拜赖青霉菌株47M-1的培...及其对芝麻枯萎病的防治效果_赵新贝.pdf

39(1)167-175 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2023 年 2 月 收稿日期：2022-09-07 基金项目：河南省农科院优秀青年科技基金（2022YQ04）；河南省博士后经费资助；财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系（CARS-14）；河南省科技攻关项目（222102110251）；河南省科技攻关项目（222102110277）作者简介：赵新贝，博士，助理研究员，E-mail：；*通信作者，博士，研究员，E-mail：。DOI:10.16409/ki.2095-039x.2023.02.005 拜赖青霉菌株47M-1的培养条件优化及其对芝麻枯萎病 的防治效果 赵新贝，赵 辉，倪云霞，刘新涛，何碧珀，贾 敏，张春艳，李永冬，赵世魁，刘红彦*（河南省农业科学院植物保护研究所/农业农村部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室/河南省农作物病虫害防治重点实验室/河南省生物农药工程研究中心/河南省作物保护国际联合实验室，郑州 450002）摘要：拜赖青霉 Penicillium bilaiae 47M-1 是具备广谱抑菌活性和促生能力的高效生防菌株，但其生物学特性、最佳培养条件及对芝麻病害的防治效果尚未见系统研究。本研究旨在明确拜赖青霉 47M-1 的生物学特性、最佳培养条件及病害防治效果。在明确菌株 47M-1 生物学特性的基础上，以芝麻枯萎病病原尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum 为靶标菌，通过单因素试验确定菌株 47M-1 的最佳培养条件，通过盆栽试验测定菌株的防病效果。试验结果表明，菌株 47M-1 在 25 28，pH 5.07.0，光周期中 016 h 光照的条件下菌丝生长最快；在 25 28，pH 3.010.0，光周期中 8 h 光照的条件下产孢量最大，该菌分生孢子的致死温度为 60。菌株 47M-1 最佳产抑菌活性物质的培养液配方为：蔗糖 30 g，酵母粉/牛肉膏/蛋白胨 5 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，蒸馏水 1000 mL。将菌株 47M-1 的孢子悬浮液按 2%或 3%接种至 pH 7.0 的 75125 mL 优化后的培养液中，在 25 27 的恒温摇床上培养 5 d 时，其发酵液抑菌活性最强。盆栽试验结果表明，菌株 47M-1 的孢子悬浮液及其发酵滤液 10 倍稀释液对芝麻枯萎病的防治效果均在 70%以上。拜赖青霉 47M-1 是具备良好防治效果的潜力生防菌，明确其生物学特性、最佳培养条件及病害防治效果，为该菌株抑菌活性物质的研究、菌剂生产和田间应用奠定了基础。关 键 词：拜赖青霉；芝麻枯萎病；生物学特性；培养条件优化；防治效果 中图分类号：S476 文献标识码：A 文章编号：1005-9261(2023)01-0167-09 Optimization of Culture Conditions of Penicillium bilaiae 47M-1 and Its Control Efficacy on Fusarium Wilt of Sesame ZHAO Xinbei,ZHAO Hui,NI Yunxia,LIU Xintao,HE Bipo,Jia Min,ZHANG Chunyan,Li Yongdong,ZHAO Shikui,LIU Hongyan*(Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Region of North China,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Henan Key Laboratory of Crop Pest Control/Biological Pesticides Engineering Research Center of Henan Province/International Joint Research Laboratory for Crop Protection of Henan,Zhengzhou 450002,China)Abstract:Penicillium bilaiae strain 47M-1 is a highly effective biocontrol strain with broad-spectrum inhibition activity and growth promotion ability,but its biological characteristics,optimum culture conditions and control efficacy on sesame diseases have not been systematically studied.The purpose of this study was to determine the biological characteristics,the optimum culture conditions and control efficacy of Penicillium bilaiae 47M-1.On the basis of identifying the biological characteristics of strain 47M-1,the optimum culture conditions of strain 47M-1 168 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 were obtained by single factor test with Fusarium oxysporum as target and the control efficacy was determined by pot test.The results showed that mycelium growth was fast under the conditions of 25-28,pH 5.0-7.0 and 016 h light in photoperiod,and sporulation was the high under the conditions of 25-28,pH 3.0-10.0 and 8 h light in photoperiod.Lethal temperature of conidia was 60 for 10 minutes.The optimal culture fluid for producing inhibition substances was as follows:sucrose 30 g,yeast powder/beef extract/peptone 5 g,KCl 0.5 g,MgSO47H2O 0.5 g,FeSO47H2O 0.01 g,distilled water 1000 mL.When 2%or 3%spore suspension were inoculated with 75-125 mL optimized culture fluid at pH 7.0,and cultured at 25-27 for 5 days on a constant temperature shaker,the inhibition activity of culture filtrate was the strongest.The results of pot experiment showed that the control efficacy of both spore suspension and 10-fold diluent of fermentation filtrate was more than 70%against sesame Fusarium wilt.Penicillium bilaiae 47M-1 showed excellent potential for biocontrol.The results will lay a foundation for the study of inhibition substances,production of biocontrol agent and application in field.Key words:Penicillium bilaiae;sesame Fusarium wilt;biological characteristics;optimization of culture conditions;control efficacy 芝麻枯萎病是由尖孢镰刀菌侵染引起的、世界范围内普遍发生的土传病害，严重危害芝麻生产。目前对芝麻枯萎病的防治主要依赖化学药剂，但长期大量施用化学药剂，易造成环境污染和食品安全问题，生物防治对人畜安全、环境友好，是植物病害绿色防治的重要手段之一。长期的生物防治研究为作物病害的防治积累了大量的真菌类资源，青霉菌是病害防治的重要生防资源之一，1995 年曾金凤1首次报道了青霉菌株 Z88 可防治水稻纹枯病，之后许多具备生防价值的青霉菌株逐步进入了人们的视野。青霉菌在枯萎病等土传病害防治中颇具潜力，青霉属中指状青霉 Penicillium digitatum、草酸青霉 P.oxalicum、灰黄青霉 P.griseofulvum 和意大利青霉 P.italicum 等均对作物土传病害具有防治潜力2-5，且生防青霉菌常具备广谱抑菌活性，如草酸青霉菌株 A1 对尖孢镰刀菌 Fusarium oxysporum、串珠镰刀菌 F.moniliforme、层出镰刀菌 F.proliferatum 和茄病镰刀菌 F.solani 的抑菌活性均在 50%以上3；灰黄青霉 P.griseofulvum 菌株 HF3 对由尖孢镰刀菌、立枯丝核菌 Rhizoctonia solani、大丽轮枝菌 Verticillium dahliae 及草莓疫霉 Phytophthora fragariae 等 20 多种土传病原菌复合侵染导致的草莓根腐病的防治效果可达 53%4。青霉菌可通过空间位点竞争、营养竞争、抗生作用、重寄生和诱导抗病性等多种方式达到病害防控目的，其中产生抑菌活性代谢产物是青霉菌拮抗病原微生物的重要方式之一，从青霉菌中分离到大量抑菌活性物质，如化合物 Sch642305、没药烷型倍半萜 PAC1 和异香豆素类化合物 PS1 均表现良好的植物病原菌抑制能力6-8。本课题以芝麻枯萎病病原菌尖孢镰刀菌为靶标菌，从植物根际土壤中分离筛选到一株拜赖青霉 P.bilaiae 菌株 47M-1。拜赖青霉因其高效的促生能力备受关注，其对小麦、豌豆、油菜、苜蓿和扁小豆等多种作物具有促生作用9-14。拜赖青霉在植物病害防治方面的研究相对较少，据文献报道，拜赖青霉菌株JLF6-2 对水稻纹枯病菌 R.solani 具有较好的抑制作用15，拜赖青霉菌株 ACCC 30440 的发酵液可抑制尖孢镰刀菌与大丽轮枝菌的生长16。本课题在前期研究中发现，拜赖青霉菌株 47M-1 兼具广谱抑菌活性、诱导抗性、良好的促生能力和芝麻根部土壤定殖能力17，本研究旨在明确拜赖青霉菌株 47M-1 的生物学特性、产抑菌活性物质的最佳培养条件，评估其对芝麻枯萎病的防治效果，为该菌抑菌活性物质的研究、菌剂生产和田间应用提供科学依据。1 材料与方法 1.1 供试培养基 PDA 培养基配方：去皮马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 1520 g，蒸馏水 1000 mL。查氏琼脂培养基（CA）、查氏酵母膏琼脂培养基（CYA）、麦芽汁琼脂培养基（MEA）和 25%甘油硝酸盐琼脂培养基（G25N）配方参照中国真菌志18。PDB、CB、CYB、MEB 和 G25NB 分别为不加琼脂的 PDA、CA、CYA、MEA 和 G25N 培养基。第 1 期 赵新贝等：拜赖青霉菌株 47M-1 的培养条件优化及其对芝麻枯萎病的防治效果 169 1.2 拜赖青霉菌株 47M-1 的生物学特性测定 1.2.1 分生孢子悬浮液制备 将菌株 47M-1 接种到 PDA 平板上培养 5 d，用 0.05%的吐温 80 溶液洗脱孢子，使用血球计数板计数孢子量，并调整孢子浓度，孢子悬浮液的试验浓度为 1108孢子/mL。1.2.2 温度对菌株 47M-1 菌丝生长和产分生孢子的影响 将菌株 47M-1 的菌饼接种到 PDA 平板上，分别放置于 4、20、25、28、30、35 和 40 的恒温培养箱内黑暗倒置培养 7 d，用十字交叉法测量菌落直径，并用打孔器（直径 6 mm）从菌落中心到边缘等距离取 3 个菌饼，置于装有 1 mL 0.05%吐温 80 溶液的 2 mL 离心管中，在漩涡振荡器上振荡 1 min，稀释 10 倍或 100 倍，用血球计数板计数孢子量。1.2.3 pH 对菌株 47M-1 菌丝生长和产分生孢子影响 使用 3 mol/L 的 HCl 和 NaOH 将 PDA 培养基的 pH调节为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和 11.0 后分别制备平板，在平板中央接种菌株 47M-1的菌饼，25 黑暗倒置培养 7 d 后测定菌落直径和孢子量，菌落直径和孢子量测定方法参照 1.2.2。1.2.4 光周期对菌株 47M-1 菌丝生长和分生孢子影响 将菌株 47M-1 接种到 PDA 平板上，分别放置在 0、8、12、16 和 24 h 光照的培养箱中倒置培养 7 d 后测定菌落直径和孢子量，菌落直径和孢子量测定方法参照 1.2.2。1.2.5 菌株 47M-1 的致死温度 将孢子悬浮液的浓度调整为 2103孢子/mL，将孢子悬浮液分装至 2 mL离心管中，每管 1 mL，分别将离心管置于 45、50、55、60 和 65 的恒温水浴中处理 10 min，每处理取 100 L 涂布 PDA 平板，48 h 时统计平板菌落数，平板无菌落的处理温度即为致死温度。1.3 拜赖青霉菌株 47M-1 培养条件的优化 1.3.1 不同培养液抑菌活性的测定 将菌株 47M-1 的孢子悬浮液按 3%接种到 CB、CYB、G25NB、MEB和 PDB 中，25、160 r/min 培养 6 d 时，取发酵液过 0.22 m 滤膜除菌收集滤液，将发酵滤液和 PDA 培养基 1:4 混匀制备含药平板，以未添加发酵滤液的 PDA 平板作为对照，在平板中央接种尖孢镰刀菌菌饼（直径 6 mm），将平板倒置于 25 培养 7 d 后，以十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。另外，分别将菌株47M-1 与尖孢镰刀菌接种到 CA、CYA、G25N、MEA 和 PDA 培养基平板的对称位置，以只接种尖孢镰刀菌的平板作为对照，观察共培养平板中菌株 47M-1 对尖孢镰刀菌的抑制作用，以及单培养中尖孢镰刀菌的生长情况。抑制率（%）（对照菌落直径处理菌落直径）/（对照菌落直径菌饼直径）100。1.3.2 CYB 去单成分发酵滤液的抑菌活性 配制 CYB 培养液和分别去除 CYB 配方中单个成分的培养液，分别为-酵母膏（-Yeast extract）、-蔗糖（-Sucrose）、-NaNO3、-MgSO4、-KCl、-FeSO4和-K2HPO4培养液，将菌株 47M-1 的孢子悬浮液按 3%接种到 100 mL 各培养液中，25、160 r/min 培养 6 d 时，以含药平板法测定发酵滤液 5 倍稀释液的抑菌活性，计算抑制率。1.3.3 CYB 去两成分发酵滤液的抑菌活性 分别配制CYB 培养液、CYB 中去除NaNO3的培养液（-NaNO3）、CYB 中去除 K2HPO4的培养液（-K2HPO4）和 CYB 中同时去除 NaNO3和 K2HPO4的培养液（-NaNO3-K2HPO4），将菌株 47M-1 的孢子悬浮液按 1%接种到 4 种培养液中，25、160 r/min 培养 6 d 时，以含药平板法测定发酵滤液 5 倍稀释液的抑菌活性，计算抑制率。1.3.4 碳源和氮源单因素优化 CYB 培养液配方中去除 NaNO3和 K2HPO4后，作为基础培养液，分别以3%葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、丙三醇、甘露醇和山梨醇替换基础培养液中的碳源。将菌株 47M-1 的孢子悬浮液按 1%接种到培养液中，25、160 r/min 培养 6 d 时，以含药平板法测定发酵滤液 5 倍稀释液的抑菌活性，计算抑制率，以抑菌活性最强时的碳源为基础，分别以 0.5%酵母粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、黄豆粉、鱼粉、NaNO3、KNO3、NH4NO3、(NH4)2HPO4和(NH4)2SO4替换基础培养基中的氮源，筛选产抑菌活性物质的最佳氮源。1.3.5 摇床培养条件的优化 使用单因素法依次对液体培养的接种量、初始 pH、装液量、培养温度和培养时间进行优化，接种量分别设为 1%、2%、3%、4%、5%、6%和 7%，将培养液的初始 pH 分别调节为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和 11.0，摇瓶培养液的装液量分别设置为 50、75、100、125、150、175 和 200 mL，培养温度分别设置为 20、23、25、27、30、35 和 40，将发酵液过 0.22 m 滤膜，收集滤液，以牛津杯法测定发酵滤液的抑菌活性，分别在接种后 1、2、3、4、5、6和 8 d 取样，并以含药平板法测定不同时间点发酵滤液 10 倍稀释液对尖孢镰刀菌的抑菌活性，计算抑制率，170 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 明确最佳培养时间。1.3.6 菌株 47M-1 及其发酵滤液对芝麻枯萎病的防治效果 芝麻种子（商芝 158）经 2%NaClO 表面消毒15 min，以无菌水冲洗 3 遍后室温晾干，备用。将 121 高压灭菌 120 min 的大田土壤和草炭土按 3:1 混匀，然后将尖孢镰刀菌孢子悬浮液均匀拌入其中，使土中尖孢镰刀菌分生孢子的终浓度为 2.5105孢子/mL，将菌土分装入营养钵，分别将 50 mL 的无菌水（A）、发酵滤液原液（B）、发酵滤液 5 倍稀释液（C）、发酵滤液 10 倍稀释液（D）、1107孢子/mL 孢子悬浮液（E）、1108孢子/mL 孢子悬浮液（F）、1109孢子/mL 孢子悬浮液（G）、多菌灵 500 倍稀释液（H）和无菌水（I）灌入营养钵，灌土处理 3 d 后，在 A组的营养钵中点播经发酵滤液原液浸种 1 h 的芝麻种子，在其他处理组点播表面消毒的芝麻种子，待芝麻出苗 3 d 时，按照上述方法再进行 1 次灌根处理，每处理组 6 盆，重复 3 次，将育苗盘置于恒温培养箱（30 光照 16 h/28 黑暗 8 h）中培养，待对照组（I）充分发病时，按照仇存璞等19的苗期芝麻枯萎病分级标准调查病害严重度，分别按照公式 2 和 3 计算病情指数和病害防治效果。病情指数（病级数该病级植株数）/（最大病级数植株总株数）100，防治效果（%）（对照组病情指数处理组病情指数）/对照病情指数100。1.4 数据统计与分析 使用 SPSS 17.0 软件对试验数据进行描述性统计及方差齐性检测，并采用 Duncans 新复极差法进行显著性分析，利用 GraphPad Prism 9.0 软件作图，图中不同小写字母代表同一系列不同处理间在 P0.05 水平上存在显著差异。2 结果与分析 2.1 拜赖青霉 47M-1 的生物学特性 2.1.1 温度、pH 和光周期对菌株 47M-1 菌丝生长和产分生孢子影响 测定不同温度、pH 和光照时间下菌株 47M-1 的菌落生长直径，由结果可知，在培养温度为 25 和 28 时，菌株 47M-1 菌丝生长较快，且菌落直径无显著差异，在 20 和 30 培养时，菌落直径显著降低，4 和 40 条件下培养 7 d 时，菌落未见扩展（图 1A）；当培养基 pH 在 5.07.0 之间时，菌株 47M-1 的菌丝生长较快，且无显著差异，当培养基 pH 为 2.0 和 3.0 时，菌丝生长受到显著的抑制（图 1B）；当光照时间从 0 h 增加至 16 h 时，菌落直径无显著差异，而当光照时间为 24 h 时，菌落直径显著降低（图 1C）。结果表明，最佳菌丝生长条件为 25 28、pH 5.07.0 和光周期中 016 h 光照。010203040dcaabcd15202530cbaaaab22242630aaaab温度 Temperature()0246810ddca abc7.07.58.08.59.09.5caaaaaaaab8.08.59.09.510.0babbbAabababab28010203040500246810120510152025010203040500246810120510152025pH value光照时间 Illumination time(h)Log10（产孢量 Sporulation quantity+1）菌落直径 Colony diameter(mm)BCDEF 图 1 不同温度、pH 和光照时间下菌株 47M-1 菌落的生长直径（A，B，C）和产孢量（D，E，F）Fig.1 Colony diameters(A,B,C)and sporulation quantity(D,E,F)of strain 47M-1 at different temperatures,pH and illumination time 第 1 期 赵新贝等：拜赖青霉菌株 47M-1 的培养条件优化及其对芝麻枯萎病的防治效果 171 测定不同温度、pH 和光照时间下菌株 47M-1 的产孢量，由结果可知，在 25 和 28 培养时产孢量较大，且无显著差异，在 20 和 30 培养时，产孢量显著下降（图 1D）。当 pH 在 3.010.0 之间时，产孢量无明显的差异，当 pH 为 2.0 或 11.0 时，产孢量显著下降（图 1E）。光周期中光照 8 h 时产孢量最大（图 1 F）。结果表明，最佳产分生孢子的条件为 25 28、pH 3.010.0 和光周期中 8 h 光照。2.1.2 菌株 47M-1 的致死温度 由图 2 可知，菌株 47M-1 分生孢子的致死率随着温度的升高而升高，在55 水浴 10 min 时，菌株 47M-1 分生孢子的致死率显著升高，达 95.3%，在 60 水浴 10 min 时，致死率达到 100%，即菌株 47M-1 的致死温度为 60 10 min。4550556065020406080100aaabc温度 Temperature()图 2 菌株 47M-1 的致死温度 Fig.2 Lethal temperature of strain 47M-1 2.2 拜赖青霉菌株 47M-1 培养条件的优化 2.2.1 不同培养液的抑菌活性 对不同培养液抑菌活性测定的结果表明，菌株 PDB 发酵滤液对尖孢镰刀菌的抑菌活性最强，为 76.7%（图 3A），在 PDA 平板共培养中也产生了明显的抑菌圈（图 3B）。菌株 47M-1的 CYB 发酵滤液完全无抑菌活性（图 3A），但在 CYA 平板共培养中对尖孢镰刀菌有抑制作用（图 3B）。抑制率 Inhibition rate(%)图 3 不同培养液培养后发酵滤液的抑菌活性（A）及相应固体培养基共培养平板上的抑菌特征（B）Fig.3 Inhibition activity of fermentation filtrate in different culture fluid(A)and the inhibition characteristics in the corresponding solid co-culture plates(B)172 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 2.2.2 去单成分 CYB 发酵滤液的抑菌活性 为了分析 CYA 平板共培养和 CYB 发酵滤液抑菌活性不一致的原因，分别配制去除 CYB 配方中单个成分的培养液，测定去单成分后各个配方发酵滤液的抑菌活性。由图 4 可知，CYB 去除 NaNO3的发酵滤液（-NaNO3）对尖孢镰刀菌的抑制率达到 100%，去 K2HPO4的发酵滤液（-K2HPO4）对尖孢镰刀菌的抑菌率可达 80%，均显著高于去除其他成分的发酵滤液的抑菌活性。020406080100ecfadccb成分 Component-20 图 4 CYB 去单成分后发酵滤液的抑菌活性 Fig.4 Inhibition activity of fermentation filtrate of CYB removing single component 2.2.3 去两成分 CYB 发酵滤液的抑菌活性 由图 5 可知，从 CYB 中同时去除 NaNO3和 K2HPO4时，相比单独去 NaNO3或 K2HPO4，其发酵滤液的抑菌活性显著增强。抑制率 Inhibition rate(%)图 5 菌株 CYB 去成分后发酵滤液的抑菌活性 Fig.5 Inhibition activity of fermentation filtrate of CYB removing different component 2.2.4 碳源和氮源单因素优化 以 CYB 配方中去除 K2HPO4和 NaNO3作为基础培养液进行碳氮源优化。碳源优化结果表明，菌株 47M-1 可利用 9 种碳源产生抑菌活性物质，以蔗糖为碳源时，发酵滤液的抑菌活性最强（图 6A）。氮源优化结果表明，菌株 47M-1 可利用供试 11 种氮源中的 9 种氮源产生抑菌活性物质，其中酵母粉、牛肉膏或蛋白胨作为氮源时，发酵滤液的抑菌活性较强，且无显著差异（图 6B）。依据碳氮源优化结果，确定最佳产抑菌活性物质的培养液的配方为：蔗糖 30 g，酵母粉/牛肉膏/蛋白胨 5 g，KCl 0.5 g，MgSO47H2O 0.5 g，FeSO47H2O 0.01 g，蒸馏水 1000 mL。2.2.5 菌株 47M-1 摇床培养条件的优化 由摇床培养条件优化结果（图 7）可知，随着接种量、pH、装液量、培养温度和培养时间的增加，发酵滤液的抑菌圈均呈现先增大再减小的趋势，当接种量为 2%和 3%、第 1 期 赵新贝等：拜赖青霉菌株 47M-1 的培养条件优化及其对芝麻枯萎病的防治效果 173 初始 pH 为 7.0、装液量为 75125 mL、温度为 25 27 时，发酵滤液的抑菌活性最强。测定不同培养时间时发酵滤液的抑菌活性结果表明，在培养 4 d 时，发酵滤液 10 倍稀释液对尖孢镰刀菌的抑制率为92.5%；培养 5 d 时，抑制率达到 100%。抑制率 Inhibition rate(%)葡萄糖 Glucose蔗糖 Sucrose乳糖 Lactose果糖 Fructose麦芽糖 Maltose可溶性淀粉Soluble starch丙三醇 Glycerol甘露醇 Mannitol山梨醇 Sorbitol无碳源Carbon-free酵母膏 Yeast extract酵母粉Yeast extract powder牛肉膏 Beef extract鱼粉 Fish flour蛋白胨 Peptone黄豆粉Soybean mealNaNO3(NH4)2HPO4KNO3NH4NO3(NH4)2SO4无氮 Nitrogen-free抑制率 Inhibition rate(%)图 6 碳源（A）和氮源（B）对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.6 Effects of carbon sources(A)and nitrogen sources(B)on inhibition activity of fermentation filtrate 接种量 Inoculation quantity(mL)02468303234363840daabbcbccd01020304050ecdbc bbaddbcdAbcd036912pH value抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)B装液量 Culture fluid volume(mL)抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)363840424446baaabcdd152530354045cbaaabcc020406080100aabcdea202530354001234567850100150200温度 Temperature()时间 Time(d)抑制率 Inhibition rate(%)抑菌圈直径Diameter of inhibition zone(mm)CDE 图 7 接种量（A）、初始 pH（B）、装液量（C）、温度（D）和发酵时间（E）对发酵滤液抑菌活性的影响 Fig.7 Effects of inoculation quantity(A),initial pH(B),volume of culture fluid(C),temperature(D)and fermentation time(E)on inhibition activity of fermentation filtrate 2.2.6 菌株 47M-1 及其发酵滤液对芝麻枯萎病的防治效果 由图 8 可知，浸种处理、发酵滤液和孢子悬浮液土壤处理，对芝麻枯萎病均具有防治效果。浸种处理对芝麻枯萎病防效稍差，防效仅 39.1%；发酵滤液的防治效果随浓度降低而升高，发酵滤液 10 倍稀释液的防效最高，为 70.3%；孢子悬浮液的防治效果随浓度升高而升高，当孢子悬浮液浓度为 1108和 1109孢子/mL 时，防治效果分别为 85.9%和 87.9%，两者无显著差异。174 中 国 生 物 防 治 学 报 第 39 卷 ABCDEFGH020406080100处理 Treatmentccbcbcbcababa A：浸种 Soaking seed；B：发酵滤液原液 Fermentation filtrate；C：发酵滤液 5 倍稀释液 5-fold dilution of fermentation filtrate；D：发酵滤液 10 倍稀释液 10-fold dilution of fermentation filtrate；E：1107孢子/mL 孢子悬浮液 1107 spore/mL suspension；F：1108孢子/mL 悬浮液 1108 spore/mL suspension；G：1109孢子/mL 悬浮液 1109 spore/mL suspension；H：多菌灵 500 倍稀释液 500-fold dilution of carbendazim.图 8 菌株 47M-1 及其发酵滤液对芝麻枯萎病的防治效果 Fig.8 Control efficacies of strain 47M-1 and its fermentation filtrate on sesame Fusarium wilt 3 讨论 拜赖青霉是优良的促生菌株，且对多种植物病原菌有拮抗作用，通过对拜赖青霉菌株 47M-1 的生物学特性研究发现，该菌在 20 35、pH 2.011.0 和各种光周期中均可生长和产孢，表明该菌对温度、pH 和光照的适应范围较广，菌株 47M-1 分离自土壤，且对碳源利用的差异较小，易于培养，产孢量高，使它能够在不同生态条件下生存和繁殖，利于其施用后在田间的存活和扩展。培养基的成分对生防菌发酵液中抑菌活性物质的积累至关重要，有时抑菌活性物质的积累反而被培养基中某些成分抑制。本研究发现，CYB 发酵滤液对尖孢镰刀菌无抑菌活性，而去掉 CYB 配方中的 NaNO3或 K2HPO4后，发酵滤液对尖孢镰刀菌有强烈的抑制作用，即 NaNO3或 K2HPO4的存在抑制了抑菌活性物质的产生。CYB 培养液去两成分试验结果表明，当从培养液配方中同时去掉 NaNO3和 K2HPO4时，发酵滤液的抑菌活性较单独去掉 NaNO3或 K2HPO4时有显著提高，即 NaNO3和 K2HPO4对抑菌活性物质的产生有协同抑制作用，对两者协同作用的分子机制有待进一步研究。培养基中碳源和氮源的种类常对次生代谢产物的合成有显著影响20，文献报道显示，以蔗糖为碳源时，蝉拟青霉 Paecilomyces cicadae 多糖产量最高21，以蛋白胨为氮源时，有利于草酸青霉 XC70 发酵液中木聚糖酶的积累22，本研究中以蔗糖为碳源，以酵母粉、牛肉膏或蛋白胨为氮源时，拜赖青霉菌株 47M-1 发酵滤液对尖孢镰刀菌的抑菌活性最强。此外，当以氨态氮（NH4+）为氮源时，发酵滤液抑菌活性达 60%，而以硝态氮（NO3-）作为氮源时，菌株 47M-1 的发酵滤液完全无抑菌活性，即菌株 47M-1 只能利用无机氮中的氨态氮产生抑菌活性物质。菌株 47M-1 在优化后的培养液中培养 4 d 时，发酵滤液 10 倍稀释液对尖孢镰刀菌生长的抑制率达到 92.5%，在 PDB 中培养 6 d 时，其发酵滤液 5 倍稀释液的抑菌活性仅 76.7%，即通过培养基优化，加速了抑菌活性代谢物的积累。培养条件优化可通过改变接种量、初始 pH、装液量、培养时间和培养温度等来强化微生物的生物合成过程，以提高抑菌代谢物的产量23,24；南楠等25研究发现，初始 pH 和装液量等是影响枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WL17 发酵产物抑菌活性的关键因子；王琢26通过单因素优化和响应曲面设计，使枯草芽孢杆菌 Hitwh-B05 菌株的发酵上清液对寄生曲霉的抑制能力大幅度提高。本研究发现，接种量、初始 pH、装液量、培养温度和培养时间均可显著影响菌株 47M-1 培养滤液的抑菌活性。在盆栽试验中，以拜赖青霉菌株 47M-1 的发酵滤液和孢子悬浮液进行土壤处理，均对芝麻枯萎病有防治效果，尤其是其发酵滤液 10 倍稀释液和浓度 1108孢子/mL 以上悬浮液的防效较好，另外，孢子悬浮液的防效显著优于发酵滤液，可能是因为孢子悬浮液处理后，菌株 47M-1 通过包括营养竞争、占据生态位点、产生拮抗物质和诱导抗病性等多种机制对病原菌形成了持续的抑制作用17，而发酵滤液只是在短期内第 1 期 赵新贝等：拜赖青霉菌株 47M-1 的培养条件优化及其对芝麻枯萎病的防治效果 175 抑制了病原菌的生长。菌株 47M-1 兼具广谱性和高效性，且菌株 47M-1 分离自土壤，产孢量高，对环境的适应能力强，使其具有开发为商品化制剂的巨大潜力。本研究明确了拜赖青霉菌株 47M-1 的生物学特性和最佳培养条件，并通过培养液优化加快了抑菌活性代谢物的积累，对进一步开展菌株 47M-1 抑菌活性物质研究、制剂研制和田间应用具有重要指导意义。参 考 文 献 1 曾金凤.青霉 Z88 菌株对水稻纹枯病菌的抗生作用J.福建农业大学学报,1995,24(2):180-183.2 Hamdi N B,Salem I B,Hamdi M.Evaluation of the efficiency of Trichoderma,Penicillium,and Aspergillus species as biological control agents against four soil-borne fungi of melon and watermelonJ.Egyptian Journal of Biological Pest Control,2018,28(1):25