水稻愈伤组织的诱导实验报告.docx

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水稻愈伤组织的诱导

一、实验目的
1、掌握外植体的消毒方法和接种技术；
2、了解愈伤组织诱导的过程。
二、实验原理
　　以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。
　　外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。
三、实验材料与用具
1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）；
2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)；
3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）；
4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。
四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒
　用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。
2、种子去壳
选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。
3、操作者双手的清洗与消毒
　　在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！）
4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行）
　　用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。
5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作）
　　将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO→用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。
6、接种与观察
　　将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。
接种的总种子数

　　　　　　污染率(%)=
×100%
污染的种子数

接种的总种子数
诱导率 (%)=
×100
×100%
形成愈伤组织的种子数
数

组诱导率 (%)=
织的

诱导

五、实验结果
本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为0 。说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。
最后，我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗，诱导率分别为70%和80% 。
六、 讨论与分析
1、 本实验出现污染的原因分析。
1） 外植体消毒不彻底，表面有较多微生物残留；
2） 实验用具如镊子等消毒不彻底，在操作过程中把微生物带到种子上，污染种子；
3） 实验前，超净工作台没有充分消毒，台内（主要是空气中）还残留有较多微生物；
4） 培养皿密封措施做得不好，致使培养期间有微生物进入到培养皿中，并生长繁殖。
2、 降低实验中的污染率的方法。
1） 外植体、实验用具、超净工作台均需彻底消毒；
2） 做好密封措施；
3） 操作时勿离酒精灯太远；
4） 尽量缩短操作时间；
5） 定时更换消毒液（75%酒精、2% NaCLO）。
3、 分析与愈伤组织诱导形成有关的因素。
1） 外植体的状态（分化的程度）；
2） 诱导培养的环境（光线、水分、温度等）；
3） 植物激素的作用。

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