inhibit Micrococcus luteus 10209,Salmonella enterica subsp.enterica ATCC 14028 and Aspergillus fumigatus ATCC 13073.2.Identification of the antimicrobial substanceThe molecular weight of the antibacterial substance was 166 Da determined by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS).I ts formula was C9H10O3 by nuclear magnetic resonance(NMR)analysis and the antibacterial substance was identified as phenyllactic acid.Furthermore,the ratio of L-PLA and D-PLA in this material was determined by chiral chromatography,which was 94.043%:5.957%.3 The study of broad-spectrum antimicrobial propertiesAccording to the agar well diffusion test and microtiter plate well method detection,the inhibition spectrum and minimal inhibitory concentration(MI C)were achieved.The results showed that PLA can inhibit 22 kinds of bacteria,including Staphylococcus aureus D48,Salmonella enteritidis subsp.enteritidis ATCC 14028,Candida albicans,Listeria monocytogenes LM1 and several other strains.Among them,浙江工商大学硕士学位论文PLA performed the strongest activity against S.aureus D48 and S.enterica subsp.enterica ATCC 14028,the MI Cs were 1.50 mg/mL and 2.00 mg/mL,respectively.I n addition,the MI C of C.albicans was 3.50 mg/mL.4.The study of bacteriostatic mechanism of phenyl lactic acidS.aureus D48 and S.enterica subsp.enterica ATCC 14028 were selected as sensitive indicator bacteria.Scanning and transmission electron microscopy were used to observe the distinctions of cells surface and sections morphology including cell wall and cell membrane permeability,membrane channels formation and intracellular ion leakage after treatment with PLA for 1 h.The electric conductivity(EC)of environments increased sharply,rapidly intracellular ATP depletion occurred,and subsequently the transmembrane electrical potential(AT)and transmembrane pH gradient(ApH)dissipated after the indicators treated with PLA.I n conclusion,the action of antibacterial mechanism of PLA is causing cell membrane rupture resulting in leakage of cellular contents.KEYWORDS:Lactobacillus plantarum ZJ316;I solation and Purification;Phenyllactic acid;Broad-spectrum antimicrobial activity;Antimicrobial mechanism浙江工商大学硕士学位论文目录第一章绪论.11.1 乳酸菌.11.1.1 乳酸菌的分类.11.1.2 乳酸菌发酵及其代谢产物分类.31.2 抑菌机理.71.2.1 有机酸的抑菌作用模式.71.2.2 细菌素的抑菌作用模式.1013课题研究的内容及技术路线.121.3.1 研究目的及意义.121.3.2 研究内容.131.3.3 研究技术路线.14第二章广谱抗菌性物质的分离和纯化.152.1 引言.152.2 实验材料与方法.162.2.1 实验菌种.162.2.2 主要仪器设备.162.2.3 主要试剂与耗材.172.2.4 相关溶液配制.172.2.5 实验方法与内容.182.3 实验结果与讨论.232.3.1 XAD-2大孔树脂层析和固相萃取（SPE）.232.3.2 高效液相色谱分离纯化.252.3.4 抗菌物质纯度分析.282.3.5 冷冻干燥制备抗菌物质.292.4 小结.30浙江工商大学顽土学位论文第三章植物乳杆菌ZJ316中广谱抗菌物质的鉴定.323-1引言.323.2 材料与方法.333.2.1 主要仪器设备.333.2.2 主要试剂与耗材.33323相关溶液配制.333.2.4 实验方法与内容.333.3 实验结果与讨论.3533.1质 谱分子量测定.353.3.2 核磁共振谱结构分析.373.3.3 对映异构体分析.393.4 小结.42第四章植物乳杆菌ZJ316广谱抗菌物质苯基乳酸的抗菌机制研究.434.1 引言.434.2 材料与方法.444.2.1 实验菌种.444.2.2 主要仪器设备.454.2.3 主要试剂与耗材.454.2.4 相关溶液配制.454.2.5 实验方法与内容.464.3 实验结果与讨论.504.3.1 苯基乳酸的抗菌谱及最小抑菌浓度.504.3.2 苯基乳酸对指示菌超微结构的影响.524.3.3 苯基乳酸对指示菌细胞膜质子动力势的影响.554.3.4 苯基乳酸对指示菌胞内ATP水平的影响.584.3.5 苯基乳酸对指示菌细胞溶液电导率的影响.604.4 小结.62第五章主要研究结论与展望.63浙江工商大学硕士学位论文5.1 主要研究结论.635.2 主要创新点.6453展望.64参考文献.65致谢.79浙江工商大学硕士学位论文第一章绪论1.1 乳酸菌抗生素是某些微生物通过酶促反应将初级代谢物转变为结构性的次级代谢 物，具有抗病原性或其他活性。作为一种基础用药，抗生素的临床使用广泛，是 我国目前各类用药市场中规模最大的一种药物。虽然，这几年受到“限抗令”的 影响，抗生素使用的年增长率有所下降，但总用量还是逐年增长。抗生素的滥用 导致环境污染，食品源产品中药物残留严重，大量耐药菌株的出现，对人们的健 康造成严重威胁，干扰生态系统的稳态。减少抗生素的滥用，寻找和研制安全、绿色、无毒、高效的新型天然抗菌剂迫在眉睫。与化学类抗菌剂相比，天然抗菌剂来自天然物质，相对安全可靠，一般可分 为三大类：（1）动物源天然抗菌剂，如甲壳质、壳聚糖、溶菌酶网、乳过氧化 物叫（2）植物源天然抗菌剂，如醛类物质5,6、酯类物质、香料精油田。等；（3）微生物源天然抗菌剂，如乳酸链球菌素用、罗伊氏素口刃等。其中微生物源食品 防腐剂具有高效、安全、无毒等特点，是最具发展潜力的天然抗菌物质。众所周知，乳酸菌（Lactic Acid Bacteria,LAB）被FDA认定为食品级微生 物（Generally Regarded as Sa色，GRAS）,对人畜健康绝对安全口纥 最早发现乳 酸菌的是法国科学家巴斯德，在研究发酵过程中发现并将其命名为“levue lactique。Mechnikov则最早提出乳酸菌和人类的关系，他发现大多数疾病是由 于微生物进入人体内产生毒素和有害代谢产物引起的，乳酸菌则可有效抑制肠道 有害微生物的生长。乳酸菌是能够利用可发酵碳水化合物如葡萄糖、乳糖等代谢 分解，形成乳酸的革兰氏阳性细菌的总称，广泛存在于发酵乳制品、肉类、腌制 果蔬制品、人畜胃肠道等口习，具有提供营养物质、改善人体肠道功能、增强机体 免疫力、降低胆固醇等功效，常被用作益生菌制剂的研发对象电。1.1.1 乳酸菌的分类目前在自然界中已经发现的乳酸菌按伯杰氏系统细菌学手册（第二版）1浙江工商大学硕士学位论文生化分类法进行归类，可分为5个属：双歧杆菌属、片球菌属、乳杆菌属、链球 菌属和明串珠菌属；按细菌分类学进行归类，则可划分出至少23个属口呼儿乳杆菌属乳杆菌属(Lactobacillus)菌的细胞形态一般呈链杆状或球杆状，是一类耐 酸性强、无芽胞杆菌的革兰氏阳性菌，广泛分布于动物的口腔、阴道和肠道内，也存在于含有碳水化合物的动植物发酵产品中2。主要包括植物乳杆菌、干酪乳 杆菌、詹氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和短乳杆菌等。1.1.1.2 链球菌属链球菌属iStreptococcus的乳酸菌细胞呈球形或卵圆形，链状排列，其中 短链由48个菌体组成，长链由2030个菌体组成。该属的乳酸链球菌、乳酪链 球菌和嗜热乳链球菌等被广泛应用于发酵制品的生产。1.1.1.3 明串珠菌属明串珠菌属(Leuconostoc)菌呈对状或短链状排列，不产生施子。主要包括 肠膜明串珠菌、阿根廷明串珠菌、乳酸明串珠菌、嗜柠檬酸明串珠菌、肉明串珠 菌等七个种2儿这类菌常常是发酵果蔬、饲料等食品中存在的优势细菌。由于明 串珠菌代谢产生适量C02气体和风味物质，也常将其作为一种乳制品发酵剂。1.1.1.4 双歧杆菌属双歧杆菌(.Bifidobacterium是一类细胞形态呈现Y字型、V字型、弯曲状 等多种形状的无芽抱的革兰氏阳性菌。广泛存在于人畜肠道、人体牙齿缝隙和反 刍动物的瘤胃中。双歧杆菌可分为24个种，其中青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌五种乳酸菌不仅能定植在人体肠道中，而且可用于生产制造保健食品22网。1.1.1.5 片球菌属片球菌属(Pediococcus)菌为革兰氏阳性球菌，细胞排列呈四联状，发酵葡 萄糖只产生乳酸，不产乙酸，不产气。常见片球菌属有小片球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌和嗜盐片球菌等，其中乳酸片球菌和戊糖片球菌用于食品加工3】。2浙江工商大学硕士学位论文1.1.2乳酸菌发酵及其代谢产物分类1.1.2.1 乳酸菌发薛类型乳酸菌利用碳水化合物发酵可分为同型发酵和异型发酵，异型发酵的过程和 产物比同型发酵更为复杂251。Zaunmiiller等126研究发现，当乳酸菌进行同型发酵 时，乳酸是唯一代谢产物，德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等只可进行同 型乳酸发酵。乳酸菌异型发酵除产生乳酸外，还能产生细菌素、过氧化氢、芳香 族化合物、乙酸、乙醇、B族维生素等多种物质，两歧双歧杆菌、番茄乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌、甘露乳杆菌和发酵乳杆菌等均能进行异型乳酸发酵。不同乳酸菌进行异型乳酸发酵的途径、所需的酶和产物存在较大差异（如表1-1表1-1乳酸菌同型发酵和异型发酵的异同点Table 1-1 The similarities and differences of homofermentative and heterofermentative of LAB同型乳酸发酵 异型乳酸发酵相同 点均以碳水化合物为原料；产物中均含有乳酸；均需在无氧条件下进行；发酵过程中均净生成+2ATP。参与发酵的微双球菌、链球菌、德氏杆菌肠膜状明珠菌、甘露醇乳杆菌、生物种类保加利亚乳杆菌等短乳杆菌、双歧杆菌等关键酶磷酸果糖激酶、乳酸脱氢酶磷酸戊糖（或己糖）解酮酶发酵途径EMP途径PK、HK途径不过程途径葡萄糖一丙酮酸一乳酸葡萄糖一乳酸、乙醇等同点产物只含乳酸乳酸、乙醇、CO2等多种产物反应式C6Hl2O6+2ADP+2PiC6Hl2O6+2ADP+2Pi2cH3coeOOH+2ATPCH3COCOOH+CH3CH2OH+CO2+2ATP1.1.2.2乳酸菌代谢产物及分类乳酸菌作为食品和饲料储存的生物防腐剂已有悠久的历史，乳酸菌代谢产物 中的乳酸和蛋白类细菌素具有抑菌效果PL近年来，研究发现乳酸菌代谢产生的 一类小分子物质具有抗真菌能力，如苯甲酸、环状二肽、苯基乳酸、对羟基苯基 乳酸2町、异戊内酯、短链脂肪酸129、了_氨基丁酸等，这些代谢产物也可改善食品 风味、延长保质期。3浙江工商大学硕士学位论文1.1.2.3有机酸早在1780年，瑞典化学家Scheele在发酵的牛奶中发现了乳酸,Fermi在1881 年通过发酵方法获得了乳酸ML乳酸作为乳酸菌代谢的主要终产物，对食品的风 味、口感和防腐发挥着重要作用。近年来，乳酸菌代谢产生的乳酸、乙酸、苯基 乳酸、丙酸和丁酸等有机酸已广泛应用于新鲜农产品、果汁饮料、水产品及畜肉 制品的防腐保鲜卬-3刃。有机酸作为有效的抗菌物质，一方面是由于其水中溶解性 强，能有效发挥抗菌作用，另一方面，有机酸及其盐类可以控制食物的酸度和改 善风味34。此外，小分子有机酸具有低pH环境中抑菌性强、热稳定性好、抗过 氧化氢酶活性和抗蛋白酶活性等特点35,因此能够更好地应用于食品防腐。不同来源的乳酸菌代谢产生酸的能力各不相同。熊素玉等【36】通过培养24 h 测发酵上清液pH值来比较从马奶中筛选的15株乳酸菌的产酸能力，结果发现，产酸能力强的乳酸菌上清pH值小于4.0,产酸能力弱的乳酸菌pH值大于5.0。张董燕等37对2种不同源的罗伊氏乳酸杆菌产酸能力进行比较,发现两株菌的乳 酸产量分别为 1.361 mmol/L 和 1.182 mmol/Lo乳酸菌代谢产生的乙酸、苯基乳酸、己酸、丙酸等能有效地抑制酵母菌、霉 菌、细菌等有害微生物的生长。霉菌和酵母菌是食品和饲料中存在的腐败微生物，其产生的霉菌毒素尤为危害网。Gerez等网从95株乳酸菌种筛选出具有抗真菌 活性的四株菌，分别为 Lp/m3wwCRL778、Z.rewten CRL 1100 L.brevis CRL 772和心6evCRL796,主要代谢产生乙酸和苯乳酸，将含有乳酸菌的酵母发 酵剂用于面包的生产，结果发现：含有抗真菌乳酸菌的面包出现霉菌的时间延长 至5天，不添加抗真菌乳酸菌的面包在2天后就产生霉菌。Katrin等网从植物乳 杆菌MiLAB 393中分离纯化出具有抗烟曲霉等真菌的小分子物质苯基乳酸。Lavermicocca等叫利用分生孩子发芽实验从植物乳杆菌21B发酵上清液中发现 具有高效抑制黄曲霉、青霉菌、黑曲霉等多种真菌的有机酸物质，经色谱纯化和 物质鉴定，该抑菌物质为4-羟基-苯基乳酸和苯基乳酸，其中苯基乳酸产量高，抑菌效果好。Corsetti等网从乳杆菌sanfrancisco CB1上清液中分离得到乙酸、己 酸、甲酸、丙酸、丁酸和正戊酸六种有机酸，该混合物协同作用能抑制青霉菌，曲霉菌，念珠菌等真菌。大多数阳离子抗菌肽对霉菌和酵母菌没有抑制效果，与4浙江工商大学硕士学位论文之相比，小分子有机酸对有害真菌的抑制作用使其具有良好的开发和应用前景。1.1.2.4 细菌素1982年Konisly等网提出：细菌素是由微生物通过核糖体合成机制产生的一 类能够抑制或杀死其他微生物的蛋白质、多肽或前体多肽，对其产生菌无抑制作 用，具有安全、高效、无毒、耐酸、无抗药性等特点。多数乳酸菌细菌素仅能有 效抑制或杀死革兰氏阳性菌R3叫。目前国际上对细菌素的分类并没有统一标准，根据细菌素生理生化和结构的 特点，可将乳酸菌细菌素细分为四大类47则（表1-2）：表1-2乳酸菌细菌素的分类Table 1-2 The classification of LAB bacteriocins类 别名称特征亚类特征代表细菌素I羊毛硫含不常见、被转译修 饰过的羊毛硫氨基 酸小分子多肽，相对la螺旋状两性分子，含21-38 个氨基酸残基，带2-7个正 电荷；Nisin5。、Lacticin 481I 51kLacticin 3147设2、类细菌素分子量一般不大于5Pep 5153】；kDa,含有19-38个lb球形分子，不多于19个氨Mersacidinl54氨基酸基酸，不带电或带负电；小分子热稳定肽，抑制李斯Lacticin QI 55Ila特菌，具有N末端保守序Pediocin PA-ll56k由天然氨基酸组成，成环状，或含有硫酯 键，分子量不大于10 kDa,热稳定性好，歹力由37-48个氨基酸组成；Divergicin M3 5 叫II类非羊毛 硫细菌 素lib由两个氨基酸序列不同的 肽类寡聚体形成，双肽相互 作用才可发挥活性；Plantaricins EF158kPlantaricin JKf59KPlantaricin NC8叫Gassericin A.、Reuterin 6161；无翻译后加工过程He环肽，N-端和C-端相连；lid线型翻译后非修饰单肽，与 片球菌素类细菌素不同；Divergicin AI 62；ni类蛋白类 细菌素抑菌谱较窄，一般分Enterolysin A163k子量不小于30 kDa,/Helveticins JI 64不耐热HelveticinV-1829165!；TV复合细 菌素需蛋白质和碳水化IV类合物等物质才可发 挥活性/乳酸菌细菌素作为一种最具发展前途的天然防腐剂，可提高食品品质，缩短 食品灭菌时间，减少食品营养破坏，延长食品保质期等。目前，全世界已有60 5浙江工商大学硕士学位论文多个国家和地区将乳酸链球菌素添加到某些食品中作为食品防腐剂，如肉类、罐 头、乳制品、蔬菜和啤酒等。但其中只有Nisin 一种细菌素被商业化，由于其抑 菌谱窄，只能抑制部分革兰氏阳性菌，使应用范围受到了极大的限制【66】。1.1.2.5 胞外多糖20世纪40年代，Gronwall发现肠膜明串珠菌70ssemeseWewides）发酵生产右旋糖酎可作为代血浆的主要成分，此后，乳酸菌产生的胞外多糖引起 了全世界科学研究者的关注】。乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharide,EPS）是 乳酸菌在生长过程中分泌到细胞壁外的一类碳水化合物代谢物，包括粘液多糖和 荚膜多糖6叽荚膜多糖是指与细胞壁相结合的胞外多糖，粘液多糖是指释放到培 养基中的多糖。链球菌属，乳球菌属，乳杆菌属，明串珠菌属等乳酸菌均能产生 胞外多糖69-7（胞外多糖具有多种功效：（1）对细胞具有保护作用，抵抗不良环境因素如干 燥条件、抗生素或毒性物质的作用、渗透压作用等；（2）改善乳制品的组织状态,改善发酵乳流变学特性，减少乳清析出72;（3）改善菌株对肠道粘膜的吸附【74（4）抗肿瘤作用【74，对免疫系统的促进作用，降胆固醇、降血压作用75等。乳 酸菌胞外多糖已在发酵工业，如酸乳饮料、干酪、发酵奶油等工业加工中得以应 用，它不仅可以提高产品的质地、口感、风味，还能使食品产品的稳定性加强17%随着生物技术水平的提高，乳酸菌胞外多糖将在食品、医疗、酶技术、化妆品等 行业得到更广地应用。1.1.2.6 其他除了常见的有机酸、细菌素和胞外多糖外，乳酸菌代谢还能产生过氧化氢、脂肪酸的羟基衍生物、罗氏菌素等抑菌物质。过氧化氢是乳酸菌在有氧条件培养下，烟酰胺腺嗯吟二核昔酸（NADH）和 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase,SOD）作用产生的。当血红素不存在时,乳酸菌就不能产生过氧化氢酶，导致过氧化物的积累。过氧化物的抑菌作用与它 的强氧化性有关17刀。Pridmore等网从人体肠道中分离得到的约氏乳酸杆菌 NCC533分泌的H2O2能够体外抑制沙门氏菌。6浙江工商大学硕士学位论文二酮哌嗪类，是蛋白质降解的产物。目前，主要发现这类物质是利用一种多 功能酶通过非核糖体途径合成，也可以在酸或碱的环境中由肽形成。Yang等79 从泡菜中分离筛选得到一株植物乳杆菌AF1,该植物乳杆菌分泌的3,6-双（2.甲 苯基）-2,5-二酮哌嗪能有效抑制真菌的生长，抑菌活性是由于该物质中的环状成 分（亮氨酸-亮氨酸）的存在。一些乳酸菌代谢产生的2-羟基己烷和3.羟基-十七烷竣酸等这类物质属于脂 肪酸羟基衍生物。Sjogren等网研究发现植物乳杆菌MiLAB 14能产生几种具有 抑真菌作用的羟基化脂肪酸：3-羟基癸酸、3-羟基十二烷酸、3.羟基-十四烷和 3-羟基-5-顺式-十二烷酸。这些不饱和脂肪酸对多种霉菌和酵母菌有抑制作用，但由于脂肪酸类物质在水溶液中的溶解度较差，因此总抑菌活性较低。一些研究表明，罗伊氏乳杆菌对多种疾病有效，例如腹泻、绞痛I/。罗氏 菌素是一种罗伊氏乳杆菌在厌氧条件下由甘油转化为1,3-丙二醇的中间代谢产 物，当甘油过量时，罗伊氏乳杆菌分泌高水平的罗伊氏菌素。Chungs、Cleusix 侬等的研究证明罗伊氏素对细菌、病毒和真菌均具有生物活性，Arques等186的 研究也显示罗氏菌素可能作为一种食品添加剂，有效抑制有害微生物的生长。Morita等阳研究与罗伊氏菌素生产菌株单相关的无菌小鼠实验表明：罗伊氏乳杆 菌可以在小鼠体内产生罗氏菌素，表明体外抗菌活性发生在胃肠道中。1.2抑菌机理乳酸菌产生的代谢产物中，有机酸和乳酸菌素最能有效的抑制食物中致病菌 或腐败菌的生长，但这两类物质的抑菌范围和机制大不相同。1.2.1 有机酸的抑菌作用模式有机酸已被用作保存食品的手段之一，乙酸、丙酸、乳酸和山梨酸等在食品 防腐剂、农作物收获前后的保存中已有广泛应用MJ。研究显示，在肠道环境中产 生高浓度的乙酸、丙酸和丁酸，能够抑制肠环境中病原体的生长89-91。有机酸抑 菌机理主要包括有机酸改变细胞内外pH、影响细胞渗透压、影响细胞膜通透性、影响能量（ATP）代谢、抑制大分子合成、诱导抗菌肽的表达等作用机制【92】。7浙江工商大学硕士学位论文1.2.1.1 有机酸抑菌与细胞内外pH改变普遍认为有机酸抑制微生物生长的能力与pH有关93,质子（H+）浓度的增 加使pH值降低，使食品等处于低酸性环境而抑制细菌的生长。Ogawa等194研究 表明乳酸杆菌能有效抑制大肠埃希氏菌主要是由于其代谢产生的乳酸，导致pH 值的降低。有机酸可以带电荷或不带电荷，取决于酸性基团的质子化状态，而酸性基团 的质子化状态又由酸性基团的pKa和其周围环境的pH决定。不带电荷形式的有 机酸是脂质可渗透的（不同有机酸的亲脂性不同），因此可以自由扩散到微生物 细胞的细胞质中。当细胞内外不带电荷形式的酸浓度相等时，扩散达到了平衡。由于大多数嗜中性微生物的细胞质膜之间保持pH梯度，往往胞内比胞外碱性更 强，因此该有机酸在胞内解离得到质子（H+）和阴离子（A-）,使胞内pH降低,抑制细菌正常的代谢活动，也导致阴离子（A-）在细胞质中累积（参见图1-1）。在该过程中，细菌为保持自身pH稳定，通过主动运输的方式将胞内氢离子和营 养物质释放，导致ATP损耗，使细菌死亡9习。此外，不同种类的有机酸分子与细菌细胞相互作用，降低胞内pH值，也会 影响到细菌的正常代谢，从而达到抑菌效果9%图1-1细胞内外pH的变化mJFig.1-1 Changes of intracellular pH1.2.1.2 有机酸影响细胞膜通透性Young等网研究发现：用初始pH和摩尔浓度相同的柠檬酸、乳酸、乙酸处 8浙江工商大学硕士学位论文理单增李斯特菌，抑菌活性表现为：乙酸 乳酸 柠檬酸。因此推断细胞内 外pH的改变不是有机酸抑菌的唯一方式。细菌细胞外膜中的脂多糖成分能够阻止大分子蛋白、抗生素等物质进入细胞 内，小分子有机酸则可通过自由扩散或外膜孔道蛋白进入周质空间，可与细胞膜、细胞壁中的磷脂分子和脂多糖等成分相互作用，使脂多糖和外膜蛋白组分解离，破坏细胞外膜的完整性，导致细胞内容物流出，从而达到杀菌的效果。Alakomi 等物利用电泳检测发现，用乳酸处理鼠伤沙门氏菌S.Typhimurium SL699）细胞 后细胞外膜的脂多糖和甘油酰磷脂大量释放。12.1.3有机酸影响胞内渗透压当分子能够自由穿过细胞膜时口叫划,进入细胞内的有机酸分子在弱碱性环 境下解离，使酸根离子不断聚集，胞内渗透压升高。为平衡细胞内外渗透压，细 胞只能通过释放带负电荷的离子，比如微生物生长所必需的某些前体物质或辅助 因子等来降低过高的胞内渗透压，进而导致细菌的正常生长代谢遭到破坏口汛同时，有机酸胞内解离产生的质子（H+）通过膜转运蛋白泵运输至胞外，胞外钾离子（K+）进入胞内（如图1-2所示），该交换过程导致细菌跨膜质子动 力势能遭到破坏，胞内渗透压进一步增强，继而引起细菌细胞膜破裂，胞内物质 流出，最终导致细菌死亡 J。另有研究表明，细胞膜上的孔道蛋白转运有机酸,使胞内外有机酸分子达到平衡【96】。H+K+9999090990 WQ99999OT Extracellular杖X双）用 内&I ntracellularADP+Pi、ATP H+K+图1-2细胞内外H+和K+的运输【9刀Fig.1-2 I ntracellular and extracellular transport of H+and K+1.2.1.4有机酸影响大分子物质的合成有机酸的抑菌机理可能与抑制微生物的生理状态和所处的环境有关，影响细 9浙江工商大学硕士学位论文菌细胞壁、细胞质、新陈代谢等。有机酸可诱导宿主细胞产生抗菌肽，抗菌肽常 以破坏细菌细胞膜的方式达到杀菌或抑菌目的，具有安全、高效、无毒等特点”。工 OchoaZarzosai4等利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）发现用0.25 mmol/L 丁 酸钠诱导奶牛乳房上皮细胞（bMEC）后，防御素基因和支气管抗菌肽（TAP）的表达量比不处理的对照组提高2倍，当将丁酸钠浓度提高至0.5 mmol/L时，防御素基因和支气管抗菌肽（TAP）的表达量也增加至对照组的4倍。在细胞内，有机酸解离后产生大量的酸根离子破化会细胞内微环境的平衡，并通过遗传信息的传递影响后续生理生化特性，主要包括以下三种方式：（1）干 扰或阻断细胞核内DNA的合成，抑制细菌生长和增殖口。习；（2）酸环境的选择性 压力使细菌代谢相关基因出现差异性转录，导致代谢途径改变，从而降低葡萄糖 利用率，使细菌产能（ATP）受阻；（3）胞内有机酸通过使细菌代谢过程中所必 需的一些关键酶类钝化或变性，如过氧化氢酶口。叫导致细胞代谢活性受抑制，生长受阻口。1.2.2细菌素的抑菌作用模式乳酸菌细菌素可通过不同的作用机制来达到抑菌或杀菌的效果，通常其作用 目标是细胞膜口%存在着膜上的作用靶点，如磷脂双分子层、Lipid II、MraY 等其他未发现的作用位点。此外，还存在着细胞内的作用靶点。1.2.2.1 细菌素介导的杀菌机制（形成膜孔洞）由细菌素介导的抑菌过程包括细菌素吸附、附着、插入和膜渗透口%细菌 素被吸附到细菌的细胞表面，细菌素与细菌表面结构进行静电结合。在肽脂比例 低时，细菌素被结合并与脂双层平行。随着肽脂比例的不断升高，细菌素由平行 逐渐变为垂直，并向膜移动；当肽脂比例高时，细菌素分子垂直移动并直接插入 到磷脂双分子层中，形成跨膜孔洞。在这一变化过程中，可