ClassⅡb细菌素PlnJK在乳酸乳球菌中的分泌表达和抑菌模式研究.pdf

浙江工商大学硕士学位论文Cl assIIb细菌素P l n JK在乳酸乳球菌中的分泌表达和抑菌模 式研究摘要乳酸菌细菌素是一类在乳酸菌发酵代谢过程中由核糖体产生的 具有抗菌作用的天然蛋白质或多肽类物质，对与产生菌株同源性较近 的菌株具有抑制作用，但产生菌株对其自身产生的细菌素具有免疫 性。乳酸菌细菌素因具有安全、高效、无污染、无抗药性等优点，受 到人们的广泛关注，日益成为许多学者研究的焦点，有望开发成为新 型的绿色食品防腐剂或抗菌药物。目前人们发现的细菌素已超过上百种，但是只有Nisin和其它少数 几种细菌素被允许作为食品添加剂使用。然而Nisin只对革兰氏阳性 菌起作用，这极大地限制了它的应用。与Nisin相比，部分Cl ass II类 的细菌素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌效果，其应用潜力 巨大，受到国内外许多研究学者的青睐。本研究对象为Cl assIIb细菌素P l n JK（单肽为P l n J和P l n K）。Cl ass Hb细菌素P l n JK在单肽P l n J和P l n K以等摩尔浓度混合时，其抑菌效果 最强。本研究利用食品级乳酸乳球菌高效表达系统NICE,以分泌型 表达载体P NZ8124分泌表达P l n J和P l n K,并通过一系列分离纯化制备 高纯度的P l n J和P l n K,研究其抑菌活性和抑菌机制，为Cl ass 11b细菌 素P l n JK在食品及其它领域中的应用提供理论基础。具体研究结果概浙江工商大学硕士学位论文括如下:1、0加J和0加K的基因克隆与表达。根据本实验室分离得到的植 物乳杆菌ZJ316中夕历J和0加K的基因序列，在其序列两端分别添加 EcoR V和TVco I两个酶切位点，构建重组表达质粒pNZ81242历J和 pNZ8124-p历K,并利用电击转化法转化至乳酸乳球菌表达菌株 Lactococcus lactis NZ9 000o 经Nisin诱导后，Tr ic in e-SDSP AGE验证表 明：Nisin能够诱导重组蛋白pNZ8124-P l n J和pNZ8124P l n K的表达。2、重组蛋白pNZ8 124-PlnJ和pNZ8 124PlnK诱导条件优化。从诱 导温度、诱导剂浓度和诱导时间三个方面对重组蛋白在NICE中的诱 导条件进行优化，确定最佳诱导条件为：重组蛋白pNZ8124-P l n J最佳 诱导温度30,Nisin浓度1 n g/mL,诱导时间6 h；重组蛋白 pNZ8124-P l n K最佳诱导温度30,Nisin浓度5 n g/mL,诱导时间6小3、PlnJ和PlnK的分离纯化。根据重组蛋白pNZ8124-P l n J和 pNZ8124-P l n K的特性，确定了一系列的分离纯化方法：（1）利用 XAD-2大孔树脂，对蛋白发酵上清液进行初步纯化，同时收集有活 性的75%甲醇的洗脱液，确定洗脱液中有重组蛋白的存在；（2）利 用SP强阳离子柱，对重组蛋白进一步进行纯化，并通过超滤离心管对 洗脱液脱盐浓缩；（3）利用制备型高效液相色谱（HP LC）对重组蛋 白进行高度纯化，并通过分析型HP LC对分离得到的蛋白P l n J和P l n K 进行纯度分析，得到纯度均在98%以上的蛋白样品。利用BCA法测定 蛋白P l n J和P l n K的浓度，分别为2.215 mg/mL和2.855 mg/mLo4、PlnJ、PlnK和PinJK抑菌活性研究和抑菌机制初探。结果表 浙江工商大学硕士学位论文明细菌素P l n J、P l n K和P l n JK抑菌谱较广，不仅对柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌、单增李斯特菌等革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，对沙 门氏菌、副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有较好的抑制效果。细菌素 P l n J、P l n K和P l n JK对沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）,分别为3.212.8和1.6 pMo结果表明P l n JK的抑菌活性明显高于单肽P l n J 或P l n K,说明单肽P l n J和P l n K起协同作用。荧光泄露试验结果表明细 菌素P l n JK的抑菌方式可能是造成靶细胞膜的破裂，使得胞内内容物 流出，最终导致靶细胞的死亡。关键词：P l n JK；NICE异源表达系统；分离纯化；抑菌活性；抑菌机 制m浙江工商大学硕士学位论文SECRETORY EXP RESSION OF Cl ass II b BACTERIOCIN P LNJK IN LACTOCOCCUS LACTIS AND STUDY ON THEANTIBACTERIAL MECHANISMABSTRACTLac tic ac id bac ter ia(LAB)bac ter io c in s ar e r ibo so mal l y syn th esized an timic r o bial peptides o r pr o tein s du r in g f er men tatio n an d metabo l ism o f LAB.Th ey h ave in h ibito r y ef f ec t o n th e str ain with c l o se h o mo l o g y to th e pr o du c e bac ter ia,bu t th e str ain itsel f h as its o wn immu n ity to bac ter io c in s.Lac to bac il l u s bac ter io c in h as been paid mo r e an d mo r e atten tio n bec au se o f its advan tag es o f saf ety,h ig h ef f ic ien c y,n o po l l u tio n,n o dr u g r esistan c e an d so o n.It is expec ted to be a n ew type o f g r een f o o d pr eser vative o r an tibac ter ial dr u g s.Nisin an d a f ew o th er bac ter io c in s ar e al l o wed to u se as f o o d additive c u r r en tl y in spite o f th e f ac t th at mo r e th an o n e h u n dr ed spec ies o f bac ter io c in h ave been f o u n d o ver th e wo r l d.Ho wever,sin c e Nisin wo r ks o n l y ag ain st g r am-po sitive bac ter ia,th is g r eatl y l imits its appl ic atio n s.Co mpar ed with Nisin,so me Cl ass II ar e a kin d o f bac ter io stasis o f Gr am-po sitive bac ter ia an d Gr am-n eg ative bac ter io c in s,an d its appl ic atio n po ten tial is h u g e,wh ic h is f avo r ed by man y sc h o l ar s o ver th e wo r l d.浙江工商大学硕士学位论文Ou r stu dy f o c u sed o n th e Cl ass II b two-peptide bac ter io c in P l n J/K(c o n tain in g two peptides,P l n J an d P l n K).Th e bac ter io static ef f ec t o f P l n JK was str o n g est wh en P l n J an d P l n K wer e mixed in equ imo l ar c o n c en tr atio n.In th is stu dy,th e pl asmid pNZ8124 was sel ec ted as th e sec r eto r y expr essio n vec to r,an d P l n J an d P l n K wer e sec r eted an d expr essed in n isin-c o n tr o l l ed g en e expr essio n(NICE)system.Th e h ig h pu r ity P l n J an d P l n K wer e pr epar ed by a ser ies o f iso l atio n an d pu r if ic atio n meth o ds,an d th en stu dy th e bac ter io static mec h an ism,wh ic h pr o vided th e th eo r etic al basis f br th e appl ic atio n o f Cl ass II b bac ter io c in P l n JK in f o o d an d o th er f iel ds.Th e r esu l ts ar e as f o l l o ws:1.Cloning and expression of p加J and plnK.Th e r ec o mbin an t pl asmids pNZ8124-p历J an d pNZ8124-p/n K wer e c o n str u c ted ac c o r din g to th e sequ en c e o f pin an d plnK f r o m Lactobacillus plantarum ZJ316 o btain ed in o u r l abo r ato r y.EcoR V an d Neo I dig estio n sites wer e added at bo th en ds o f th e sequ en c e,an d tr an sf o r med in to Lactococcus lactis NZ9 000 by el ec tr o po r atio n.Th e expr essio n o f r ec o mbin an t pr o tein s wer e in du c ed by Nisin an d an al ysed by Tr ic in e-SDS-P AGE.2.Optimization of induction conditions of recombinant proteins pNZ8 124-PInJ and pNZ8 124-PlnK.Th e in du c tio n c o n ditio n s o f r ec o mbin an t pr o tein s wer e o ptimized f r o m th r ee aspec ts:in du c tio n temper atu r e,in du c er c o n c en tr atio n an d in du c tio n time.Th e o ptimal v浙江工商大学硕士学位论文temper atu r e f br in du c tio n o f r ec o mbin an t pr o tein pNZ8124-P l n J was 30,th e c o n c en tr atio n o f Nisin was 1 n g/mL,an d th e in du c tio n time was 6 h.Th e o ptimal in du c tio n temper atu r e o f th e r ec o mbin an t pr o tein pNZ8124-P l n K was 30,th e c o n c en tr atio n o f Nisin was 5 n g/mL,an d th e in du c tio n time was 6 h.3.Purification of PlnJ and PlnK.A ser ies o f iso l atio n an d pu r if ic atio n meth o ds wer e establ ish ed ac c o r din g to th e pr o per ties o f th e r ec o mbin an t pr o tein s pNZ8124-P l n J an d pNZ8124-P l n K:(1)Th e pr o tein su per n atan t was extr ac ted by XAD-2 mac r o po r o u s r esin,an d 75%meth an o l ac tive el u ate was c o l l ec ted.(2)Th e r ec o mbin an t pr o tein s was f u r th er pu r if ied by SP str o n g c atio n c o l u mn,an d th e el u en t was desal ted an d c o n c en tr ated by u l tr af il tr atio n c en tr if u g e tu be;(3)Th e r ec o mbin an t pr o tein s was pu r if ied by h ig h r ever e-ph ase HP LC,an d th e pu r if ied P l n J an d P l n K wer e an al yzed by an al ytic al HP LC to o btain pr o tein sampl es with pu r ity abo ve 9 8%.Th e c o n c en tr atio n o f P l n J an d P l n K,measu r ed by BCA P r o tein Assay Kit,was 2.215 mg/mL an d 2.855 mg/mL.4.The Antibacterial activity and antimicrobial mechanism of PlnJ,PlnK and PlnJK.Th e r esu l ts sh o wed th at bac ter io c in P l n J,P l n K an d P l n JK h ad a br o ad spec tr u m o f in h ibito r y ac tivity ag ain st g r am-po sitive bac ter ia su c h as Staphylococcus aureus,Micrococcus luteus an d Listeria monocytogenes,bu t al so h ad a g o o d in h ibito r y ef f ec t o n Salmonella,Vibrio parahaemolyticus an d o th er Gr am-n eg ative VI浙江工商大学硕士学位论文bac ter ia.Th e min imu m in h ibito r y c o n c en tr atio n s(MICs)o f bac ter io c in s P l n J,P l n K an d P l n JK ag ain st Salmonella wer e 3.2|1M,12.8 an d 1.6 piM,r espec tivel y.Th e r esu l t in dic ates th at P l n JK h as str o n g er an timic r o bial ac tivity th an P l n J o r P l n K.Fl u o r esc en t l eak assay in dic ates th at bac ter io c in P l n JK kil l sen sitive bac ter ia by per meabil izin g its membr an e,c au sin g ef f l u x o f in tr ac el l u l ar mater ial ac r o ss th e tr an smembr an e po r e,even tu al l y l eadin g to c el l death.KEYWORDS:P l n JK;NICE h eter o l o g o u s expr essio n system;P u r if ic atio n;An timic r o bial ac tivity;Mo de o f ac tio nvn浙江工商大学硕士学位论文目录第一章绪论.11.1 研究背景.11.2 乳酸菌细菌素.21.2.1 乳酸菌细菌素简介及分类.21.2.2 乳酸菌细菌素的作用机制.41.2.2.1 羊毛硫细菌素的作用机制.41.2.2.2 Cl ass II细菌素的作用机制.51.2.2.3 Cl assIII细菌素的作用机制.61.2.3 乳酸菌细菌素的应用.71.2.3.1 乳酸菌细菌素在食品工业的应用.71.23.2乳酸菌细菌素在生物医药方面的应用.8123.3乳酸菌细菌素在畜牧业方面的应用.81.3 细菌素 P l n J 和 P l n K.91.3.1 植物乳杆菌素基因座简介.91.3.2 细菌素P l n J和P l n K生物信息学分析.111.3.2.1 P l n J 和 P l n K 的一级结构.111.3.2.2 P l n J和P l n K理化性质预测.111.3.23 P l n J和P l n K二级结构预测.121.3.2.4 P l n J和P l n K疏水性分析.131.3.3 细菌素P l n J和P l n K研究现状.141.4 乳酸菌的食品级表达系统NICE.151.4.1 乳酸菌食品级表达系统（NICE）的简介.161.4.1.1 食品级的诱导剂Nisin.161.4.1.2 食品级的宿主菌和表达载体.171.4.2 NICE作用机制.171.4.3 乳酸乳球菌表达系统的应用.181.4.3.1 乳酸菌表达系统在食品工业上的应用.18VIII浙江工商大学硕士学位论文143.2乳酸菌表达系统在医药卫生行业上的应用.191.5本课题研究目的及内容.19第二章P l n J和P l n K乳酸乳球菌表达菌株的构建.212.1 前言.212.2 实验材料和仪器.212.2.1 菌种和质粒.212.2.2 试剂.212.2.3 培养基及相关溶液配制.222.2.4 主要仪器.222.3 实验方法.232.3.1 目的片段的设计与合成.232.3.2 重组质粒的构建流程.242.3.3 质粒pNZ8124的提取.252.3.4 目的片段和质粒载体双酶切.252.3.5 目的片段和质粒连接.262.3.6 连接产物的转化.272.3.6.1 E.c o ZzMC1061 感受态的制备.2723.6.2 热击法转化 E.c o/i MCI061.282.3.7 阳性转化子的筛选.282.3.7.1 引物设计.28237.2菌液P CR鉴定.282.373转化子的酶切及测序.292.3.8乳酸乳球菌表达菌株的构建.302.3.8.1乳酸乳球菌NZ9 000感受态的制备.3023.8.2 乳酸乳球菌感受态细胞的电击转化.312.4结果与分析.312.4.1 琼脂糖凝胶电泳检验.312.4.2 目的片段和质粒载体双酶切.322.4.3 阳性转化子的筛选与鉴定.33IX浙江工商大学硕士学位论文2.431 菌液 P CR.332.432阳性转化子双酶切验证.34243.3重组质粒测序.342.5本章小结.35第三章P l n J和P l n K在NICE系统中的表达及条件优化.363.1 前言.363.2 实验材料和仪器.363.2.1 菌种.363.2.2 试剂.363.2.3 相关溶液配制.363.2.4 主要仪器.373.3 实验方法.383.3.1 重组蛋白的小量诱导表达.383.3.2 Tr ic in e-SDS-P AGE 电泳.393.3.3 P l n J和P l n K重组蛋白诱导条件优化.403.3.3.1 P l n J和P l n K诱导温度优化.40333.2 P l n J和P l n K诱导剂（Nisin）浓度优化.40333.3 P l n J和P l n K诱导时间优化.413.4结果与分析.413.4.1 Tr ic in e-SDS-P AGE 检验.413.4.2 P l n J和P l n K重组蛋白诱导条件优化.423.4.2.1 P l n J和P l n K诱导温度优化.42342.2 P l n J和P l n K诱导剂（Nisin）浓度优化.443.423 P l n J和P l n K诱导时间优化.453.5本章小结.46第四章P l n J和P l n K的分离纯化.474.1 前言.474.2 实验材料与设备.474.2.1 菌种.47x浙江工商大学硕士学位论文4.2.2 试剂与耗材.474.2.3 主要溶液的配制.484.2.4 主要设备.4843实验方法.494.3.1 重组蛋白的大量诱导表达.494.3.2 P l n J和P l n K的分离纯化.4943.2.1 P l n J和P l n K分离纯化流程.4943.2.2 XAD-2大孑L树月旨层析.49432.3 FP LC蛋白纯化.50432.4超 滤离心管脱盐浓缩.5143.2.5 高效液相色谱纯化.52433 P l n J和P l n K蛋白浓度的测定.524.4 结果与分析.534.4.1 XAD-2大孔树脂层析.534.4.2 FP LC纯化重组蛋白.544.4.3 高效液相色谱（HP LC）纯化.554.4.4 P l n J和P l n K蛋白浓度的测定.584.5 本章小结.59第五章P l n J和P l n K抑菌活性研究及抑菌机制初探.605.1 前言.605.2 材料与设备.605.2.1 菌种.605.2.2 主要试剂.615.2.3 相关溶液配制.615.2.4 主要设备.615.3 实验方法.615.3.1 P l n J和P l n K的抑菌活性研究.615.3.1.1抑菌谱测定.6153.1.2 最小抑菌浓度试验.62浙江工商大学硕士学位论文5.3.2 荧光泄露试验.635.4 结果与分析.645.4.1 P l n J、P l n K 和 P l n JK 抑菌活性研究.645.4.1.1 抑菌谱试验结果.64,5.4.1.2最小抑菌浓度试验.655.4.2 荧光泄露试验.665.5 本章小结.68第六章总结和展望.696.1 总结.696.2 展望.70参考文献.71致谢.79独创性声明.80关于论文使用授权的说明.80XII浙江工商大学硕士学位论文第一章绪论近几年来，食品安全问题频繁发生，逐渐成为人们关注的焦点。从中国的瘦 肉精、苏丹红、三聚鼠胺，到德国的“二恶英毒饲料”、孕产妇奶粉坂歧氏肠 杆菌”污染，再到韩国的“垃圾饺子”、美国的“沙门氏菌污染鸡蛋疫情”，食品 安全问题已经发展成为全球性的问题，世界各国正面临着严峻的食品安全挑战。1.1 研究背景食品在加工储藏过程中极易受到微生物的污染而导致腐败变质，食品的腐 败变质不仅给食品行业带来巨大的经济损失，而且还会对人们的身体健康造成巨 大的威胁。因而，食品防腐保鲜在食品工业中显得尤为重要。食品防腐剂是食品 加工过程中使用的一类防止食品腐烂，延长食品存放周期的化合物，它具有抑制 微生物增殖或杀死微生物的作用。食品防腐剂根据其来源不同可以分为化学合 成防腐剂和天然防腐剂山。起初，人们使用最多的防腐剂是化学合成防腐剂，但是随着科技的进步和发 展，化学合成防腐剂的弊端逐渐显露出来，人们渐渐意识到使用化学合成防腐剂 对人体健康所带来的毒害作用。研究表明，许多曾经被认为安全的化学合成防腐 剂存在着致癌性、致畸性等缺点，极大地损害了消费者的身体健康。因此开发无 毒无害、广谱高效的天然食品防腐剂已经成为一种趋势，成为食品科学研究的一 大热点。天然防腐剂又称生物防腐剂，是由生物体分泌或者体内存在的具有抑菌作用 的物质，经人工提取或者加工而成为食品防腐剂。根据其来源不同天然防腐剂可 分为：动物源食品防腐剂、植物源食品防腐剂、微生物源食品防腐剂。随着科 技的不断发展，以微生物的代谢产物为原料，经过发酵、酶法转化等技术生产出 来的天然微生物源食品防腐剂越来越受到人们的重视。利用安全高效的生物防腐 剂尤其是微生物源防腐剂代替化学防腐剂，将成为今后防腐剂市场的重要研究方 向叫微生物源生物防腐剂的开发及应用是建立在食用级微生物的基础之上的，目 前已公认的微生物源食品防腐剂有乳酸链球菌肽（Nisin）、食用乳酸菌、抗菌肽、1浙江工商大学硕士学位论文纳他霉素、溶菌酶制品等。乳酸链球菌肽(Nisin)是一种可以抑制食品腐败的细菌素，并且作为一种 新型的微生物源食品防腐剂在国际上已经被多个国家所认可，并被广泛应用于乳 制品、肉制品、罐头、饮料等食品中。细菌素作为新型生物防腐剂之一，在控制 致病菌和微生物酸败方面起了重要的作用，成为近年来研究的热点。1.2 乳酸菌细菌素乳酸菌(Lac tic ac id bac ter ia,简称LAB)属革兰氏阳性菌，是指能利用葡萄 糖或其它碳水化合物发酵生成乳酸的一群细菌的统称，主要包括链球菌、乳球菌、双歧杆菌、肠球菌等。乳酸菌广泛存在于自然界中，如谷物、果蔬、牛奶和肉类 等，是人和动物肠道内正常菌群的主要成员。绝大部分乳酸菌都属于具有重要生 理功能的益生菌(P r o bio tic s),被公认为是安全(Gen er al l y r eg ar ded as saf e,GRAS)的食品级微生物。Zau n miil l e四等研究发现乳酸菌可以进行同型(正型)和异 型两种发酵方式：当进行同型发酵时，只产生唯一的乳酸(达到80%以上)作为 副产物；当进行异型发酵时，除产生乳酸外，还能够产生其它多种抑菌物质，乳 酸菌细菌素属于其中的一种抑菌物质。1.2.1 乳酸菌细菌素简介及分类乳酸菌细菌素是一类在乳酸菌发酵代谢过程中由核糖体产生的具有抗菌作 用的天然蛋白质或多肽类物质，可以抑制与生产菌株亲缘关系较近的菌株，但生 产菌株本身对其细菌素有自身的免疫性。到目前为止，已发现的细菌素超过上百种，根据他们的生物化学特征和分子 结构特征，细菌素被分为以下三大类：(1)Cl ass I(羊毛硫细菌素)Cl assi类细菌素，即羊毛硫细菌素(Lan tibio tic s),是由革兰氏阳性菌在核 糖体合成，并经翻译后修饰所得到的多肽，分子量较小，一般不超过5kDa,含 有19-38个氨基酸网。这类细菌素通常含有特殊氨基酸，如羊毛硫氨酸(Lan th io n in e)、甲基羊毛硫氨酸(Meth yl l an th io n in e)、脱氢酪氨酸(Deh ydr o bu tyr in e)和脱氢丙氨酸(Deh ydr o al an in e)等非编码氨基酸，这些非 2浙江工商大学硕士学位论文编码氨基酸残基在氨基酸之间会形成共价键，从而形成“环”区域，赋予羊毛硫 细菌素典型的结构特征，对于它们的生物活性起着至关重要的作用区9】。羊毛硫 细菌素根据其结构和功能又可以分为Cl ass I a和Cl ass I b两个亚类。Cl ass I a类细 菌素为带正电荷的螺旋状结构，具有双亲性，通常被认为能在细菌质膜上形成孔 洞，导致细胞内容物的泄露，以Nisin为代表电氏。在这些羊毛硫细菌素中，羊 毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸的形成发生在相邻的不饱和氨基酸(Dh a或Dh b)和 半胱氨酸的疏基反应之后。与Cl ass l a类细菌素不同，Cl ass I b类细菌素为球型 结构，带有负电荷或不带电荷，能够抑制蛋白酶反应，为酶抑制剂口3,皿。到目 前为止，已发现的羊毛硫细菌素有Nisin、En ter o c in W Lac tic in 481、Lac to c in S 等。(2)Cl assII(不含羊毛硫细菌素)Cl assII类细菌素是不含羊毛硫细菌素的小分子量热稳定性多肽，分子量一 般小于l OkDa,带有正电荷网。与羊毛硫细菌素不同，此类细菌素不含稀有氨基 酸，没有经过后转运过程中的修饰过程。此类细菌素又进一步分为4个亚类，即 Cl ass II a.Cl ass II b Cl ass l ie和Cl assIId。II a类细菌素被称为类片球菌素，其 序列一般包含37-58个氨基酸残基口叫 它们整体序列的相似性在40%-70%之间，并在N端拥有YGNGV的保守序列，此类细菌素对单增李斯特菌具有明显的抑菌 效果”6,17,皿。Ra类细菌素的代表性细菌素是片球菌素P A-1(P edio c in P A-1)和 明串珠菌素A(Leu c o c in A)屿期。Rb类细菌素是二肽类细菌素，由两个具有不 同氨基酸序列的肽组成，此类细菌素的活性依赖于两个肽的协同作用，虽然单独 的肽也有抑菌活性，但是当两个肽以适当比例混合后会产生协同作用，其抑菌作 用明显增强。Hb类细菌素主要包括嗜热链球菌素13(Th en n o ph il in B)20乳 球菌素G(Lac to c o c c in G)21植物乳杆菌素EF(P l an tar ic in EF)和植物乳杆菌 素JK(P l an tar ic in JK)卬的等。JIc类细菌素它的N端和C端以共价键相连，形成 环状结构，如细菌素g asser ic in A和ac ido c in B等。l id类细菌素包含其它细菌素或 单肽非类片球菌素，乳链球菌素Q(Lac tic in Q)和明串球菌素(Leu c o c in Q)24 等属于此类细菌素。(3)Cl assIUCl assUI类细菌素是大分子热敏感性蛋白，其分子量一般大于30 kDa,溶菌 3浙江工商大学硕士学位论文素(Bac ter io l ysin s)属于此类细菌素。这类细菌素具有区域型结构，不同的区域 有不同的功能，能够结合受体，具有致死活性口】。大部分的细菌素属于Cl ass I和Cl assII类细菌素，这两类细菌素资源丰富，在工业上具有广阔的应用前景，目前研究比较广泛的也是这两类细菌素。细菌素分类如表1-1所示：表1-1细菌素的分类Tabl e 1-1 Th e c l asses o f bac ter io c in s类别分子量特征代表性细菌素l a带正电荷的螺旋状结构，具有双亲性Nisin1 l b5kDa球型结构，带有负电荷或不带电荷Mer sac idinIl aN端拥有YGNGV的保守序列，抗李斯特活性P edio c in P A-1II b双肽细菌素P l an tar ic in JKIIl ie10kDaN端和C端以共价键相连，呈环状结构ac ido c in Bl id其他细菌素Lac tic in Qm30 kDa大分子热敏感性蛋白Bac ter io l ysin s1.2.2 乳酸菌细菌素的作用机制不同分类的细菌素，可以通过不同的作用机制达到抑菌的目的，通常其作用 的靶点是细胞膜。细菌素作用的最初动力是细菌素和靶细胞膜之间的静电引力作 用口纥 探究细菌素的作用机制，能够更好地为其在食品及其它领域的应用提供 坚实的理论基础，然而目前对细菌素生物活性和作用机制的研究还不够透彻，严 重阻碍了细菌素的推广应用，因此深入对细菌素的作用机制研究显得尤为重要。1.2.2.1 羊毛硫细菌素的作用机制羊毛硫细菌素作用方式又可以分为两种类型：A型和B型。(1)A型羊毛硫细菌素作用机制通过对A型羊毛硫细菌素中Nisin、P ep5、Lac tic in 3147 和Str epto c o c c in FF22 4浙江工商大学硕士学位论文的研究发现，这些细菌素主要在细胞膜上形成短时的、非选择性的孔洞，进而抑 制氨基酸的运输，使细胞内的小分子物质（K+、ATP、无机盐、氨基酸等）释放,从而导致细胞的死亡固。以Nisin为例，Nisin具有双重作用机制：一种是Nisin在 无Lipidl l介导的情况下，会形成短暂的非选择性的跨膜孔洞，引起跨膜电势的 消失，从而使质子电动势（P MF）丧失I】。P MF的丧失又会引起细胞内外pH梯 度（ApH）和跨膜电势差（AW）的消散，进而导致ATP的水解，导致细胞的死 亡。另一种是Nisin在纳摩尔级浓度时可以与肽聚糖前体物质LipidII结合从而干 扰细胞壁的生物合成，达到抑菌的目的3,26。（2）B型羊毛硫细菌素作用机制B型羊毛硫细菌素如Mer sac idin和Cin n amyc in,它们的作用方式也是通过与 Lipidl l结合，但结合方式又与Nisin和Epider min不同皿272曳 这类细菌素通过破 坏细胞壁合成过程中的酶，与LipidII结合形成复合体，这个复合物会抑制转糖 基酶的活性，从而终止细胞壁的合成，导致靶细胞的死亡。值得注意的是虽然 Mer sac idin与Nisin一样也会结合LipidII,但两者结合位点不同，而且前者不会形 成孔洞29,3”1.2.2.2 Class II细菌素的作用机制（1）Cl ass H a类细菌素作用机制112类细菌素中较为典型的是出0向人-1（片球菌素）。研究发现，P edio c in P A-1的作用机制包括三步：片球菌素结合到细胞质膜，细菌素分子嵌入膜中，最后形成孔洞复合体导致细胞的死亡，32】。其中片球菌素与细胞质膜的结合对 后面的嵌入和孔洞形成至关重要。尽管有研究表明细菌素与细胞质膜结合时与一 些受体蛋白有关，然而受体蛋白在结合时并不是必须的阴，3支从细胞水平来看，P edio c in P A-1会导致靶细胞中K+、氨基酸和其他小分子物质的泄露。同时该细 菌素也会使戊糖片球菌和单增李斯特菌细胞内外pH梯度（ApH）和跨膜电势差（中）消散，进而导致ATP的水解，终止一系列能量依赖反应，导致细胞死亡 t35o Ran math等研究发现P edio c in P A-1在细胞膜上的结合可能发生在甘露糖磷酸 转移酶系统（Man-P TS）的组分上。P TS系统在革兰氏阴性与革兰氏阳性菌中起 着运输磷酸化糖基的作用口句。Man-P TS系统包括四个组分HA,IIB,IIC,和H5浙江工商大学硕士学位论文D,其中IIC是Ha类细菌素比较普遍的作用靶点口刀。(2)Cl assIIb类细菌素作用机制Hb类双肽细菌素需要两个肽相互作用才能表现出高的抑菌活性，单一肽独 自作用时抑菌活性较弱。大量研究表明当两个肽以适当摩尔比混合时，抑菌活性 明显增强3%通常Cl assIIb类细菌素的作用靶点位于靶细胞膜上，通过穿透细胞 膜达到杀菌效果8】。细菌素穿透细胞膜，形成孔洞，造