CRISPR_Cas系统的挖掘、改造与功能拓展_柳柯.pdf

2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：47-66CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展柳柯，林桂虹，刘坤，周伟，王风清，魏东芝（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，鲁华生物技术研究所，上海 200237）摘要：规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas）是一种微生物获得性免疫系统，自从证实其可用于基因编辑之后，迅速增强了我们编辑、操纵、注释、检测甚至成像生物体DNA和RNA的能力，为基础生命科学、医学和生物工程等领域的创新发展注入了强劲动力，快速推动了合成生物学等学科的兴盛发展。然而，CRISPR/Cas系统也有一些固有的问题，例如脱靶效应、原间隔序列邻近基序（PAM）对靶目标的约束性以及基因编辑活性的可控性等，严重制约了该系统在基因精准可控编辑等方面的长足发展，阻碍了其新功能和新应用的拓展。为了突破这些限制，“蛋白质工程修饰Cas蛋白”与“基于生物信息学的新型CRISPR/Cas系统的挖掘”就成为完善发展CRISPR/Cas系统以及扩充CRISPR工具箱的两种重要策略。本文主要针对当前应用最为广泛的类CRISPR/Cas系统，重点介绍了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a这三种代表性系统的基本结构和作用机制，及其在结构改造和功能拓展等方面的新进展，同时也对一些新近发掘的具有重要特色和潜在应用价值的CRISPR/Cas系统进行了综述，例如CRISPR/Cas 和 CRISPR/Cas12k。这些改造和发掘工作显著改善了CRISPR/Cas系统的固有问题，有力地拓展了其功能和适用性，势必会进一步快速推动CRISPR/Cas系统在诸多领域的创新发展。关键词：CRISPR/Cas；基因编辑；脱靶效应；PAM约束；Cas工程改造中图分类号：Q816 文献标志码：A Mining,engineering and functional expansion of CRISPR/Cas systemsLIU Ke，LIN Guihong，LIU Kun，ZHOU Wei，WANG Fengqing，WEI Dongzhi（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，Newworld Institute of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）Abstract:The clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)and CRISPR-associated proteins(Cas)were derived from an acquired immune system in microbes.Since their functions on gene editing have been reported,they have been rapidly used to enhance our ability to edit,regulate,annotate,detect,and image DNA and RNA fragments of various organisms,which consequently have faciliated fundamental research in life science,收稿日期：2021-02-08 修回日期：2021-04-28基金项目：国家自然科学基金（21978084）引用本文：柳柯，林桂虹，刘坤，周伟，王风清，魏东芝.CRISPR/Cas系统的挖掘、改造与功能拓展 J.合成生物学，2023，4（1）：47-66Citation：LIU Ke，LIN Guihong，LIU Kun，ZHOU Wei，WANG Fengqing，WEI Dongzhi.Mining，engineering and functional expansion of CRISPR/Cas systemsJ.Synthetic Biology Journal，2023，4（1）：47-66DOI:10.12211/2096-8280.2021-022特约评述合成生物学 第 4 卷medicine,bioengineering and so on,and drived the development of synthetic biology and other disciplines.However,CRISPR/Cas systems also have some inherent drawbacks,such as off-target effect,constraint of protospacer-adjacent motif(PAM)on the target,and controllability of the gene editing activity,which substantially compromise their applications in highly precise and controllable gene editing.In order to overcome these challenges,two important strategies have been employed to develop enhanced CRISPR/Cas systems and expand the CRISPR toolbox,including modifying the Cas proteins by protein engineering and mining novel CRISPR/Cas systems with bioinformatics.In the review,focusing on the most widely used the type II CRISPR/Cas systems,we mainly introduce the basic structures and functions of three representative systems,including CRISPR/Cas9,CRISPR/Cas12a and CRISPR/Cas13a,as well as recent progress in their structural modifications and functional expansion.Thereinto,engineering strategies for CRISPR/Cas systems have been systematically commented,which include modification methods for Cas proteins and the way to expand the function of CRISPR/Cas systems by coupling specfic proteins with Cas.In addition,we also review some novel CRISPR/Cas systems with important characteristics and potential applications that have been discovered in recently years,such as CRISPR/Cas and CRISPR/Cas12k.These engineering modifications and mining work have greatly addressed the inherent problems of the CRISPR/Cas systems,and effectively expanded their functions and applicability,which will further promote the applications of the CRISPR/Cas systems in many fields.Keywords:CRISPR/Cas;gene editing;off-target effect;PAM constraints;Cas engineeringCRISPR/Cas是一种协助细菌和古生菌抵御外来遗传元件入侵的适应性免疫系统，包含两个主要部分：由重复序列和间隔序列规律成簇排列形成的CRISPR阵列和一系列CRISPR相关蛋白1-3。在生理上，这种微生物免疫系统发挥功能一般包括3个阶段：第一阶段，又称适应阶段，由Cas蛋白复合物（通常为CRISPR适应模块所编码的Cas蛋白）锚定入侵遗传物质，随后切离一部分称为前间隔序列（protospacer）的特定 DNA 序列，并将其插入到两个重复序列之间，作为特定的间隔序列；第二阶段，或称表达及加工阶段，由CRISPR阵列转录为前体 CRISPR RNA（简称 pre-crRNA），随后由不同的Cas蛋白复合物（有时需要额外蛋白以及RNA分子的协助）加工成为成熟048第 4 卷 的 CRISPR RNAs（简称为 crRNAs）；第三阶段，或称为干扰阶段，加工成熟的crRNAs与Cas蛋白复 合 物 结 合 并 特 异 性 靶 向 切 割 目 标 DNA 或RNA4-7。正 是 基 于 这 种 独 特 的 功 能 机 制，CRISPR/Cas系统迅速发展成为了新一代基因编辑工具，由于其易于设计、成本低廉、编辑效率高等优势，该工具一经出现就快速取代了锌指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）8、转录激活样因子效应物核酸酶（transcription activator-like effectors nuclease，TALEN）等传统基因编辑工具9，形成了功能更为强大的基因编辑技术，并广泛应用于基因调控10-12、表观修饰13-15、碱基编辑16-17、基因成像18-20等不同领域，且在微生物、植物、动物甚至人体内表现出了广泛的适用性21-25，强有力地推动了基础生命科学、医学和生物工程等学科的快速发展，尤其是为合成生物学的突破式发展提供了重要技术支撑。鉴于CRISPR/Cas系统对科学与社会重要而深远的影响，其奠基人 Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier因此斩获了2020年度的诺贝尔化学奖26。CRISPR/Cas系统的成功应用，激发了人们对其更多的期待，因此CRISPR/Cas系统被不断地应用于疾病特异性检测、基因治疗和细胞功能精准调控等新领域。尽管相关工作已经取得了令世人瞩目的成就，然而CRISPR/Cas系统固有的脱靶效应、PAM对可编辑基因的限定性和基因编辑活性的可控性等问题，严重影响了CRISPR/Cas系统在应用过程中的精准性、灵活性、可控性和安全性，阻碍了其功能和应用范围的进一步拓展27-31。为了解决这些难题，优化改造现有CRISPR/Cas系统和发掘具有新颖功能特色的CRISPR/Cas新系统，就成为近些年来获得性能更优、用途更广的基因编辑系统的重要策略。目前针对CRISPR/Cas系统常见的优化改造工作有：对向导RNA（guide RNA，gRNA）的优化设计32-33，对Cas蛋白与向导RNA浓 度 的 优 化34-36，对 Cas 蛋 白 的 工 程 化 改造30-31，35，37-45等；而对于 CRISPR/Cas 新系统发掘，近几年也有许多重要的进展，发现了多种极具特色的新式CRISPR/Cas系统，包括Cas12a/b/c、Cas13a/b/c、Cas、Cas12k等46-54。无论采用何种方式，获得功能更加出色、应用范围更广的CRISPR/Cas工程系统始终是科研工作者所追求的目标。本文着眼于近些年来CRISPR/Cas系统的相关发展，重点介绍了具有广泛应用价值的类CRISPR/Cas系统的优化改造方法和相关进展，并对新近发掘的具有重要特色和应用价值的CRISPR/Cas 系 统 进 行 了 综 述。这 些 工 作 显 著 提 升 了CRISPR/Cas系统的功能，拓展了其应用价值，有利于CRISPR/Cas系统在新领域的创新发展，也为进 一 步 改 进 拓 展 CRISPR/Cas 系 统 指 明 了 发 展方向。1 CRISPR/Cas的分类在长期进化过程中，CRISPR/Cas产生了多种多样的组织形式和相应的Cas蛋白，对其进行清晰的分类十分困难46-47，55。目前，CRISPR/Cas系统已有2个大类（类和类）、5个小类和16个亚类，最近又新增了第6小类和3个新亚类46，55。在已鉴定的CRISPR/Cas系统中，以类CRISPR/Cas为主，占比多达90%左右，广泛分布于细菌和古生菌中，由于其效应复合物十分复杂，通常需要47个Cas蛋白亚基，因此应用于基因编辑时实用性往往不佳，使得编辑过程变得复杂烦琐55。而相较于类系统，类CRISPR/Cas可以通过单个多功能域的 Cas 蛋白发挥 DNA 或 RNA 的切割功能，因此类CRISPR/Cas系统易于设计改造，再加上其能以双链断裂（double-strand breaks，DSBs）的方式高效切割靶核酸序列，故而类 CRISPR/Cas最早被开发并应用于基因编辑等工作55-58。在类CRISPR/Cas中，CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a最具代表性，应用最为成功和广泛，下面我们重点对这三种系统进行详细介绍。1.1 CRISPR/Cas9系统Cas9是最早被发现和表征的类CRISPR/Cas效应蛋白，是目前应用最为广泛的 Cas 蛋白之一21，59-61。Cas9蛋白为二裂片结构，分为核酸酶叶（nuclease lobe，NUC）和识别叶（recognition lobe，REC）两部分，两部分形成的中央通道可容纳靶 DNA 和 crRNA 配对形成的异源双链核酸分049合成生物学 第 4 卷子，REC与 gRNA的识别结合密切相关，而NUC则主要负责DNA链的切割61。NUC可进一步划分为 HNH 域、RuvC 域、楔形域（wedge domain，WED）和 PAM 互作域（PAM-interacting domains，PI），前两者分别用于切割靶DNA链和其互补链，产生平末端结构，PI则与PAM序列的识别与结合有关。REC可继续划分为REC1、2、3域以及富含精 氨 酸 的 桥 螺 旋 结 构（bridge helix，BH）61-63 图1（a）。虽然许多Cas9蛋白的三维结构已经得到了解析，但对于多个域的具体功能并未得到完全阐明，因而通过完全理性的方式来优化改造Cas9仍较为困难61-64。在功能上，Cas9是一种由crRNA和反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）引导的 DNA 核酸内切酶，其发挥作用起始于 CRISPR阵 列 转 录 为 pre-crRNA，随 后 tracrRNA 与 pre-crRNA的重复序列互补，并与Cas9蛋白结合在一起形成RNA-蛋白复合体61，63。接着，核糖核酸内切酶 RNase 对 RNA-蛋白复合体上的 pre-crRNA进行加工剪切，使其为成熟的 crRNA。然后活性Cas9-RNA 复合体扫描基因组 3端富含鸟嘌呤的PAM序列，并识别出与成熟crRNA互补的靶DNA序列，之后在成熟的crRNA与靶DNA互补碱基配对的驱动下形成R环，Cas9 蛋白的 RuvC 和 HNH活性域分别对靶向DNA链和非靶向DNA链进行切割，从而引发 DNA 双链断裂61，63图1（d）。基于这种机制，人们设计开发了基于 CRISPR/Cas9的基因编辑工具，通过对靶基因的切割，就可以利用非同源末端连接（non-homologous end-joining，NHEJ）或 同 源 重 组（homologous recombination，HR）等 DNA 修补机制，对目标靶点进行基因敲除、整合、倒位、易位、单碱基突变以及基因表达抑制、激活、标记等编辑操作21，59-60，65-68。这种基因编辑方法精准高效、易于设计、操作简单且在不同物种中均有良好表现，得到了快速的应用推广，解决了先前许多物种基因组难于编辑的难题，成为近些年来生物技术发展一项重大成就。但是Cas9也有一些不足之处：一是其识别的PAM 序列为 5-NGG，该序列在许多低 GC含量的基因组中出现的频率较低，例如在人类基因组中平均每8个碱基才有可能出现1个PAM序列，这严重制约了其对基因组大部分位点的编辑69；二是脱靶效应，gRNA同靶结合区的结合可以容纳多达7个碱基的错配27，因而CRISPR/Cas9系统在基因组编辑过程中不可避免地会发生难以预测的脱靶现象。Fu等对 CRISPR/Cas9系统的脱靶效应进行了评估，结果表明其脱靶率高达 66%，这对于许多需要对基因组进行精准编辑的工作来说是一个严重的问题，例如在医学上用于基因治疗27。因此如何增强 CRISPR/Cas9 系统用于基因编辑的灵活 性 和 特 异 性 是 亟 待 解 决 的 关 键 科 学 问题28，33，69。除此之外，CRISPR/Cas9系统的有效传递方式、对部分序列编辑活性不足、Cas9蛋白毒性等问题也对其应用有一定的限制70-72。总的来说，对基于 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑工具的开发和应用，极大增强了科研工作者对于不同物种基因编辑的能力，但其相应的不足之处也十分明显。因此如何解决所面临的挑战，使其功能和适用性更加强大，值得继续深入研究。1.2 CRISPR/Cas12a系统Cas12a（先前称为Cpf1）是类型CRISPR/Cas的效应蛋白，也是目前应用最为广泛的Cas蛋白之一30，38，73-77。Cas12a蛋白同样为二裂片结构，包括 NUC 叶和 REC 叶，NUC 叶包括 WED、PI、RuvC、BH和Nuc多个结构域，其中Nuc域为假定的新型核酸酶结构域，用于切割靶DNA链图1（b）。与Cas9蛋白不同，Nuc域行使切割功能的前提是RuvC域能够对靶DNA链的互补链进行切割，因此对于RuvC域活性残基的突变会直接破坏Cas12a蛋白对于双DNA链切割的能力。而Cas12a的REC叶则仅包括两个区域，REC1域和REC2域，同样与靶 DNA 的识别与结合有关78-80图 1（b）。相较于 Cas9 蛋白，Cas12a 蛋白分子量要小一些，含12001300个氨基酸，理论上更适合通过腺病毒相关载体（recombinant adeno-associated virus vectors，rAAV）的递送来介导动物细胞的基因编辑70，78。蛋 白 结 构 上 的 差 异 导 致 CRISPR/Cas12a 与CRISPR/Cas9在作用机制上有明显不同。主要有以下三点：Cas12a本身同时具有DNA和RNA内切酶活性，能够不依靠tracrRNA将前体crRNA加工050第 4 卷 为成熟的crRNA；Cas12a识别位于靶序列5端富含胸腺嘧啶的 PAM序列；Cas12a分别在靶DNA的PAM序列下游第23位核苷酸和互补链的第18位核苷酸处进行切割，产生具有45 bp的5突出端的黏性末端78，80图1（d）。高效的crRNA加工、独特的 PAM 识别序列以及黏性末端的产生使得CRISPR/Cas12a系统更有利于在富含AT且HR效率低的宿主中进行多重基因编辑，并在一定程度上与CRISPR/Cas9系统在特点上形成了互补。然而，类似的 PAM 局限、脱靶效应等问题同样存在于CRISPR/Cas12a系统中，针对该系统的进一步优化完善，对于凸显Cas12a蛋白的优势、提高人们对基因的编辑能力十分必要，也会为我们提供更加强大和多样化的基因编辑工具。1.3 CRISPR/Cas13a系统与上述两种Cas蛋白不同，Cas13a（先前称为C2c2）是一种RNA引导的靶向RNA的核酸酶。这图图1SpCas9、FnCas12a和LbaCas13a的结构组织和作用机制简图Fig.1Schematic diagrams for the structures and working mechanisms of SpCas9,FnCas12a and LbaCas13a051合成生物学 第 4 卷种类型CRISPR/Cas蛋白在识别单链靶RNA时被激活，因此可用于编辑操纵另一类重要的遗传物质RNA81-82。Cas13a 的蛋白结构同样也采用双裂片形式，包括REC叶和NUC叶。其中N末端域（N-terminal domain，NTD）和螺旋域1构成REC叶，用于负责crRNA 5端的固定；而NUC叶则由离散的高等真核生物和原核生物核苷酸结合域 1（higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding，HEPN1）、螺旋域 2、螺旋域 3和 HEPN2组成图1（c），其中HEPN域的激活被认为与靶RNA的识别有关，并进一步驱动蛋白构象的变化，产生复合的RNA酶活性位点82。然而由于Cas13a的HEPN域的激活机制尚未得到完全解释，使得基于Cas13a的RNA编辑工具的开发受到了限制。而鉴于Cas13a核酸酶家族在RNA检测以及可编码的RNA结合（如dCas13a，拥有突变的HEPN域，仅保留靶向结合RNA能力，可用于活细胞的RNA成像等用途81）方面有巨大的应用潜力，有必要针对该型 Cas蛋白的功能机制进行进一步的深入研究，这将有助于推动Cas13a作为RNA编辑工具的创新应用81-83。类似于其他 Cas蛋白对靶基因 PAM 序列的识别需求，大多数 Cas13a对靶 RNA的切割依赖于对3 H（A，U，C）前间隔侧翼序列（protospacer flanking sequence，PFS）的识别（来自于细菌 Leptotrichia wadei 的 Cas13a 是 一 个 例 外，不 需 要 PFS81）图1（d）。在准确识别PFS后，“crRNA-靶RNA”双链体结合在NUC叶带正电的中心通道中，同时Cas13a 蛋白发生显著的构象变化，进一步激活Cas13a蛋白HEPN域的催化位点，后者特异性切割单链靶RNA的尿嘧啶碱基，同时活化的Cas13a蛋白会延伸裂解附近非靶向 RNAs，这称为附带效应，该现象在真核生物细胞中尚未发现81，84。与Cas12a类似，Cas13a自身也具有独立的RNA酶活性，能自主加工CRISPR阵列，因此可用于多重编辑多个 RNA 序列。另外，附带效应的存在使得CRISPR/Cas13a系统可通过体内触发编程性的细胞死亡或者体外非特异性降解携带标记的RNA来检测特定RNA的存在。基于此，Gootenberg及其同事设计了可体外检测amol/L级的DNA或RNA分子的平台，称为SHERLOCK（Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），该平台通过核酸扩增和Cas13a介导的间接裂解报告RNA来检测释放的报告信号，从而可用于实时检测如寨卡病毒、登革热病毒等特定生物的靶标RNA或DNA分子83，85。类似的，Fozouni等开发了一种免扩增的CRISPR/Cas13a检测技术，可以在5 min内直接从一组鼻拭子样品中准确检测出SARS-CoV-2 RNA，且30 min测量时间内即可达到大约100拷贝/mL的灵敏度86。总的来说，对 CRISPR/Cas13a系统的开发为RNA引导靶向RNA的技术打开了大门，该技术可通过对特定 RNA转录物进行干扰、调节、修饰和监测，使得我们能够感测不同的细胞状态，操纵翻译以及跟踪RNA水平和在活细胞中的定位，有 助 于 有 效 增 进 我 们 对 RNA 分 子 生 物 学 的理解47，87。2 CRISPR/Cas系统的改造CRISPR/Cas系统在基因编辑、调控、检测等方面所取得的巨大成就，使人们对其在不同领域的应用有了更多的期望和想象。然而，CRISPR/Cas系统一些固有的特点，限制了其应用范围。以普遍使用的 CRISPR/Cas12a 为例：对 PAM 序列TTTN的识别限制了靶序列的选取，因此无法自由地对基因组不同位点进行操纵；严重的脱靶效应，则极大限制了该系统对基因的精准编辑或操控；此外Cas12a等Cas蛋白分子量仍较大，不利于通过细胞递送来介导基因编辑等30，38，88。诸如此类问题，使得CRISPR/Cas系统在医学、基因精准编程等领域的进一步发展受到了严重的限制，因此通过改造CRISPR/Cas系统来创建“理想”的基因编辑工具就成为当前的研究热点。下面我们着重介绍关于CRISPR/Cas系统的改造方法和一些突破性的进展。2.1 针对CRISPR/Cas系统自身的改造Cas 蛋白作为 CRISPR/Cas 系统的核心元件之一，其结构和作用机制在很大程度上决定了该系统的功能走向，因而针对Cas蛋白的工程化改造一直是优化提升CRISPR/Cas系统的关键。052第 4 卷 非理性进化是对Cas蛋白进行工程改造的常用方法。该方法利用随机突变构建包含大量Cas突变体的文库，然后通过有效的筛选策略，例如通过Cas蛋白介导可诱导编码毒素基因的质粒切割的细菌存活策略或基于人体细胞的EGFP报告基因干扰策略等，来获取正向有益突变，再进一步通过组 合 有 益 突 变 来 得 到 性 能 更 佳 的 Cas 突 变 体（图2）73，89-91。通过这种方式，Kleinstiver及其同事针对来源于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的Cas9（SaCas9）进行了进化筛选，获得了可识别PAM为NNNRRT的SaCas9突变体，命名为KKH SaCas9，该突变体对靶基因的识别能力在SaCas9（NNGRRT）的基础上扩展了24倍，对人类基因组有强大的编辑能力90。Gao等对源于氨基酸球菌（Acidaminococcus sp.）的Cas12a（AsCas12a）中靠近PAM双链序列识别域的60个氨基酸残基进行了盒式突变筛选，并将效果良好的单氨基酸突变点进行组合，最终获得了PAM识别序列分别为TYCV和TATV序列的RR（S542R/K607R）突变体和 RVR（S542R/K548V/N552R）突变体，在此基础上，再引入K949A点突变来去除极性残基与靶DNA 之间的非特异性接触从而增强靶向特异性，成功得到了既具有更大范围的PAM识别能力又具有更高保真性的突变体，这些突变也可直接用于其他 Cas12a 蛋白的改造，例如来源于毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium的LbCas12a35，89。图图2基于非理性进化的Cas蛋白改造策略示意图Fig.2Schematic diagram for random modifications of Cas proteins(The random modification strategy for Cas proteins contains following steps:Firstly,random mutagenesis,such as Error-prone PCR,PACE,PANCE,etc,are employed to generate variant libraries of Cas proteins.Secondly,effective assessments,such as plasmid interference-based depletion screening,human cell-based EGFP reporter assay,and so on,are applied to screen positive mutations.Finally,the positive mutations are combined for mutagenesis to develop more significant Cas variants.)053合成生物学 第 4 卷值得一提的是，Hu和 Miller等通过噬菌体辅助的持续进化（PACE）方法，对SpCas9进行了进化，筛选获得了 PAM 识别序列为 NG、GAA 和 GAT的突变体xCas9，该突变体与野生型SpCas9相比具有更为扩展的PAM识别能力和全基因组范围更低的脱靶率，这使得xCas9变体在人体细胞中应用于转录调控、基因敲除和单碱基编辑等的能力有了大幅提升92；类似地，Miller及其同事又通过噬菌体辅助非连续进化（PANCE）的方法和3种新的PACE筛选策略（即将SpCas9的进化轨迹分为3个独立的方向，分别选择不含有鸟嘌呤的 NAA、NAT和NAC这3种 PAM序列，来筛选可识别非经典 PAMs 序列的 SpCas9 突变体），获得了能识别PAM序列为NRNH（R是A和G，H是A、C和T）的3个新颖SpCas9突变体，摆脱了SpCas9对含有特定鸟嘌呤 PAM 序列识别的依赖，这 3 个新型SpCas9变体与先前报道的SpCas9变体一起，原则上可以实现靶向大多数 PAM 序列为 NR 的基因，显 著 扩 展 了 CRISPR/Cas9 系 统 对 基 因 的 靶 向能力93。随着人们对Cas蛋白三维结构和作用机制的深入认识，通过理性和半理性的方法对Cas蛋白进行工程化改造就逐渐成为一种优化提升CRISPR/Cas系统的有力手段。该方法以Cas蛋白的结构特点和催化原理为指引，对 Cas蛋白相应的结构域进行设 计 改 造，来 筛 选 性 能 更 为 优 异 的 Cas 变体30-31，35，37-38，94-95。鉴于“脱靶效应”和“PAM 约束”是当前影响CRISPR/Cas系统应用发展的核心问题，因此对 Cas蛋白的理性改造也大多围绕着“提高靶向特异性”和“扩展对PAM序列的识别范围”这两项内容展开。靶向特异性是CRISPR/Cas系统用于基因组精准编辑的前提。在Cas蛋白中，REC域与gRNA的识别密切相关，因此是改造提升CRISPR/Cas系统靶向特异性的重点区域61，63，78，80。Chen及其同事发现当 Cas9 识别与 gRNA 完全配对的靶基因时，REC3域能通过与RNA-DNA异源双链分子的相互作用，使得Cas9的构象发生变化并进而使HNH域处于激活状态，从而介导准确的切除反应94。据此Chen通过组合突变REC3域的4个残基和HNH-RuvC连接处的1个残基，成功改造出新的具有高保 真 性 的 Cas9 变 体 HypaCas9，该 突 变 体 包 含N692A/M694A/Q695A/H698A四个点突变，在基因编辑活性未发生明显变化的情况下，在人类基因组中的靶向特异性得到了显著的提升94。除了REC 域外，Slaymaker 和 Gao 等发现在 SpCas9 的HNH域、RuvC域和 PAM 识别域之间有一个带正电荷的凹槽，可能与稳定靶 DNA的互补链有关，使该非靶向DNA链凹槽（nt-groove）中带的正电荷残基中性化可能会增强Cas蛋白靶向DNA的特异性（图3）35。因此Slaymaker和Gao等对非靶向DNA链凹槽的31个带正电荷的残基进行了丙氨酸替换筛选，之后又对筛选位点进行了组合突变，获得了具有高保真性的Cas9突变体eSpCas9（1.0）和eSpCas9（1.1），这两个突变体分别包含突变点K810A/K1003A/R1060A 和 K848A/K1003A/R1060A。图图3SpCas9解开靶DNA链双螺旋结构后DNA链与非靶向DNA链凹槽的电荷分布模型图35Fig.3Model for charge distribution on DNA and the nt-groove after SpCas9 unwinds the double helix structure of targeted DNA strands35(Positively charged grooves among the HNH(purple),RuvC(green),and PI domains(gray)in SpCas9 play a key role in stabilizing the non-target strand of the target DNA by DNA interactions.Then,the SpCas9 complex can readily target paired DNA strands through complementation to drive DNA unwinding and prevent re-hybridization of DNA double strands.)054第 4 卷 相同的改造策略也成功应用于其他Cas9同系蛋白和Cas12a蛋白，例如SaCas9蛋白和AsCas12a，在不改变Cas核酸酶活性的同时，均显著提升了Cas蛋白靶向基因的特异性35，89。类似的，Kleinstiver及其同事通过分析SpCas9-sgRNA-靶DNA复合物，发现SpCas9有4个残基（N497、R661、Q695、Q926）直接与靶DNA链的磷酸骨架形成氢键，推测可通过减少SpCas9蛋白与靶DNA位点的非特异性相互作用使SpCas9的脱靶效应最小化，故而构建了15个包含有N497A、R661A、Q695A和Q926A组合突变体文库，最终确认包含 N497A、R661A、Q695A和 Q926A 全部 4 个突变点的 SpCas9 变体 SpCas9-HF1拥有最好的全基因组编辑特异性并保有较高的靶向切割活性95。值得一提的是，上述这些高保真Cas9变体的构建策略迥异，变体之间还缺少在同一标准化应用场景下的并行比较28，96，哪一种变体的应用效果更佳还需进一步评估。更为重要的是，能否对这些变体进行组合形成保真性更高的Cas9变体还值得进一步研究。另外，对Cas蛋白可识别的PAM序列进行扩展，增加可识别的PAM序列在目标基因组中的概率，是解除PAM束缚，扩大CRISPR/Cas系统编辑能力的关键。Walton及其同事以SpCas9的变体SpCas9-VRQR为基础，通过以结构为指导的工程化改造策略，联合高通量 PAM 测定分析法（HT-PAMDA），获得了PAM识别序列为NGN的突变体SpG（D1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/R1335Q/T1337R），并通过结构分析发现将 R1333替换为谷氨酰胺，可能使SpG识别的PAM由NGN变为NAN，因此在SpG的基 础 上，进 一 步 联 合 突 变 R1333Q、L1111R、A1322R以及PI结合域的正电荷残基，获得了可识别 PAM 序列为 NRN（R 为 A/G）和 NYN（Y 为C/T）的突变体SpRY（SpG+L1111R/A1322R/R1333P/A61R/N1317R）31。分析表明SpRY不仅能够有效靶向编辑大多数带有 NRN 序列的靶基因，也能够对带有NYN序列的靶基因进行编辑，尽管其平均编辑能力约为前者的一半，但相较于无法编 辑 PAM 为 NYN 的 靶 基 因 的 野 生 型 SpCas9，SpRY 对 PAM 序列的兼容性有了大幅提高，NRN和NYN的组合涵盖了大多数的PAM序列，这意味着 SpRY 变体在一定程度上摆脱了对特定 PAM 序列进行识别的需求，即 SpRY 可以不受特定 PAM的