流行性感冒病毒vero细胞繁殖研究.doc

摘 要流感是由甲(A)、乙(B)、丙(C)三型流感病毒分别引起的一种急性呼吸道传染病。三个流感类型反映了对人类危害程度的顺序，其重要性在于可引起严重的发病率和死亡率，影响学校、公共服务机构和各单位的正常工作。目前研究应用于灭活流感疫苗生产的细胞系主要有MDCK、VERO、PER.C6三个细胞系。其中Vero传代细胞系解决了外源病毒和致癌性的问题，且易于大规模培养，被WHO推荐作为疫苗生产细胞基质之一，使用哺乳动物细胞培养技术替代鸡胚来生产流感疫苗将是大势所趋。基于上述情况，通过广泛的文献检索与反复试验，本文研究了各(亚)型流感病毒于Vero细胞内的快速传代，流感病毒于细胞内传代稳定性问题，为进一步研制Vero细胞培养流感的病毒疫苗提供一定的参考。关键词：流行性感冒病毒；Vero细胞；繁殖BSTRACTInfluenza caused by influenza virus type A、B、C,is important as acause of severe morbidity and mortality that disrupts work in schools，the public services and elsewhere. Duringmajorepidemics many people require medical treatment or hospitalization.Excess mortality often accompanies influenza epidemics，Since they constitute the most rapidly increasing sector of the populations of many countries-projections show that their numbers are likely to double by early in the next century-the epidemiology of influenza can be expected to change accordingly.At present,the cells,including MDCK、Vero、PER.C6 are recommended as cell substance of Influenza Virus Vaccine(Inactivated) production by WHO.And Vero cell line has been successfully used for Rabies、IPV、PIV vaccines production.According to the reports of some literatures and the results from largeamounts of test，this dissertation has accomplished the major technics ofrapidly cultivating Influenza virus in Vero cell and the seed lot system forInfluenza Virus Vaccine（Inactivated，Vero Cell)production.Above all，this paper is provide the foundation of further researching Influenza VirusVaccine(Inactivated，Vero Cell).Key word：Influenza virus；Vero cell line；culture。第一章 绪论1.1流感概述流感是一种严重威胁人类健康的世界范围流行的呼吸道传染病， 其流行病学历史可追踪到12世纪,从文献记载推测1510年可能就有过世界性大流行，尽管1580年已有详细的描述，但人们普遍认为1889-1892年间的流行病学资料更可信 并且有回顾性的病原学证据为甲型流感病毒(A/H2N2)。 特别是1918年意大利流感,估计全世界死于流感的人数达4000-5000万,有关资料还显示人群病死率上升与流感的流行季节相关 ，在美国每年因流感住院人数多于100000人，死亡近40000人， 尽管引起流感流行 ，特别是大流行的机制还不十分清楚 ，但较一致的看法是与流感病毒表面抗原变异和人群普遍缺少免疫力有关。据了解，1977年5月首发于我国东北地区的流感是由H1N1亚型流感病毒引起的，一年后波及全球。H1N1亚型毒株的重现，造成人流感流行史上罕见的在人群中同时流行着两个亚型（H1N1和H3N2）毒株的局面。1981年我国郭元吉等发现猪丙型流感病毒。1989年在我国病马中分离出8个基因节段类似于禽流感病毒的马2（H3N8）亚型流感病毒。1990年在我国猪群中首次分离出猪型（H1N1）流感病毒。1993年在我国病马中首次分离出马2（H3N8）亚型流感病毒。1997年在香港引起禽流感的人群流行而轰动世界， 1999年末至2000年初，欧美及东南亚又爆发了更大规模的流感， 2004年初以来高致病性禽流感病毒H5N1在亚洲的蔓延至今沿末发现人传人的传播途径。2005年10月科学家复原了1918年流感大流行的病毒基因组序列，证明是禽流感，与当前全球流行的H5N1病毒有相似性，世界各国正严阵以待，预防全球H5N1流感大流行。因此流感疫苗的预防接种仍是当今防止流感发生和流行的最有效的手段之一。1937年鸡胚培养流感病毒获得成功 ，使大量生产疫苗成为可能，采用鸡胚培养技术生产流感灭活疫苗已经有60多年历史，多年的临床应用表明其具有很好的免疫效果和临床安全性，保护率一般为75%90%。但也存在着一定的局限性：针对采用鸡胚培养技术生产的流感灭活疫苗存在的上述明显不足，世界各国科学家在选用细胞培养流感病毒方面进行了大量有益的尝试，并取得了很大进展。1995年2月16日WHO在日内瓦召开了关于细胞培养物作为生产流感疫苗的基质的会议，讨论了几个实验室关于流感病毒在稳定细胞系中培养的研究结果，并对下一步工作提出了建议。此后，细胞流感疫苗的研究取得了飞速发展。Kaverin等发现，流感病毒在几种传代细胞系中的复制可因培养液中胰蛋白酶的快速灭活而受到影响；Rocha等比较了株流感病毒(H1N1、H3N2)在细胞培养物中的繁殖能力和生长特性后，认为流感病毒在细胞培养物和鸡胚中的复制能力具有显著差异；Webster等研究发现，倘若在感染后以适当间隔加入胰蛋白酶，Vero细胞可用于最初的分离及人甲型和乙型流感病毒复制。流感病毒12IgG1和IgG2a/IgG2b同型。不管是经Vero细胞还是鸡胚培养的疫苗，只有鼻内接种活病毒疫苗的小鼠才检出病毒特异性分泌型IgA抗体。Vero细胞培养的流感疫苗诱导的T细胞增殖应答和Th1型细胞因子的释放明显高于鸡胚培养的疫苗。研究证实Vero细胞培养的流感疫苗与鸡胚培养的流感疫苗在诱导体液免疫应答方面免疫原性相仿,而在诱导细胞免疫应答方面,前者优于后者。细胞培养系统可以直接利用流感野毒株进行生产，能够对一年中任何时间发生的流行病或大流行均作出快速应答，而不像鸡胚生产首先要制备高生长的重组株（需46周），并能避免污染的鸡胚（可能影响生物负荷和疫苗内毒素含量）危险。而且在哺乳动物细胞中生长的流感病毒比鸡胚培养分离的病毒更接近于临床样本中的病毒。因此具有效果好、产量高、生产迅速、起始材料易于控制、易于标准化、生产环境密闭以及保证的稳定性和免疫原性等优点。未来几年内，使用哺乳动物细胞培养技术替代鸡胚来生产流感疫苗将是大势所趋，因此，本研究具有一定的理论和实践意义。1.1.1流感的发病原因与临床症状人类一般感染H1、H2或H3和N1或N2亚型病毒。微小突变不断在这些表面糖蛋白中产生小的变化，引起“抗原性漂移”。另一方面,“抗原性转变”包括由不同甲型病毒株的遗传物质重配造成的大的变化，一般认为由于动物中甲型流感混合感染引起的。但是，动物亚型的流感病毒偶尔直接引起人类流感。虽然此类病毒感染人类机率不高，但病死率很高。例如,1976年美国发现“猪4发。该病毒从家鸡和家鸭传给人，引起18例确诊病例，其中6例死亡。最近，已检出在A/H3N2和A/H1N1之间的人-人重配株,结果产生A/H1N2亚型。乙型流感病毒只感染人类。大多发病较轻、且散在流行，但偶尔也可引起与甲型流感病毒一样严重的流行。乙型流感病毒的抗原性变异程度不如甲型流感病毒。流感病毒由呼吸道分泌物传播给易感人群，主要因子是由感染者打喷嚏、咳嗽或甚至交谈产生的小颗粒气溶胶。流感潜伏期为15天，一般为2天。在多数病例，从发病前12天到发病后45天，相当于传染期，在呼吸道标本中可发现病毒。无慢性带毒状态，但在幼儿，病毒排出持续时间长于成人。临床发病的特点是，突然发热、头痛、不适和肌痛。全身症状通常持续3天,偶尔见有高热长达1周。咽喉疼痛、鼻炎和无痰性咳嗽在全身症状消失后可持续数天。无并发症患者发病后34天开始恢复，而且恢复彻底。如有并发症，恢复期就延长，继发性细菌性肺炎是最常见的流感并发症，主要发生在老年人和某些慢性疾病患者。原发性流感肺炎可能是罕见的并发症，但病死率高。一般认为主要由血清抗体提供流感的防御作用,但几乎可肯定粘膜IgA抗体和细胞介导免疫应答也可预防流感。初次感染后大约12周,血清中出现中和抗体、血凝抑制(HAI)抗体及抗NA抗体，约在34周达到高峰。再次感染后，抗体应答更为迅速。流感抗体可持续数月或数年，但在一些高危人群，抗体水平在疫苗接种后数月内可开始降低。该抗体对特定亚型内的变异株有特异性，由于在新的感染株中有抗原性改变，故保护作用可降低或失去。HAI抗体滴度1:40(或中和抗体滴度1:8)就具有免疫力。对老年人的保护作用,可能需要1:80的HAI滴度。HAI抗体可预防感染,抗NA抗体可降低从感染细胞中释放的病毒量,从而可改善疾病。IgA抗体在感染后约14天达到高峰，可在唾液、鼻分泌物、痰和气管洗液中检出。在出现产抗体细胞之前，已出现对流感有特异性的细胞毒性T淋巴细胞,起限制感染的作用。此外，单个核细胞可浸润受染气道，提供抗流感感染细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。1.1.2流感疫苗的种类一类为流感病毒灭活疫苗，另一类为流感病毒减毒活疫苗，流感病毒灭活疫苗分三代 ，第一代为全病毒疫苗，为经甲醛灭活的全病毒颗粒 早期粗制的全病毒疫苗接种后局部和全身反应较强 ! 60年代初由于超速离心机和层析色谱技术的应用制成后的全毒疫苗局部和全身反应明显减轻 ，但儿童使用时仍可出现不良反应 ，现已少用 ，免疫效果肯定 。第二代为裂解疫苗，1968年在美国首次被批准使用裂解疫苗 ，即用裂解剂如乙醚，3-N-丁基磷酸盐 , 聚山梨醇酯80,脱氧胆酸钠等, 使病毒裂解成为含有病毒表面抗原血凝素和神经氨酸酶, 核壳以及基质蛋白的可溶性碎片, 由于不含有全病毒疫苗中的各种脂类反应原, 经纯化后不良反应大为减少 ,广泛应用于成人和儿童. 第三代为病毒亚单位疫苗,1976年用于临床。制作亚单位疫苗 ,需先将病毒的内部蛋白剔除 只留有含高度纯化的病毒表面抗原血凝素和神经氨酸酶 ,不良反映显著减少 ,不仅适用于成人,尤其适于儿童 .第四代疫苗为佐剂疫苗 ，1997年开始应用于临床，在实践中发现，亚单位疫苗虽然不良反应减少 ，但其免疫原性不如全病毒颗粒， 接种后特别是老年人群保护性抗体产生不理想 ，为此在亚单位疫苗基础研制成佐剂疫苗 从而提高了亚单位疫苗的免疫原性和预防效果。1. 1 .3现用灭活疫苗的安全性、效力和有效性因全病毒疫苗会在儿童中引起不良反应而未获得广泛使用，裂解和亚单位疫苗则有很好的耐受性,而且非常安全。对疫苗没有相关报道则提示超敏反应相当罕见。最近的一些随机对照试验和一项大规模队列研究已证实流感疫苗对哮喘病人的安全性。Guillain-Barr综合征在疫苗接种后6周内出现，估计危险性为12/100万，远远低于流感及其并发症的死亡危险性,尤其是流感疫苗接种的目标人群。对全世界文献检索显示,疫苗接种与各种罕见的事件呈弱相关。2000年确定了一种新的流感疫苗相关不良反应：眼-呼吸道综合征(ORS-2000),诊断标准是在免疫后224小时内出现双眼炎症或呼吸道症状或脸面水肿,持续48小时以内。1.1.4接种疫苗的必要性对流感灭活疫苗效力和有效性的研究表明,接种该疫苗有巨大裨益。一项随机对照试验显示,疫苗接种者实验室确诊流感的发生率下降52%，另一项对生活在社区老年人的前瞻性队列研究则显示下降了94%。许多队列研究和病例-对照研究都显示，疫苗接种者因肺炎和流感、各种呼吸系统疾病、呼吸系统疾病和心力衰竭的住院率、肺炎和流感的死亡率以及总死亡率均低于对照。一项对2001年前发表报道的荟萃分析显示，疫苗接种可使流感样疾病患者减少35%，肺炎和流感的住院率减少47%，总死亡率减少50%，同时流感疫苗接种还能预防心力衰竭、脑梗塞、复发性心肌梗塞和原发性心博停止，说明疫苗接种对心血管疾病患者有重要裨益。1.2流感疫苗的研究与发展开始于20世纪30年代初，当时用受染的小鼠肺所制成的匀浆液中的流感病毒，经甲醛灭活接种动物 ，然后用流感野毒株皮下和腹腔内攻击 ，以了解其是否有免疫功能，显然这不适用于人类。1937年鸡胚培养流感病毒获得成功 ，使大量生产疫苗成为可能。1941年美国首先批准在人体使用流感疫苗；1943年在美国军队中使用，并证实有效；1945年鸡胚生长的全病毒流感灭活疫苗首次获得批准上市；1947年流感病毒的抗原漂移可降低流感病毒预防效果（H1N1）；1948年世界卫生组织全球流感检测机构，促进定期更换流感病毒疫苗株；1970年高生长的重配株（Reassortants）：常规用于疫苗生产；1970年开发成功流感病毒裂解灭活疫苗，并投放市场；1970年开发流感病毒减毒活疫苗；1978年单扩免疫扩散试验（SRID）用于疫苗接种量的定量试验（Poteney Test）；1980年开发纯化的血凝素疫苗（HA Vaccines）（重组DNA）；1980年疫苗佐剂的应用；1990年开发细胞培养的流感病毒疫苗；1990年开发DNA质粒流感疫苗；2003年喷鼻型温度敏感株减毒活疫苗投放市场；2003-开发病毒体（virosome）亚单位疫苗；纳米流感病毒亚单位疫苗；加佐剂病毒亚单位疫苗；PER C6细胞流感疫苗；VERO细胞流感疫苗；MDCK细胞流感疫苗；喷鼻型流感病毒疫苗；广谱免疫原性流感疫苗；或以上数种类型的搭配。1.2.1新型疫苗细胞培养疫苗虽然，采用鸡胚培养技术生产流感灭活疫苗已经有60多年历史，多年的临床应用表明其具有很好的免疫效果和临床安全性，保护率一般为75%90%。但也存在着一定的局限性：如对鸡群的依赖性，鸡胚生产流感疫苗需要消耗大量的SPF级鸡蛋，质量难于控制，方法难于标准化；鸡胚带有潜在的外源病毒污染可能；用鸡胚尿囊液所分离的流感病毒或传代易引起抗原型变异；手工操作性，培养周期过长，不易于控制产量，不利于大规模生产；尤其是一旦大流行发生，很难在短期内选择出适应鸡胚尿囊腔生长的变异株，并且种蛋的供应也是个问题，难以应对流感大暴发。针对采用鸡胚培养技术生产的流感灭活疫苗存在的上述明显不足，世界各国科学家在选用细胞培养流感病毒方面进行了大量有益的尝试，并取得了和大进展。1995年2月16日WHO在日内瓦召开了关于细胞培养物作为生产流感疫苗的基质的会议，讨论了几个实验室关于流感病毒在稳定细胞系中培养的研究结果，并对下一步工作提出了建议。此后，细胞流感疫苗的研究取得了飞速发展。Kaverin等发现，流感病毒在几种传代细胞系中的复制可因培养液中胰蛋白酶的快速灭活而受到影响；Rocha等比较了株流感病毒(H1N1、H3N2)在细胞培养物中的繁殖能力和生长特性后，认为流感病毒在细胞培养物和鸡胚中的复制能力具有显著差异；Webster等研究发现，倘若在感染后以适当间隔加入胰蛋白酶，Vero细胞可用于最初的分离及人甲型和乙型流感病毒复制。不管是经Vero细胞还是鸡胚培养的疫苗，只有鼻内接种活病毒疫苗的小鼠才检出病毒特异性分泌型IgA抗体。Vero细胞培养的流感疫苗诱导的T细胞增殖应答和Th1型细胞因子的释放明显高于鸡胚培养的疫苗。研究证实Vero细胞培养的流感疫苗与鸡胚培养的流感疫苗在诱导体液免疫应答方面免疫原性相仿,而在诱导细胞免疫应答方面,前者优于后者。并且细胞培养系统可以直接利用流感野毒株进行生产，能够对一年中任何时间发生的流行病或大流行均作出快速应答，而不像鸡胚生产首先要制备高生长的重组株（需46周），并能避免污染的鸡胚（可能影响生物负荷和疫苗内毒素含量）危险。而且在哺乳动物细胞中生长的流感病毒比鸡胚培养分离的病毒更接近于临床样本中的病毒。因此具有效果好、产量高、生产迅速、起始材料易于控制、易于标准化、生产环境密闭以及保证的稳定性和免疫原性等优点。未来几年内，使用哺乳动物细胞培养技术替代鸡胚来生产流感疫苗将是大势所趋。世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗，目前国内还没有向国家食品药品监督管理局申请哺乳动物细胞生产流感疫苗的报道。1.2. 2流感疫苗的研究现状目前国内外正在研制的流感疫苗主要有减毒活疫苗、基因工程疫苗、核酸疫苗、通用疫苗等类型。针对流感疫苗的研究热点主要是开发不同的佐剂（如MF59,Virosome等）、不同的免疫途径、不同的抗原组成及含量的安全性和免疫原性及保护效果等。1.3展望未来几年内，使用哺乳动物细胞培养技术替代鸡胚来生产流感疫苗将是大势所趋。世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。为加快细胞培养流感疫苗技术的开发，美国政府决定投资11亿美元资助葛兰素史克、MedImmune、诺华、DynPort、Solvay和巴斯德6个主要的流感疫苗开发新技术。作为一个流感大国，我国更应加强在在这方面的研究工作，以应对突发的流感暴发流行。第二章 流感病毒于Vero细胞内的适应性研究2.1胰酶浓度对流感病毒在Vero细胞内繁殖的影响研究2.1.1材料流感病毒A1/NYMC.X-179A；A3/ NYMC.X-187A；B/Brisbane/60/2008。2.1.2细胞Vero细胞2.1.3其他MEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、新霉素、谷氨酰胺、生理盐水、D-Hanks液2.1.4主要仪器台式离心机(centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置显微镜(olympus)细胞操净台(苏州净化) 二氧化碳培养箱(Thermoforma)恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司) 恒温水浴箱微量移液器 低温冰柜超低温冰柜 家用冰箱刻度吸管 血凝板加液槽 漩涡振荡器细胞培养瓶2.1.5方法选择生长良好的单层Vero细胞，分组、编号后，弃旧培养液，用D-Hanks液洗涤细胞面三遍，控净液体，按组接种含1g/ml、5g/ml、10g/ml的胰酶的流感毒病液，置341吸附适宜时间后，补加维持液，置341培养3天，收获细胞培养物，检测其血凝效价。结果见表1。表1流感病毒不同胰酶浓度的研究结果胰蛋白酶浓度 不同(亚)型流感病毒H1N1 H3N2 B1g/ml 1:12 1:8 1:25g/ml 1:64 1:128 1:6410g/ml 1:4 1:32 1:322.1.6结果由表1可见，当胰酶浓度为5g/m时，流感病毒在Vero细胞内的效价最高。2.2 流感病毒最佳感染量的研究2.2.1流感病毒A1/NYMC.X-179A；A3/ NYMC.X-187A；B/Brisbane/60/2008。2.2.2细胞Vero细胞。2.2.3其他MEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、新霉素、谷氨酰胺、生理盐水D-Hanks液2.2.4主要仪器台式离心机(centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置显微镜(olympus)细胞操净台(苏州净化) 二氧化碳培养箱(Thermoforma)恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司) 恒温水浴箱微量移液器 低温冰柜超低温冰柜 家用冰箱刻度吸管 血凝板加液槽 漩涡振荡器细胞培养瓶2.2.5方法选择生长良好的单层Vero细胞，按试验分组进行编号后，弃旧培养液，用D-Hanks液洗涤细胞面，控净液体，按组接种经1:100、1:1000、1:10000稀释的流感毒种，341吸附适宜时间后，补加维持液，置341培养3天，收获细胞培养物检测其血凝效价。结果见表2。表2流感病毒的接种量研究方法及结果8毒种稀释度 不同(亚)型流感病毒H1N1 H3N2 B1:100 1:8 1:32 1:161:1000 1:32 1:12 1:641:10000 1:16 1:64 1:322.2.6结果由表2可见，将流感病毒按1:1000稀释后接种单层Vero细胞，可获取最高的血凝效价。2.3流感病毒最佳收获时间研究2.3.1材料流感病毒A1/NYMC.X-179A；A3/ NYMC.X-187A；B/Brisbane/60/2008。2.3.2细胞Vero细胞。2.3.3其他MEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、新霉素、谷氨酰胺、生理盐水D-Hanks液2.3.4主要仪器台式离心机(centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置显微镜(olympus)细胞操净台(苏州净化) 二氧化碳培养箱(Thermoforma)恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司) 恒温水浴箱微量移液器 低温冰柜超低温冰柜 家用冰箱刻度吸管 血凝板加液槽 漩涡振荡器细胞培养瓶2.3.5方法取流感毒种，按一定比例稀释后接种Vero细胞，置341培养不同时间，每天抽样后进行检测。结果见表3。表3不同收获时间的流感病毒试验研究结果培养时间 不同(亚)型流感病毒H1N1 H3N2 B1 1:4 1:2 2 1:96 1:64 1:483 1:160 1:128 1:644 1:160 1:128 1:965 1:160 1:128 1:966 1:160 1:128 1:967 1:128 1:128 1:962.3.6结果由表3可以看出，甲1，甲3病毒置341培养3天、B型病毒培养4天时流感病毒血凝效价达到最高。2.4流感病毒不同培养温度的研究2.4.1材料流感病毒A1/NYMC.X-179A；A3/ NYMC.X-187A；B/Brisbane/60/20082.4.2细胞Vero细胞。2.4.3其他MEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、新霉素、谷氨酰胺、生理盐水、D-Hanks液2.4.4主要仪器台式离心机(centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置显微镜(olympus)细胞操净台(苏州净化) 二氧化碳培养箱(Thermoforma)恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司) 恒温水浴箱微量移液器 低温冰柜2.5不同培养温度对流感病毒的影响2.5.1材料流感病毒A1/NYMC.X-179A；A3/ NYMC.X-187A；B/Brisbane/60/2008。2.5.2细胞Vero细胞。2.5.3其他MEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、新霉素、谷氨酰胺、生理盐水、D-Hanks液2.5.4主要仪器台式离心机(centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置显微镜(olympus)细胞操净台(苏州净化) 二氧化碳培养箱(Thermoforma)恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司) 恒温水浴箱微量移液器 低温冰柜超低温冰柜 家用冰箱刻度吸管 血凝板加液槽 漩涡振荡器细胞培养瓶2.5.5方法取流感毒种，按一定比例稀释后接种Vero细胞，置30、34、37不同温度培养，三天后收获培养液，用直接血凝法测定其血凝效价，详见表4.表4不同温度培养流感病毒的试验研究结果不同（亚）型流感病毒 培养温度37 34 30H1N1 1:96 1:128 1:16H3N2 1:48 1:96 1:8B 1:32 1:80 1:82.5.6结果由表4可见，34是流感病毒于Vero细胞内繁殖的最佳温度。 第三章 流感病毒在Vero细胞细胞内的遗传稳定性研究3.1材料流感病毒A1/NYMC.X-179A；A3/ NYMC.X-187A；B/Brisbane/60/2008。3.1.1细胞Vero细胞。3.1.2其他MEM培养基、小牛血清、胰蛋白酶、新霉素、谷氨酰胺、9-11日胚龄鸡胚霍乱滤液、生理盐水、D-Hanks液、硫乙醇酸盐培养基、改良马丁培养基营养琼脂培养基、支原菌半流体培养基3.1.3主要仪器台式离心机(centrifuge 5415P,eppendorf) 倒置显微镜(olympus)细胞操净台(苏州净化) 二氧化碳培养箱(Thermoforma)恒温培养箱(上海实验仪器厂有限公司) 恒温水浴箱微量移液器 低温冰柜超低温冰柜 家用冰箱孵化箱 钻孔器检卵器 刻度吸管血凝板 加液槽 漩涡振荡器 细胞培养瓶注射器3.2制备方法3.2.1鸡胚尿囊腔内传代原始毒株启封，以适宜病毒浓度接种911日龄SPF鸡胚，置3335培育4872小时，剔除死胚，收获尿囊液。将收获的病毒液以无菌方法合并，按不同分装规格进行分装。抽取检定用样品后，置-70以下冻存。3.2.2 Vero细胞内传代3.2.2.1病毒接种及培养仔细挑选生长状态好、无污染的单层Vero细胞，弃旧培养液，细胞面用D-Hanks液，轻轻洗涤，至少2次。选择适当稀释度的流感病毒液接种后，置341吸附适宜时间。补加维持液后，置341继续培养。3.2.2.2病毒收获当细胞病变达到75%左右时，选择无污染的细胞培养瓶，收获病毒液。3.2.2.3分装将收获的病毒液以无菌方法合并，分装。抽取检定用样品后，置-70以下冻存。3.3结果采用上述方法，将各毒株在Vero细胞内连续传代，共计15代。各毒株在Vero细胞内的传代谱系及检测结果相见表。由表可见，流感病毒在Vero细胞内连续传15代，自第4代后，流感病毒血凝滴度均在1:128以上。表5 A1/NYMC.X-179A在Vero细胞内传代稳定性结果检定项目及结果 传代谱系鉴别试验 无菌检查 支原体检查 血凝效价E10 / / / /E10E1 / 合格 / 1:320E10E1-V / 合格 合格 1:8E10E1-V2 合格 合格 合格 1:64E10E1-V3 / 合格 / 1:96E10E1-V 合格 合格 合格 1:128E10E1-V5 / 合格 / 1:128E10E1-V6 / 合格 / 1:192E10E1-V7 合格 合格 / 1:128E10E1-V8 / 合格 / 1:256E10E1-V9 / 合格 / 1:160E10E1-V10 合格 合格 合格 1:128E10E1-V11 / 合格 / 1:128E10E1-V12 / 合格 / 1:96E10E1-V13 / 合格 / 1:96E10E1-V14 / 合格 / 1:128E10E1-V15合格 合格 合格 1:12836表6A3/ NYMC.X-187A (H3N2)在Vero细胞内传代稳定性结果检定项目及结果 传代谱系鉴别试验 无菌检查 支原体检查 血凝效价E10 / / / /E10E1 / 合格 / 1:640E10E1-V1 / 合格 合格 1:48E10E1-V2 合格 合格 合格 1:96E10E1-V3 / 合格 / 1:128E10E1-V4 合格 合格 合格 1:128E10E1-V5 / 合格 / 1:192E10E1-V6 / 合格 / 1:192E10E1-V7 合格 合格 / 1:128E10E1-V8 / 合格 / 1:192E10E1-V9 / 合格 / 1:192