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药敏试验方法简介药敏试验方法简介 耐药菌问题日益严重耐药菌问题日益严重“目前药物失去作用的速度与科学家发目前药物失去作用的速度与科学家发现新药物的速度差不多。现新药物的速度差不多。”摘自摘自WHOWHO报告报告抗微生物治疗面临的困境抗微生物治疗面临的困境抗药性问题始终存在抗药性问题始终存在细菌不断获得新的耐药机制细菌不断获得新的耐药机制以往对付耐药性的策略收效不显以往对付耐药性的策略收效不显一、一、抗菌药物敏感试验抗菌药物敏感试验（AST）n预测抗菌治疗的效果；预测抗菌治疗的效果；n指导抗菌药物的临床应用；指导抗菌药物的临床应用；n发现或提示细菌耐药机制的存在，指导合发现或提示细菌耐药机制的存在，指导合理用药，避免产生或加重细菌的耐药；理用药，避免产生或加重细菌的耐药；n监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行。耐药菌感染的发生和流行。（1）抗菌药物的选择）抗菌药物的选择n在我国主要遵循临床实验室标准化委员会在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的抗菌药物选择原则）制定的抗菌药物选择原则A组：对特定菌群常规测试并报告的药物组：对特定菌群常规测试并报告的药物 B组：可常规测试、选择性报告的药物组：可常规测试、选择性报告的药物C组：替代性或补充性药物组：替代性或补充性药物U组：仅用于泌尿道感染的抗菌药物组：仅用于泌尿道感染的抗菌药物葡萄球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组葡萄球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组葡萄球菌属抗菌药物A组苯唑西林（头孢西丁纸片）、克林霉素、青霉素、红霉素、复方新诺明、B组四环素、万古霉素、利奈唑胺C组环丙沙星、庆大霉素、氯霉素、奎奴普汀/达福普汀U组氧氟沙星、呋喃妥因、磺胺异恶唑、甲氧苄啶肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组肠杆菌科抗菌药物敏感试验推荐分组肠杆菌属抗菌药物A组氨苄西林、头孢唑林、庆大霉素B组阿米卡星、奥格门丁、哌拉西林+他唑巴坦、头孢呋新、头孢吡肟、头孢西丁、环丙沙星、亚安培南、哌拉西林、复方新诺明C组头孢他啶、氯霉素、氨曲南、四环素U组羧苄西林、氧氟沙星、呋喃妥因假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组假单胞菌属的抗菌药物药物敏感推荐分组假单胞菌抗菌药物A组头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林B组阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、环丙沙星、亚安培南、哌拉西林+他唑巴坦C组U组氧氟沙星不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组不动杆菌属的抗菌药物药敏试验推荐分组不动杆菌属抗菌药物A组氨苄西林/舒巴坦、头孢他啶、亚胺培南、环丙沙星、庆大霉素B组阿米卡星、哌拉西林+他唑巴坦、头孢吡肟、头孢噻肟、复方新诺明、哌拉西林、四环素肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组肠球菌属抗菌药物药敏试验推荐分组 肠球菌属抗菌药物A组氨苄西林、青霉素B组万古霉素、利奈唑胺C组庆大霉素(120g)、链霉素(300g)U组环丙沙星、四环素、呋喃妥因肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组肺炎链球菌抗菌药物药敏试验推荐分组肺炎链球菌抗菌药物A组青霉素、苯唑西林(1g)、红霉素、复方新诺明B组万古霉素、克林霉素、四环素、氧氟沙星C组氯霉素、利奈唑胺n药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的药敏试验的折点亦遵照每年最新公布的CLSI标准进行，分为敏感（标准进行，分为敏感（S）、耐药）、耐药（R）和中介（）和中介（I）。）。n敏感：分离菌株能被测试药物使用推荐剂敏感：分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓量时在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制度所抑制n耐药：分离菌株不能被测试药物常规剂量耐药：分离菌株不能被测试药物常规剂量可达到的药物浓度所抑制；分离菌株可能可达到的药物浓度所抑制；分离菌株可能存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠药物对分离菌株的临床疗效不可靠耐药治疗无效；敏感耐药治疗无效；敏感治疗有效治疗有效二、二、抗菌药物的种类及作用机制抗菌药物的种类及作用机制三、药敏试验方法学三、药敏试验方法学纸片扩散法（纸片扩散法（K-B法）法）稀释法（稀释法（MIC法）法）肉汤稀释法肉汤稀释法常量稀释法常量稀释法微量稀释法微量稀释法琼脂稀释法琼脂稀释法E-test法法1.手工试验手工试验2.2.自动仪器药敏系统自动仪器药敏系统 纸片扩散法（纸片扩散法（K-B法）法）n原理：抑菌圈的大小反映受试菌对测定药原理：抑菌圈的大小反映受试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈呈负相关。负相关。耐药耐药 中介中介 敏感敏感RISLog2.MIC d1 d2 抑菌圈直径（抑菌圈直径（mm)MIC与抑菌圈直径的线性关系与抑菌圈直径的线性关系1.准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白（准备抗菌药物纸片和水解酪蛋白（M-H）培养基；）培养基；2.挑取孵育挑取孵育16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至管中，振荡混匀后校正浓度至0.5麦氏标准；麦氏标准；3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液菌液，然，然后在后在MH琼脂表面均匀涂布接种琼脂表面均匀涂布接种3次，每次次，每次旋转平板旋转平板60度度，最后沿平板内缘涂抹最后沿平板内缘涂抹1周周；4.平板在室温下干燥平板在室温下干燥35min，用无菌镊子或商品化，用无菌镊子或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面；的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面；5.35孵育孵育1624小时，量小时，量取抑菌圈直径；取抑菌圈直径；6.根据抑菌环的直径，按照根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、标准判读，报告敏感、中介、耐药。中介、耐药。2024/5/20 周一23CLSI对对K-B法的标准化规定法的标准化规定n纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、纸片药物含量、细菌接种浓度、培养基、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、平皿厚度、孵育时间、环境、判定标准、质控方法等；常规测试、报告的抗生素。质控方法等；常规测试、报告的抗生素。n不同的药判定标准不同；不同的菌判定标不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。准也不同。2024/5/20 周一扩散法药敏影响因素扩散法药敏影响因素n培养基pH值7.2-7.4营养程度（肠球菌能生长）厚度抗生素拮抗剂含量（用29212监控）钙镁离子含量、锌离子含量（用27853氨基糖苷类和亚胺配能结果监控）n菌悬液浓度高抑菌环缩小（假耐药）浓度低则扩大（假敏感）细菌纯度气体环境普通细菌放CO2时由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药苛养菌放普通环境生长不良，导致假敏感培养时间粘液性铜绿需48小时测量方法稀释法稀释法n以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培以一定浓度的抗菌药物与含有受试菌的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），培养倍稀释），培养1624h后，通过观察细菌后，通过观察细菌生长现象来测得药物对受试菌的最低抑菌生长现象来测得药物对受试菌的最低抑菌浓度（浓度（MIC）。）。2024/5/20 周一稀释法（稀释法（MIC法）法）nMIC法：分为常量法和微量法常量法：肉汤稀释法、琼脂稀释法微量法：微量肉汤稀释法p简化双浓度折点法 ATB药敏p简化常规浓度分布MIC法 BD、德灵药敏p动力学计算MIC法 VITEK32、VITEK2药敏肉汤稀释法肉汤稀释法l不生长不生长=抗生素抑制细菌生长抗生素抑制细菌生长 l生长生长=抗生素无法抑制细菌生长抗生素无法抑制细菌生长MIC(最小抑菌浓度最小抑菌浓度)=抗生素可抑制细菌生长抗生素可抑制细菌生长的最小浓度。的最小浓度。.250.512481632MIC=8Increasing Antibiotic Conc.常量稀释法常量稀释法n药敏试验的参考方法：将标准接种物加入含対倍稀释抗生素的MH肉汤管中.过夜培养.MIC 即是能抑制细菌生长的含最低抗生素的浓度的那一管所标示的浓度值(琼脂稀释法是将対倍稀释后的抗生素加入融化后平衡到50的MHA中再倾制平皿，接种物为一定大小的斑点，浓度也为104CFU/ml).解释标准(S or R)是建立在体内可达到的抗生素浓度水平上104 cfu/ml4210.5 0.25 0.120 g/ml微量肉汤稀释法微量肉汤稀释法n接种后应充分混匀，但不能有气泡产生n静置培养n培养温度；35n气体环境：所有细菌（包括苛养菌）均置大气环境；厌氧菌置厌氧环境；微需氧菌置微需氧环境；淋菌琼脂稀释法置CO2n培养时间：18小时n药敏结果报告可用药敏结果报告可用MIC（g/ml）或对照）或对照CLSI标准用标准用S、R和和I报告。报告。n对于稀释法的批量试验，有时需要报告对于稀释法的批量试验，有时需要报告MIC50、MIC90。2024/5/20 周一稀释法药敏影响因素稀释法药敏影响因素n培养基pH值 7.2-7.4营养程度抗生素拮抗剂含量钙镁离子含量（钙10-25；镁10-12.5g/ml）n菌悬液（5104CFU/ml）接种效应n浓度高MIC抬高n浓度低MIC压低细菌纯度气体环境所有需氧细菌均放普通大气环境。如果放CO2，由于碳酸的影响，药物活性受到影响，形成假敏感或假耐药培养时间真菌需48小时奴卡菌需5天E-test法法n将稀释法和扩散法的原理结合起来，直接将稀释法和扩散法的原理结合起来，直接测定药物对受试菌的测定药物对受试菌的MIC。2024/5/20 周一MIC 值标注于试值标注于试条的光面条的光面Etest 试条试条毛面贴于毛面贴于MHA上上Etest 操作程序操作程序按照扩散法标准操作涂布接种贴上试条并培养15-18小时读取抑菌浓度并按标准解释 细菌生长区细菌生长区E试条试条细菌生长抑制区细菌生长抑制区 256 128 80.16判读判读MIC2024/5/20 周一肺炎链球菌肺炎链球菌青霉素青霉素 MIC=3 g/ml 结果读取结果读取BD PhoenixTM-100 凤凰全自动细菌鉴定凤凰全自动细菌鉴定凤凰全自动细菌鉴定凤凰全自动细菌鉴定/药敏检药敏检药敏检药敏检测系统测系统测系统测系统最大的标本容量：对最大的标本容量：对100个标本同时进行个标本同时进行鉴定与药敏测试！鉴定与药敏测试！鉴定部分：鉴定部分：l51孔鉴定实验孔鉴定实验l改良经典实验改良经典实验l显色荧光检测显色荧光检测l无需附加实验与试剂无需附加实验与试剂药敏部分：药敏部分：l85孔药敏实验孔药敏实验l比浊氧化还原（专利）比浊氧化还原（专利）l实测倍比稀释实测倍比稀释MIC值值l药物种类与浓度梯度最多药物种类与浓度梯度最多l耐药机制检测同步进行耐药机制检测同步进行封闭式设计，安全无泄漏封闭式设计，安全无泄漏先进的鉴定先进的鉴定/药敏复合板设计药敏复合板设计PhoenixTM100鉴定板革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合革兰氏阳性板、革兰氏阴性板生化反应组合革兰氏阳性菌鉴定板革兰氏阳性菌鉴定板革兰氏阴性菌鉴定板革兰氏阴性菌鉴定板鉴定部分：鉴定部分：l51孔鉴定实验孔鉴定实验,改良经典实验改良经典实验l显色荧光检测显色荧光检测,无需附加实验与试剂无需附加实验与试剂鉴定实验方法鉴定实验方法n在研究了上百种反应底物基础上，选择了在研究了上百种反应底物基础上，选择了45种反应底物。种反应底物。n检测板每检测板每20分钟检测一次分钟检测一次Green,blue and red 检测显色反应检测显色反应UV light检测荧光反应检测荧光反应panelpanelPhoenix工作流程工作流程 从经过夜纯培养的新鲜平板上挑取菌落Phoenix工作流程工作流程 在ID肉汤中制成标准浊度（0.50.6麦 氏单位）的菌悬液 加一滴AST指示剂到AST肉汤中 Phoenix工作流程工作流程 从ID肉汤管中准确吸取25 L菌悬液，加入到AST肉汤中Phoenix工作流程工作流程 将肉汤倒入检测板，盖盖子。检测板 已准备好，可以上机检测。Phoenix工作流程工作流程巧巧妙妙的的重重力力加加样样技技术术 扫描板条，输入资料Phoenix工作流程工作流程 将检测板放入仪器（随意位置）Phoenix工作流程工作流程u仅需区别革兰氏染色即可选板u板条种类齐全：鉴定板、药敏板、鉴定药敏复合板u同时提供独立密封包装的鉴定肉汤和药敏肉汤，无需用户配制。u试剂常温保存配套试剂配套试剂n强大软件支持：BDXpert微生物专家系统帮助解释和监测检测结果n检测结果分别可分别传入LIS系统或BD Epicenter数据管理系统或打印机，并能进行各种统计学分析强大的软件系统强大的软件系统n鉴定能力鉴定能力n 革兰氏阳性菌鉴定180种n 革兰氏阳性球菌n 革兰氏阳性杆菌n 革兰氏阴性菌鉴定200种n 革兰氏阴性发酵杆菌n 革兰氏阴性非发酵杆菌n无需附加实验无需附加实验n95-96%准确性准确性鉴定时间鉴定时间 minimum 1:26 hr maximum 12:25 hr average 3:24 hr median 2:26 hr 95th%6:26 hr优异的鉴定性能优异的鉴定性能检测反应孔内微生物生长情况检测反应孔内微生物生长情况浊度浊度（传统方法）：（传统方法）：微生物生长形成小颗粒和聚集成团块微生物生长形成小颗粒和聚集成团块 氧化还原作用氧化还原作用（BD专利技术）专利技术）：通过药敏实验指示剂颜色变化检测微生物的新陈代谢通过药敏实验指示剂颜色变化检测微生物的新陈代谢浊度与氧化还原的变化通过红、蓝、绿光每浊度与氧化还原的变化通过红、蓝、绿光每20分钟检测一次分钟检测一次 药敏实验方法药敏实验方法n药敏种类与时间药敏种类与时间葡萄球菌属链球菌肠球菌属肠杆菌属其他革兰氏阴性杆菌GN-90%in 5 HrsGP-80%in 6 Hrs药敏特点药敏特点对倍稀释药物浓度真正的MIC检测延迟耐药检测急诊报告快速完成功能 耐药检测无需附加板条耐药检测无需附加板条 自动检测自动检测18种耐药机制种耐药机制产超广谱产超广谱Beta内酰胺酶检测内酰胺酶检测(ESBL)耐甲氧西林葡萄球菌检测耐甲氧西林葡萄球菌检测(MRS)链霉素高耐株检测链霉素高耐株检测(HLSR)庆大霉素高耐株检测庆大霉素高耐株检测(HLGR)耐万古霉素肠球菌检测耐万古霉素肠球菌检测(VRE)产产Beta内酰胺酶革兰氏阳性菌检测内酰胺酶革兰氏阳性菌检测优异的药敏性能优异的药敏性能仪器判读结果仪器判读结果n仪器自动记录每次判读的每个反应孔的结果。仪器自动记录每次判读的每个反应孔的结果。n将反应结果与上一次判读结果进行比较。将反应结果与上一次判读结果进行比较。n当两次结果没有差别，则该反应结束。当两次结果没有差别，则该反应结束。n内置的运算法则：颜色比率的变化内置的运算法则：颜色比率的变化n依时间而变的数据库：依时间而变的数据库：2 2、3 3、4 4、6 6、1212小时，依据每小时，依据每个测试周期的判读结果产生个测试周期的判读结果产生“百分比图百分比图”，如获得足，如获得足够的信息，则给出鉴定结果。够的信息，则给出鉴定结果。n标准菌量标准菌量,可信度可信度9090，给出结果。，给出结果。BDXpert微生物专家系统微生物专家系统鉴定实验鉴定实验BDXpert专家专家系统系统 -NCCLS -DIN -SFM -BD Rules报告报告 -ID -MI -Rule set SIR -BDXpert SIR -特殊信息特殊信息 药敏实验药敏实验BDXpert微生物专家系统目的微生物专家系统目的n对药敏结果进行解释与修正，保证药敏实验结果准确可靠，从而指导临床正确进行抗感染治疗 专家规则来自于：已确定的标准（NCCLS,DIN,SFM)药物研发单位的文献资料已广为接受的文献资料和经验持续更新BDXpert微生物专家系统规则的应用微生物专家系统规则的应用nSIR结果的解释来自于专家系统规则的设置NCCLS,DIN,SFM,Customn药物分级规则n天然耐药和天然敏感规则n耐药标记规则肠杆菌科：ESBL葡萄球菌：MRS,beta-内酰胺酶(GP BL)肠球菌：VRE,HLGR,HLSR举例：举例：SIR解释解释 规则规定 肠杆菌科细菌Ampicillin breakpoints:S8 (I=16)R32Ref:Table 2A(NCCLS M100-S12,2002)Phoenix 显示如果 待检菌是肠杆菌科细菌，且药物为 ampicillin，MIC=2 那么 结果显示为“S”BDXpert微生物专家系统规则的应用微生物专家系统规则的应用举例：天然耐药举例：天然耐药规则规定规则：C.freundii 在体内对ampicillin和 amoxicillin天然耐药Ref:Brown.et,al.1989J.Antimicrob.Chemother.Phoenix显示如果 待检菌是C.freundii且 AM is“S”or“I”或 AMX is“S”or“I”那么 将AM or AMX 结果改为“R”，且报告显示该待检菌是对该抗生素天然耐药；检查鉴定结果和待检菌是否纯BDXpert微生物专家系统规则的应用微生物专家系统规则的应用结果显示结果显示 鉴定结果(用户可修改)MIC值来自标准的解释BDXpert 专家系统SIR结果最终结果 (用户可修改)鉴定及药敏结果显示鉴定及药敏结果显示中文报告系统中文报告系统TCP/IP 以太网以太网EpiCenter 工作站工作站PhoenixID/ASTBACTEC 9000Blood CulturingBACTECMGIT 960LIS I/FBDProbeTec ET高级中央数据管理系统高级中央数据管理系统仪器特点仪器特点n同时进行100个样本的鉴定/药敏测试n独特的加样方式，准确均匀n图形界面，仪器操作简单n完备的细菌菌种库n药敏实验准确，真正的MIC检测n多种细菌耐药机制的检测，延迟耐药检测，无须附加实验n完善的专家系统，保障药敏结果的准确性，内置多种标准规则（NCCLS，DIN，SFM）nLIS 接口，适应实验室联网需求n系统无需特别的维护n有中文统计报告软件