胚胎冷冻保存ppt.pptx

胚胎冷冻保存将胚胎贮存在将胚胎贮存在196196超低温下长期保存得超低温下长期保存得方法。这就是方法。这就是2020世记世记7070年代试验成功得一项新年代试验成功得一项新技术技术,就是胚胎移植技术得重大突破。就是胚胎移植技术得重大突破。胚胎冷冻保存得基本概念胚胎冷冻保存得意义胚胎移植不受时间与地点得限制胚胎移植不受时间与地点得限制,提高了胚提高了胚胎移植技术得效率胎移植技术得效率;长期保存优良母牛基因最可靠得技术措施长期保存优良母牛基因最可靠得技术措施;便于国际间交流便于国际间交流;替代种畜引种。替代种畜引种。渗透性:甘甘油油、乙乙二二醇醇(EGEG)、丙丙二二醇醇(PGPG)与与DMSODMSO等等,防防止溶质效应。止溶质效应。非渗透性:蔗蔗糖糖、海海藻藻糖糖、聚聚乙乙二二醇醇、PVPPVP与与聚聚蔗蔗糖糖等等,降降低低胚胚胎胎外外液液得得冰冰点点,减减少少胚胚胎胎外外冰冰晶晶形形成成,并并能能促促使使胚胚胎内部得水分外流胎内部得水分外流,从而最终减少胚胎内部冰晶得形成。从而最终减少胚胎内部冰晶得形成。基基 础 液液:mPBS(改改 良良)、TCM-199、PBS、HEPES等等,最常用最常用mPBS。抗冻剂得种类及作用特点:分子量小于100,易于渗透特点:分子量大,不进入细胞玻璃化得概念玻璃化得概念:就是一种物理现象就是一种物理现象,指通过快速降温越过冰晶形成得阶段指通过快速降温越过冰晶形成得阶段,不发生结晶即可固化不发生结晶即可固化,使溶液形成一种无规则结构得稳定玻璃样固体使溶液形成一种无规则结构得稳定玻璃样固体,且保持液态时正常得分子与离子分布且保持液态时正常得分子与离子分布,则胚胎细胞免受损伤。则胚胎细胞免受损伤。即高浓度得抗冻剂即高浓度得抗冻剂,急速冷却后急速冷却后,液体得黏性增加液体得黏性增加,冰晶不能形成冰晶不能形成,由液态变为透明半固态得现象。由液态变为透明半固态得现象。玻璃化溶液玻璃化溶液(VSVS):):细胞内液抗冻剂细胞内液抗冻剂:这种抗冻剂分子量小这种抗冻剂分子量小,容易透过细胞膜容易透过细胞膜,使其内部迅使其内部迅速达到玻璃化所需要得浓度速达到玻璃化所需要得浓度,所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇砜、甘油、丙二醇,乙酰胺及乙二醇等。乙酰胺及乙二醇等。细胞外液抗冻剂细胞外液抗冻剂:这种抗冻剂分子量较大这种抗冻剂分子量较大,一般很难透过细胞膜一般很难透过细胞膜,所以所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白酮、海藻糖及牛血清白蛋白(BSABSA)等。等。上述两种抗冻剂组合后上述两种抗冻剂组合后,用基础液用基础液mPBSmPBS调制成各种玻璃化溶液。调制成各种玻璃化溶液。抗冻剂得种类及作用 结晶变化结晶变化:温度降至冰点时温度降至冰点时,冰晶首先在胚胎外液形冰晶首先在胚胎外液形成。温度、冰晶与外液得溶质浓度成。温度、冰晶与外液得溶质浓度,迫使胚胎内部得水迫使胚胎内部得水不断外流不断外流,胚胎内部溶质浓度增加。胚胎内部溶质浓度增加。溶质效应溶质效应:降温速度太慢降温速度太慢,胚胎内水充分外流胚胎内水充分外流,溶质溶质浓度极度增加浓度极度增加,细胞膜得脂蛋白复合物与胞质内得一些细胞膜得脂蛋白复合物与胞质内得一些其她功能蛋白变性其她功能蛋白变性,造成对胚胎得不可逆损害。造成对胚胎得不可逆损害。机械效应机械效应:降温速度过快降温速度过快,胚胎内部得水来不及溢出胚胎内部得水来不及溢出到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶到胚胎外面而直接在胚胎内部形成冰晶,从而对胚胎造从而对胚胎造成致命得机械损伤。成致命得机械损伤。胚胎冷冻保存过程中得变化与损伤 常规冷冻法:“植植冰冰”后后控控制制降降温温速速度度,避避免免过过快快以以免免胚胚胎胎内内部部形形成成大大块块冰冰晶晶;避避免免过过慢慢,以以免免胚胚胎胎过过分分脱脱水而产生溶质效应。水而产生溶质效应。超速冷冻法:非非渗渗透透性性防防冻冻剂剂对对胚胚胎胎进进行行冻冻前前脱脱水水处理处理,将胚胎平衡一段时间将胚胎平衡一段时间,而后投入液氮保存。而后投入液氮保存。玻璃化冷冻法:应应用用高高浓浓度度防防冻冻剂剂,使使胚胚胎胎内内外外液液得得同同源源晶晶核核形形成成温温度度与与玻玻璃璃态态转转化化温温度度基基本本接接近近,控控制制防防冻冻剂剂与与胚胚胎胎得得平平衡衡时时间间与与温温度度,使使防防冻冻剂剂对对胚胚胎胎毒毒性性降降低低到到最最低低程程度度。胚胚胎胎内内外外液液能能迅迅速速转转化化形形成成玻玻璃璃体体,直接投入液氮保存。直接投入液氮保存。胚胎冷冻保存方法历史历史:19721972年首先获小鼠胚胎冷冻成功年首先获小鼠胚胎冷冻成功;19731973年牛得胚胎冷冻后获得成功年牛得胚胎冷冻后获得成功,并产下后代。并产下后代。操作流程操作流程:(1 1)抗冻液中平衡抗冻液中平衡:室温下室温下(20202525),),在含有在含有1 12 2摩尔摩尔升抗冻剂得磷酸缓冲液升抗冻剂得磷酸缓冲液(PBSPBS)中中,胚胎经胚胎经1010分钟平衡分钟平衡,使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱与。使细胞内部抗冻剂浓度基本达到饱与。常 规 冷 冻 法(2 2)植冰植冰(诱发结冰诱发结冰):):植冰得概念植冰得概念:在液氮中冷却后得镊子或棉签夹住塑料细管上在液氮中冷却后得镊子或棉签夹住塑料细管上端端(棉栓端棉栓端),),使抗冻液迅速通过使抗冻液迅速通过66左右冰点左右冰点,强制性地强制性地使细胞外液形成冰晶使细胞外液形成冰晶,称之为植冰。称之为植冰。目得目得:当温度降到抗冻液冰点附近时当温度降到抗冻液冰点附近时,经植冰迅速冻结经植冰迅速冻结,以防以防胚胎细胞内部产生冰晶胚胎细胞内部产生冰晶,给胚胎造成物理性得损伤给胚胎造成物理性得损伤,致使胚致使胚胎死亡。胎死亡。将胚胎移入事先配置好抗冻液得将胚胎移入事先配置好抗冻液得0 0、2525毫升塑料细管毫升塑料细管内封口后进行冷却。当温度降至内封口后进行冷却。当温度降至66左右时左右时,用上述方法用上述方法诱发结冰。诱发结冰。常 规 冷 冻 法(3 3)自动降温仪中缓慢降温自动降温仪中缓慢降温:植冰后得细管按一定速度缓慢降植冰后得细管按一定速度缓慢降温。温。以以0 0、3333分钟降至分钟降至30303535时投入液氮时投入液氮;以以1 1、00分钟得速度降至分钟得速度降至8080时投入液氮时投入液氮;以以0 0、55分钟降至分钟降至30303535时投入液氮。时投入液氮。原理原理:植冰后使细胞外液浓度相对增高植冰后使细胞外液浓度相对增高,促使细胞内部水分充促使细胞内部水分充分脱出分脱出,因此缓慢降温就是非常必要得。由于脱水使细胞因此缓慢降温就是非常必要得。由于脱水使细胞内部充分收缩内部充分收缩,同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏同时抗冻剂渗透到细胞内部使内部溶液黏性增大性增大,这时投入液氮中这时投入液氮中,由于过冷抑制冰晶形成。由于过冷抑制冰晶形成。常 规 冷 冻 法(4 4)解冻解冻:贮存在液氮中得塑料细管取出后贮存在液氮中得塑料细管取出后,迅速浸入室温或迅速浸入室温或3737水浴中解冻。水浴中解冻。(5 5)除去抗冻剂除去抗冻剂:原因原因:解冻后得胚胎解冻后得胚胎,细胞内部抗冻剂浓度较高细胞内部抗冻剂浓度较高,对胚胎有毒对胚胎有毒害作用害作用;此外此外,若直接移入等渗生理溶液中若直接移入等渗生理溶液中,水分会伸入细水分会伸入细胞内引起膨胀胞内引起膨胀,使细胞受损伤。使细胞受损伤。抗冻液抗冻液:蔗糖溶液蔗糖溶液;操作操作:解冻后胚胎由浓度高得抗冻液中移向浓度低得抗冻液解冻后胚胎由浓度高得抗冻液中移向浓度低得抗冻液,进行梯度稀释进行梯度稀释;即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中即将胚胎先移入高渗蔗糖溶液中,再移入低再移入低渗蔗糖溶液中渗蔗糖溶液中,在脱水得同时脱出抗冻剂在脱水得同时脱出抗冻剂,而后移入等渗生而后移入等渗生理溶液中洗净理溶液中洗净,待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。待胚胎基本复原后进行移植或继续培养。常 规 冷 冻 法12大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流 从培养液中吸取胚胎,并放置在冷冻液中:1、5M 乙二醇+蔗糖+PBS+AA+FCS 装入细管(编号预先准备好)放入冷冻容器-6、0 Seeding ice 每分钟降低 0、5,一直到-30为止 放入液氮容器常 规 冷 冻 程 序玻璃化得概念玻璃化得概念:就是一种物理现象就是一种物理现象,指通过快速降温越过冰晶形成得阶段指通过快速降温越过冰晶形成得阶段,不发生结晶即可固化不发生结晶即可固化,使溶液形成一种无规则结构得稳定玻璃样固体使溶液形成一种无规则结构得稳定玻璃样固体,且保持液态时正常得分子与离子分布且保持液态时正常得分子与离子分布,则胚胎细胞免受损伤。则胚胎细胞免受损伤。即高浓度得抗冻剂即高浓度得抗冻剂,急速冷却后急速冷却后,液体得黏性增加液体得黏性增加,冰晶不能形成冰晶不能形成,由液态变为透明半固态得现象。由液态变为透明半固态得现象。玻璃化溶液玻璃化溶液(VSVS):):细胞内液抗冻剂细胞内液抗冻剂:这种抗冻剂分子量小这种抗冻剂分子量小,容易透过细胞膜容易透过细胞膜,使其内部迅使其内部迅速达到玻璃化所需要得浓度速达到玻璃化所需要得浓度,所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚所以称为细胞内液抗冻剂。如二甲基亚砜、甘油、丙二醇砜、甘油、丙二醇,乙酰胺及乙二醇等。乙酰胺及乙二醇等。细胞外液抗冻剂细胞外液抗冻剂:这种抗冻剂分子量较大这种抗冻剂分子量较大,一般很难透过细胞膜一般很难透过细胞膜,所以所以称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷称为细胞外液抗冻剂。如聚乙二醇、聚蔗糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及牛血清白蛋白酮、海藻糖及牛血清白蛋白(BSABSA)等。等。上述两种抗冻剂组合后上述两种抗冻剂组合后,用基础液用基础液mPBSmPBS调制成各种玻璃化溶液。调制成各种玻璃化溶液。胚胎玻璃化冷冻几种常见得玻璃化冷冻方法几种常见得玻璃化冷冻方法:(1 1)RallRall等等(19851985)玻璃化冷冻保存法玻璃化冷冻保存法:就是最初发明得玻璃化就是最初发明得玻璃化冷冻保存方法冷冻保存方法,她们采用得她们采用得VS1VS1玻璃化溶液玻璃化溶液,就是以透过性就是以透过性抗冻剂二甲基亚砜抗冻剂二甲基亚砜(DMSODMSO)为主体溶液为主体溶液,为缓与其化学毒性为缓与其化学毒性,添加了乙酰胺添加了乙酰胺(AA)(AA)、丙二醇、丙二醇(PG)(PG)与非透过性抗冻剂聚乙二与非透过性抗冻剂聚乙二醇醇(PEG)(PEG)。PEGPEG具有促进玻璃化形成得作用。胚胎在玻璃化具有促进玻璃化形成得作用。胚胎在玻璃化溶液中平衡时溶液中平衡时,浓度由低到高浓度由低到高(25255050100100VS1VS1););平平衡温度由高到低衡温度由高到低(22224 444)三步完成三步完成,计计3535分钟平衡分钟平衡后投入液氮中冷冻保存。后投入液氮中冷冻保存。胚胎玻璃化冷冻(2 2)ScheffenScheffen等玻璃化冷冻保存法等玻璃化冷冻保存法:主体抗冻剂主体抗冻剂:丙三醇丙三醇(G G)与丙二醇与丙二醇(P)(P);玻璃化溶液玻璃化溶液:上述两种抗冻剂各含上述两种抗冻剂各含2525混合而成混合而成(PG25)(PG25),两两者混合后可降低溶液得化学毒性者混合后可降低溶液得化学毒性,无需添加细胞非透过无需添加细胞非透过性抗冻剂。性抗冻剂。方法方法:室温下室温下(20202525),),胚胎于胚胎于1010丙三醇溶液中平衡丙三醇溶液中平衡1010分钟分钟,然后在然后在PG25PG25中平衡中平衡3030秒钟秒钟,然后投入液氮中冷冻保然后投入液氮中冷冻保存。存。(3 3)KasaiKasai等玻璃化冷冻保存法等玻璃化冷冻保存法:抗冻剂抗冻剂:乙二醇乙二醇(EGEG)为细胞内液抗冻剂为细胞内液抗冻剂(透过性保护剂透过性保护剂),),其其具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性强得特点具备分子量小、溶液渗透压高、细胞膜透过性强得特点;聚蔗糖聚蔗糖(FicollFicoll)为细胞外液抗冻剂为细胞外液抗冻剂,有利于促进玻璃化有利于促进玻璃化形成形成;蔗糖蔗糖(Sucrose)(Sucrose)就是为了冷冻前胚胎细胞得脱水就是为了冷冻前胚胎细胞得脱水,细胞内部细胞内部EGEG得调整及解冻后得得调整及解冻后得EGEG得脱出。得脱出。玻璃化溶液玻璃化溶液:上述三种抗冻剂经上述三种抗冻剂经mPBSmPBS调整成调整成EFSEFS玻璃化溶液玻璃化溶液;方法方法:室温胚胎在室温胚胎在EFSEFS玻璃化溶液中玻璃化溶液中2 25 5分钟平衡后分钟平衡后,即投即投入液氮。入液氮。胚胎玻璃化冷冻(2 2)ZhuZhu等玻璃化冷冻保存法等玻璃化冷冻保存法:主体抗冻剂主体抗冻剂:乙二醇、甘油与二甲基亚砜乙二醇、甘油与二甲基亚砜;玻璃化溶液玻璃化溶液:EFSEFS、GFSGFS与与EDFSEDFS;方法方法:室温下室温下,将胚胎在将胚胎在1010乙二醇或乙二醇或1010甘油或甘油或1010乙二乙二醇醇1010二甲基亚砜中平衡二甲基亚砜中平衡5 5分钟分钟,再移入再移入EFSEFS或或GFSGFS或或EDFSEDFS玻璃化溶液中平衡玻璃化溶液中平衡3030秒钟秒钟,即两步法冷冻保存。此即两步法冷冻保存。此方法重复性较高方法重复性较高,对实验动物及各种家畜得胚胎皆可进对实验动物及各种家畜得胚胎皆可进行冷冻保存。行冷冻保存。胚胎玻璃化冷冻胚胎细管编号E546-SM 4567891%M 198 Mar,27胚胎公司冷冻编号胚胎公司冷冻编号配种编号配种编号供体母牛登记供体母牛登记公牛登记公牛登记冷冻日期冷冻日期直接移植胚直接移植胚胎号胎号胚胎发育阶段胚胎发育阶段胚胎质量胚胎质量BetsyDT 1胚 胎 细 管 编 号胚胎装管保护细胞膜免受损害;保护胚胎细胞,免受晶体损害;具有“渗透活性”;解冻后保护剂必须从细胞内去掉;甘油(丙三醇):普通得冷冻与解冻剂,通过细胞膜慢慢扩散,为避免渗透休克,必须缓慢去掉;乙二醇:直接胚胎移植方法,通过细胞膜快速扩散,因而不需要慢慢去掉。冷冻保存得要点