Box-Behnken效应...工艺及其体外抗肿瘤活性研究_刘欣欣.pdf

中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1419 Box-Behnken 效应面法优化小豆蔻明纳米混悬剂处方工艺及其体外抗肿瘤活性研究 刘欣欣1,2，黄甜甜2,3，付婧欣2，李 鑫1*，王向涛1,2*1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076 2.中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193 3.首药控股（北京）股份有限公司，北京 102600 摘 要：目的 制备小豆蔻明纳米混悬剂（cardamonin nanosuspensions，Car-NPs），研究其体外抗肿瘤活性。方法 采用反溶剂沉淀联合高压均质法制备 Car-NPs，以平均粒径及多分散指数（polydispersity index，PDI）为评价指标，对药载比、均质压力、均质次数进行单因素考察，利用 Box-Behnken 效应面设计法优化处方工艺；对最优处方工艺制备的 Car-NPs 进行表征，以动态光散射法测定平均粒径、粒度分布和 电位，在不同生理介质中监测粒径变化考察介质稳定性，透析法考察载药纳米粒的体外药物释放；通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法测定并评估小豆蔻明游离药物及 Car-NPs 对人肝癌 HepG2 细胞、小鼠乳腺癌 4T1 细胞的体外细胞毒性。结果 选用 P188 为稳定剂制备 Car-NPs，最佳工艺处方为药载比 41，均质压力为 65.37 MPa，均质次数 11 次；所制备的 Car-NPs 平均粒径为（198.55.4）nm，PDI 为 0.1910.020，载药量为（62.540.13）%，包封率为（95.650.26）%，透射电子显微镜（TEM）下呈均一的圆球状；Car-NPs 在 PBS、5%葡萄糖、生理盐水、人工胃肠液中都能够稳定存在，满足口服和 iv 给药要求；以 0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PVP）为保护剂，Car-NPs 冻干复溶后粒径基本不变，便于长期保存；Car-NPs 在磷酸盐缓冲液中，呈现出先速释后缓释的两相释放曲线，释药过程符合一级释放方程，Q1e0.104 8 t73.586，R20.990 3。在 168 h 内累积释放率达到 76.49%，而相同条件下小豆蔻明物理混悬液的累积释放率仅有 22.65%；Car-NPs 显著提高了小豆蔻明对 4T1 细胞 半数抑制浓度（IC50），113.2 g/mL vs 33.89 g/mL，P0.001和 HepG2 细胞的杀伤作用（IC50，126.4 g/mL vs 52.94 g/mL，P0.001）。结论 采用 Box-Behnken 效应面法优化了 Car-NPs 的处方和工艺，所制备的 Car-NPs 有效解决了小豆蔻明难溶、难给药问题，冻干后便于长期保存。Car-NPs 提高了小豆蔻明的体外释放度和对肿瘤细胞的杀伤作用，口服有望提高生物利用度；基于滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），iv 给药有望提高药物在肿瘤组织中的分布。关键词：小豆蔻明；纳米混悬剂；Box-Behnken 效应面法；稳定性；抗肿瘤活性 中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253-2670(2023)05-1419-10 DOI:10.7501/j.issn.0253-2670.2023.05.008 Optimization of cardamonin nanosuspensions prescription process based on Box-Behnken response surface method and in vitro antitumor activity LIU Xin-xin1,2,HUANG Tian-tian2,3,FU Jing-xin2,LI Xin1,WANG Xiang-tao1,2 1.College of Pharmacy,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China 2.Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100193,China 3.Shouyao Holdings(Beijing)Co.,Ltd.,Beijing 102600,China Abstract:Objective To prepare cardamonin nanosuspensions(Car-NPs)and study their antitumor activity in vitro.Methods The Car-NPs was prepared by anti-solvent precipitation combined with high-pressure homogenization,and the average particle size and polydispersion index(PDI)were used as evaluation indexes to investigate the drug loading ratio,homogenization pressure and 收稿日期：2022-09-26 基金项目：中国医学科学院医学与健康创新工程（2021-I2M-1-071）；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（GA19C107）作者简介：刘欣欣（1996），女，硕士研究生，研究方向为药剂学。E-mail:*通信作者：李 鑫（1971），男，副教授，研究方向为药物传输系统研究。Tel:[phone] E-mail: 王向涛（1973），男，研究员，博士生导师，研究方向为药物新剂型研究。Tel:[phone] E-mail: 1420 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 homogenization times and the Box-Behnken response surface design method was used to optimize the formulation and process.The particle size,PDI and the surface potential of the obtain Car-NPs were measured by dynamic light scattering technology.The obtain Car-NPs were co-incubated with a series of physiological media for particle size change so as to evaluate their stability in these media.Dialysis in PBS was employed to assess the in vitro drug release of Car-NPs,and in vitro cytotoxicity of free cardamonin and Car-NPs on human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and mouse mammary carcinoma 4T1 cells were determined and evaluated by the cell counting kit-8(CCK-8)analysis.Results Poloxamer 188(P188)was screened to be the best stabilizer,the optimal formulation and process parameters was as follows:the drug loading ratio of 4:1,the homogenization pressure being 65.37 MPa,and the homogenization times being 11 times.The prepared Car-NPs showed an average particle size of(198.5 5.4)nm,a PDI value of 0.191 0.020,a high drug loading content of(62.54 0.13)%,a high encapsulation effenciency of(95.65 0.26)%,and a uniform spherical shape under transmission electron microscopy.Car-NPs were quite stable in PBS,5%glucose,normal saline,and artificial gastroenteric fluid,and thus meeting the requirement for both oral administration and intravenous injection.With 0.1%polyvinylpyrrolidone(PVP)as the cryoprotective agent,Car-NPs could be easily lyophilized and reconstituted into nanoparticle suspensions with nearly unchanged particle size,thus convenient for long-term storage;Car-NPs showed a bi-phase drug release in PBS,and the release process was in accordance with the first-order release equation,the cumulative release rate reached 76.49%within 168 h,while under the same conditions,the cumulative release rate of cardamonin physical suspension was only 22.65%.The nanosuspensions significantly improved the killing effect of free cardamonin against 4T1 cells(IC50,113.2 g/mL vs 33.89 g/mL,P 0.001)and HepG2 cells(IC50,126.4 g/mL vs 52.94 g/mL,P 0.001).Conclusion The Box-Behnken effect surface design method was used to optimize the formulation and process parameters of Car-NPs,and the nanosuspensions technology effectively solved the problem of poor solubility and difficulty for the in vivo drug delivery confronted by free cardamonin,the obtained Car-NPs were convenient for long-term storage after lyophilization.The nanosuspensions improved the in vitro release of cardamonin and the inhibition on tumor cells.The oral administration of Car-NPs was expected to improve the bioavailability,and intravenous administration was hopeful to enhance the drug distribution in tumors on basis on the well-known EPR effect.Key words:cardamonin;nanosuspensions;Box-Behnken response surface design method;stability;antineoplastic activity 小豆蔻明（cardamonin，Car）主要存在于姜科山姜属植物草豆蔻 Alpinia katsumadai Hayata 种子中的黄酮类单体化合物，化学结构为 2,4-双羟基-6 甲氧査耳酮1。小豆蔻明及其衍生物主要具有抗炎2、抗氧化3、松弛血管平滑肌4等多种生物活性。近些年发现小豆蔻明可以抑制肿瘤细胞增殖与转移5、诱导肿瘤细胞凋亡6，并表现出广谱抗肿瘤作用，对多形性胶质母细胞瘤5、Lewis 肺癌7、乳腺癌6,8、结肠癌9、卵巢癌10、胃癌11、骨肉瘤12、黑色素瘤13等细胞的生长均有抑制作用。在抗肿瘤机制方面，小豆蔻明能够靶向多种信号分子、转录因子、细胞因子和酶，如雷帕霉素靶蛋白（target of rapamy，cinTOR）、对核转录因子-B（nuclear factor kappa B，NF-B）、蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）、信号转导与转录激活因子 3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、Wnt/-连环蛋白（-catenin，Wnt/-catenin）和 环 氧 化 酶2（cyclooxygenase，COX2）等，有望成为一种多靶点的抗肿瘤分子实体2,4,6,14。但小豆蔻明几乎不溶于水（溶解度2.7 g/mL），难于给药、生物利用度低，限制了其进一步的体内研究和临床应用15。许多制剂手段可以改善难溶性药物溶解性，如增溶、潜溶、环糊精包合、固体分散体、纳米给药系统等方法16。其中，纳米给药系统备受关注，其不但可以解决药物的难溶性问题，而且可通过改善药物溶出、扩大与小肠吸收部位接触面积、延长药物在小肠微绒毛的停留时间等多种途径提高药物的口服生物利用度，此外，基于实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR）提高难溶性抗肿瘤药物在肿瘤中的分布17-18。纳米混悬剂（nanosuspensions，NPs）是指采用少量的表面活性剂稳定“纯”药物粒子所形成的一种亚微米级别（200500 nm）的胶体分散体系19。通过减小粒径，能增加药物的饱和溶解度和溶出速率20，非常符合小豆蔻明需要大剂量给药的要求。因此，本研究以简单的反溶剂沉淀法联合高压均质法制备小豆蔻明纳米混悬剂（cardamonin NPs，Car-NPs），从泊洛沙姆 188（P188）、维生素 E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000（DSPE-mPEG2000）中筛选出合适的稳定剂，采用 Box-Behnken 效应面法对药物与稳定剂的比例、高压均质参数等进行了优化，并对其进行了体外表征与体外抗肿瘤效果研究，Car-NPs 展现出了巨大的抗肿 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1421 瘤潜力。1 仪器与材料 Meppler Toledo AL204 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；Purelab Classic 综合纯水仪，英国ELGA 公司；KQ3200DB 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE52CS 旋转蒸发器，上海振捷实验设备有限公司；Zetasizer-nanozs 90 纳米粒度及 Zeta 电位分析仪，马尔文仪器有限公司；Plphr-2-4 LD Plus 低温冻干机，德国 Christ 有限公司；RMCO18AC 二氧化碳培养箱，日本 Sanyo 公司；JEM-1400 透射电子显微镜（TEM），日本电子珠式会社；Tecan Infinite M1000 PRO 多功能酶标仪，力臻卓越科学仪器有限公司；UltiMate 3000 高效液相色谱仪，赛默飞世尔科技有限公司。小豆蔻明对照品，质量分数 98%，批号C58635E93，上海吉至生化有限公司；小豆蔻明原料药，质量分数 98%，批号 20220715，上海金穗生物科技有限公司；维生素 E 聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS），上海海斯夫生物有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000（DSPE-mPEG2000），山东岱罡生物有限公司；泊洛沙姆 188（P188），Sigma公司；十二烷基硫酸钠（SDS），西安海斯夫生物科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP），无锡科技实验二厂；麦芽糖，北京兰博利德商贸有限公司；葡萄糖，上海吉至有限公司；甘露醇，北京索莱宝科技有限公司；色谱甲醇，上海吉至生物科技有限公司；实验用水为去离子水，其余试剂或药品均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。小鼠乳腺癌 4T1 细胞、人肝癌 HepG2 细胞，北京协和医学院细胞中心；RPMI 1640 培养基、DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素双抗，美国 Gibco 公司；96 孔无菌培养板，美国 Corning 公司。2 方法与结果 2.1 Car-NPs 的制备 将小豆蔻明分别与不同的稳定剂（P188、TPGS、SDS、DSPE-mPEG2000）以一定的比例共同溶于丙酮中，在超声条件（25、250 W）下，匀速缓慢地滴入到去离子水中，35 下减压旋蒸除去丙酮，高压均质数次，即得 Car-NPs 混悬液。空白小豆蔻明纳米粒供试品溶液同法制备。2.2 小豆蔻明含量测定 2.2.1 供试品溶液的配制 精密量取 Car-NPs 混悬液 1 mL 至 25 mL 量瓶中，加入 10 mL 甲醇，超声5 min 以破坏 Car-NPs，放置至室温，甲醇定容至刻度，即得 Car-NPs 供试品溶液。2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取小豆蔻明对照品 10.0 mg，置于 10 mL 量瓶中，甲醇溶解并加至刻度，即得质量浓度为 1.0 mg/mL 的对照品溶液。2.2.3 色谱条件 色谱柱为 Venusil XBP C18（L）（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相为甲醇-水（7525）；检测波长为 343 nm；体积流量为 1 mL/min；柱温为 25；进样量为 20 L；理论塔板数以小豆蔻明计算不低于 10 000。2.2.4 专属性考察 分别取小豆蔻明对照品溶液、Car-NPs 混悬液、空白纳米粒溶液，过 0.22 m 微孔滤膜，在“2.2.3”项下色谱条件进行 HPLC 检测。由图 1 可知，Car-NPs 混悬液与对照品溶液在相同时间出峰（7.67 min 左右），空白纳米粒样品溶液未出现色谱峰，故确定空白纳米粒对小豆蔻明测定无干扰。2.2.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，用甲醇稀释，分别配制成质量浓度分别为 0.25、0.50、5.00、10.00、25.00、50.00、75.00、100.00、200.00、250.00 g/mL 的小豆蔻明对照品溶液。按照“2.2.3”项色谱条件进样测定，分别记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析，得回归方程 Y1.877 6 X 图 1 小豆蔻明对照品(A)、Car-NPs 混悬液(B)、空白纳米粒(C)的 HPLC 图 Fig.1 HPLC of cardamonin reference substance(A),Car-NPs suspension(B),and blank nanoparticles(C)A B C 0 2 4 6 8 10 t/min 小豆蔻明小豆蔻明1422 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 2.067 4，R20.999 6，结果表明小豆蔻明在 0.25250 g/mL 与峰面积线性关系良好。2.2.6 精密度试验 取高、中、低（250.00、50.00、0.25 g/mL）3 个质量浓度的小豆蔻明对照品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件下分别连续进样 6 次。测定结果显示，高、中、低质量浓度下小豆蔻明峰面积的 RSD 分别为 0.34%、0.98%、0.67%，结果表明仪器精密度良好。2.2.7 稳定性试验 取同一批冻干粉，用适量甲醇溶解，平行制备 6 份供试品溶液，分别于 0、2、4、8、12、24 h，按照“2.2.3”项下色谱条件进样，测得小豆蔻明峰面积的 RSD 为 1.44%，表明 Car-NPs的冻干粉供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。2.2.8 重复性试验 按照“2.2.3”项下方法平行制备 6 份 Car-NPs 冻干粉供试品溶液，分别进样测定。测定结果显示，小豆蔻明质量浓度的RSD为1.81%，因此该方法重复性良好。2.2.9 加样回收率试验 取 Car-NPs 的冻干粉溶液9 份，每份均为 0.5 mL，分别加入小豆蔻明对照品储备液（质量浓度为 1 mg/mL）3、5、7 mL，制备成供试品溶液。取供试品溶液在“2.2.3”项下色谱条件测定小豆蔻明含量并计算回收率。结果显示，小豆蔻明的平均加样回收率为 100.45%，RSD 为1.23%。2.3 单因素实验 以制备得到的 Car-NPs 的平均粒径、多分散系数（polydispersity index，PDI）以及 电位为评价指标，对处方工艺进行单因素考察。2.3.1 稳定剂种类 尝试以 TPGS、P188、SDS 和DSPE-mPEG2000为稳定剂，药载比为 11，药物终质量浓度为 1 mg/mL，60 MPa 下高压均质 10 次，通过单因素试验考察不同稳定剂对 Car-NPs 的粒径、PDI 和 电位的影响。结果见表 1，P188 为稳定剂制备的 Car-NPs 粒径最小、PDI 最集中。这可能原因是与 P188 的巨大位阻效应有关，使得其较小的用量就使得纳米混悬剂均一且稳定，故后续选 表 1 稳定剂种类的筛选(xs,n=3)Table 1 Screening of stabilizer types(xs,n=3)稳定剂 粒径/nm PDI 电位/mVTPGS 268.011.70.2400.03514.20.8P188 197.09.70.2030.04919.70.5SDS 259.415.10.2090.03320.00.1DSPE-mPEG2000 336.14.90.2830.03813.40.3择 P188 为稳定剂制备 Car-NPs。2.3.2 药物质量浓度 以 P188 为稳定剂，药载比为 11，药物终质量浓度为 2、4、5、10 mg/mL，60 MPa 下高压均质 10 次，通过单因素试验考察药物质量浓度对 Car-NPs 的粒径、PDI 值和 电位的影响（表 2）。结果发现药物质量浓度为 2 mg/mL 时制备的 Car-NPs 粒径和 PDI 值均最小，电位最高，增大药物质量浓度后粒径均在 250 nm 以内，但 PDI变化较大，可能原因是药物质量浓度的增加影响了载体对药物的包裹。表 2 药物质量浓度的影响(xs,n=3)Table 2 Effects of drug concentration(xs,n=3)药物质量浓度/(mgmL1)粒径/nm PDI 电位/mV2 192.83.90.1900.02919.70.14 227.42.60.2660.01318.20.35 192.51.50.3170.02218.90.310 178.43.70.3330.03416.70.9 2.3.3 药物与稳定剂用量比例 以 P188 为载体，制备药物终质量浓度为 2 mg/mL 的 Car-NPs，于 60 MPa 下高压均质 10 次，通过单因素实验考察药物与稳定剂的比例对 Car-NPs 的粒径、PDI 值和 电位的影响（表 3）。随着药载比的不断变化，粒径及PDI 也随之改变，当药载比较小时，PDI 也较小但粒径较大，在药载比 51 时粒径最小且分布较集中，故选择药载比 51 用来后续研究。2.3.4 均质压力 以 P188 为载体，药物终质量浓度为 2 mg/mL、药载比为 11，在不同均质压力（10、30、90、100 MPa）下，高压均质 10 次，通过单因素试验考察不同均质压力对 Car-NPs 的粒径、PDI 值和 电位的影响（表 4）。随着均质压力的增 表 3 稳定剂与药物用量比例的影响(xs,n=3)Table 3 Effect of ratio of stabilizer to drug dosage(xs,n=3)药载比 粒径/nm PDI 电位/mV 11 288.53.0 0.1380.030 23.20.3 21 246.03.7 0.1390.030 18.80.2 31 250.92.2 0.1470.022 18.50.6 51 195.51.7 0.1960.068 19.20.6 61 227.75.9 0.2200.007 14.60.9 71 207.90.9 0.2400.056 14.30.5 81 283.95.4 0.1580.034 15.00.8 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 1423 表 4 均质压力的影响(xs,n=3)Table 4 Effects of homogenization pressure(xs,n=3)均质压力/MPa 粒径/nm PDI 电位/mV10 402.112.30.2870.00817.70.430 255.64.7 0.2770.07218.60.960 197.43.5 0.3250.05519.50.390 163.50.5 0.2120.01620.00.2100 248.50.5 0.4350.05219.10.5 加，Car-NPs 粒径减小，压力为 60 MPa 时粒径较小且分布较均一，继续增加压力，所得纳米粒的粒径略有减小但分布宽度增加。在 100 MPa 时，粒径和PDI 明显增加，这可能原因是较大的均质压力将Car-NPs 结构改变。2.3.5 均质次数 以 P188 为载体，药物终质量浓度为 2 mg/mL，药载比为 11，均质压力为 60 MPa，分别均质 5、10、15 次，通过单因素试验考察不同均质次数对 Car-NPs 的粒径、PDI 值和 电位的影响（表 5），可发现随着均质次数增加，Car-NPs 的粒径逐渐减小，表面电位略有增高。表 5 均质次数的影响(xs,n=3)Table 5 Effects of homogenization times(xs,n=3)均质次数 粒径/nm PDI 电位/mV5 227.43.50.2870.00817.70.510 199.64.70.2770.07218.60.415 157.43.50.3250.05519.50.5 2.4 Box-Behnken 效应面法优化 Car-NPs 处方 2.4.1 设计方案 以 P188 为稳定剂制备的 Car-NPs，由于药载比、均质压力及均质次数对 Car-NPs的影响较为复杂，因此采用 Box-Behnken 效应面法对 Car-NPs 处方进行优化；以药载比（X1）、均质压力（X2）及均质次数（X3）为自变量，以平均粒径（Y1）及 PDI（Y2）为主要评价指标，进行统计分析。2.4.2 回归模型方差分析及显著性检验 以 Box-Behnken 响应面法优化其工艺参数21，因素水平及实验结果见表 6。采用 Design-Expert V8.0.6 软件进行数学模型拟合。Y1和 Y2作为响应值，X1、X2、X3为自变量，建立的 2 次回归方程为 Y1667.9516.69 X16.311 X241.006 X30.267 92 X1X2 表 6 Box-Behnken 试验设计与结果(n=3)Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken(n=3)序号 X1 X2/MPaX3Y1/nmY2 序号X1X2/MPaX3Y1/nm Y2 序号X1X2/MPaX3Y1/nmY2 1 21 30 10203.60.26672160 15198.8 0.232134160 10285.10.1432 61 30 10342.30.18986160 15269.5 0.230144160 10259.40.1413 21 90 10340.70.24694130 5210.1 0.332154160 10259.20.1324 61 90 10283.10.213104190 5190.1 0.311164160 10316.60.1515 21 60 5241.90.347114130 15247.8 0.194174160 10319.80.1476 61 60 5196.70.268124190 15299.9 0.233 1.072 5 X1X30.064 833 X2X35.664 38 X12 0.062 286 X222.186 3 X32，R20.984 4，P0.000 1；Y21.1620.132 14 X16.863 31030.086 855 X2 1.833 33104 X1X2 1.925103 X1X3 8.333 33105 X2X30.011 244 X124.525105 X223.259103 X32，R20.988 8，P0.000 1；结果表明各因素之间具有良好的相关性。自变量与响应值的三维图如图 2 所示。Y1是评价纳米粒的主要指标，理想的纳米粒应具有尽可能小的粒径以最大限度实现其尺寸效应，同时应分布均匀，具有较高载药量，且制备简单的特点，因此，最佳处方确定条件为 X141，X265.37 MPa，X311 次，预测平均粒径为 194.8 nm，PDI 为 0.187。2.4.3 工艺验证 根据优化后的处方工艺制备 3 批Car-NPs，平均粒径为（198.55.4）nm，PDI 为 0.1910.020，见图 3；且表面成正电位，呈现良好的稳定性。与预测值方差相差小于 5%，说明该模型可信度良好，预测性较优，可用于处方工艺优化。2.5 Car-NPs 的外观形态 Car-NPs 外观呈黄色，无沉淀和不溶性微粒存在（图 4-a）。采用 TEM 观察 Car-NPs 的形态。将 1滴 Car-NPs 滴在铜网上，用 2%磷钨酸染色 5 min。室温下将铜网晾干，放置 TEM 下观察。Car-NPs 呈现圆球形，大小分布较为均匀，粒子之间无黏连和聚集现象（图 4-b）。2.6 Car-NPs 的稳定性考察 2.6.1 放置稳定性考察 将制备好的 Car-NPs 于室温 25 放置，测定 15 d 内的粒径变化。结果 Car-1424 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Herbal Drugs 2023 March Vol.54 No.5 图 2 自变量与响应值的三维图 Fig.2 Three-dimensional plot of independent variable and response values 图 3 Car-NPs 的粒径分布图(n=3)Fig.3 Size distribution of Car-NPs(n=3)图 4 Car-NPs 的实物照片(a)和透射电镜照片(b)Fig.4 Photo(a)and TEM photograph(b)of Car-NPs NPs 在 15 d 内粒径变化较小（表 7），Car-NPs 室温放置 15 d 内粒径较为稳定。2.6.2 在生理介质中的稳定性考察 精密吸取 Car-NPs 1 mL，与 2PBS（2 倍浓度的磷酸盐缓冲溶液，pH 7.4）、1.8%NaCl 溶液和 10%葡萄糖溶液等体积混合，得到等渗的 Car-NPs 的 0.9%NaCl 溶液、5%葡萄糖溶液和 PBS 溶液；与人工胃液、人工肠液按体积比 14 混合，37 孵育，分别在 0、1、3、表 7 室温放置粒径变换(xs,n=3)Table 7 Particle size transformation of Car-NPs when stored at room temperature(xs,n=3)t/d平均粒径/nmt/d平均粒径/nmt/d平均粒径/nm1197.71.47207.81.113212.30.9 3204.51.39205.21.315207.72.1 5200.81.311209.52.0 5、7 h 间点取样测定平均粒径及 PDI 变化22。结果见表8，可知Car-NPs在PBS、5%葡萄糖、0.9%NaCl、和人工胃液肠液中孵育 7 h 后平均粒径和 PDI 变化均较小，没有出现任何浑浊或沉淀现象，说明 Car-NPs 在这些生理介质中稳定性好，Car-NPs 或可以调成 PBS、生理盐水、5%葡萄糖等渗溶液，为 Car-NPs 注射给药提供参考依据。实验中制备的 Car-NPs在人工胃肠液中连续孵育 7 h 均能保持粒径没有明显增大，满足口服给药的条件，为提高 Car-NPs 的口服生物利用度提供可能。2.7 溶血性考察 2.7.1 红细胞悬浮液的配制 将新鲜大鼠全血 3500 r/min 离心（离心半径 9.8 cm）10 min，去除上清。红细胞沉淀用 0.9%NaCl 溶液吹打洗涤，3500 r/min离心（离心半径 9.8 cm）10 min 去除上清液，重复23 次，直至上清无色透明。最终用 0.9%NaCl 溶液将红细胞调节成浓度为 4%的红细胞悬浮液。280 粒径/nm 200 120 2602001403202401600.30 2.5 4.05.52.54.05.5X1 40608040608012 1266X1X3 X3X2/MPaX2/MPa粒径/nm 粒径/nm 0.20 0.10 0.400.250.100.400.250.10PDI PDI PDI 2.5 4.05.52.54.05.5806040406080X1 X1X3 X3612 612X2/MPaX2/MPaa b 1 10 100 1000 10 000粒径/nm 中草药 中草药 2023 年年 3 月月 第第 54 卷卷 第第 5 期期 Chinese Traditional and Her