基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异.pdf

673基础研究ExperimentalResearch中国现代2023年9 月第2 6 卷第9 期Sep.2023Vo1.26No.9普通外科进展Chin J Curr Adv Gen Surg基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异俊数魏利敏王王光辉余军军孙祺西安交通大学第一附属医院完普通外科4（陕西西安7 10 0 6 1)【摘要】目的：对结肠癌肝转移和肝外卵巢转移的患者进行二代转录组测序，比较转移灶与正常组织RNA表达谱的差异，寻找转移灶的分子差异与作用位点。方法：对1例合并肝与和盆腔转移的回盲部结肠癌患者的结肠上皮与肝、卵巢转移组织进行测序分析，筛选出不同转移灶之间的差异表达基因并进行功能富集分析。结果：与正常组织相比,肝转移灶中差异表达基因12 0 6 4个，卵巢转移灶中差异表达基因12 2 6 5个。KEGG功能分析发现转移灶的差异基因主要富集于癌症与PI3K-AKT通路。肝转移灶FZD9、RET、I FNG 等基因显著差异表达，卵巢转移灶WNT2、W NT 7 B、I FNG 等基因显著差异表达。结论：转录测序发现该患者转移与正常组织间差异基因主要富集于癌症通路，其中FZD9、I FNG、W NT 2 等差异表达基因可能与结肠癌转移相关。【关键词】结肠癌远处转移转录测序KEGG功能分析【中图分类号】R735.35【文献标识码】Adoi:10.3969/j.issn.1009-9905.2023.09.001【文章编号】10 0 9-990 5(2 0 2 3)0 9-0 6 7 3-0 5Molecular mechanism differences between liver metastasisand ovarian metastasis of colon cancer based on second-generation sequencing technologyYAN Jun,WEILi-min,WANG Guang-hui,SHE Jun-jun,SUNQiDepartment of General Surgery,the First Affiliated Hospital of Xian Jiaotong Universi-ty(Xian 710061,China)ABSTRAcT】O b je c t iv e:T r a n s c r ip t o m e s e q u e n c in g W a s p e r fo r m e d o n a n p a t ie n t s s u ffe r e d fr o mcolon cancer with liver and extrahepatic pelvic metastases,and the differences in RNA expressionprofiles between metastases and normal tissues were compared to find the molecular differences.Methods:A rare ileocecal colon cancer patient with liver and pelvic metastases was sequenced toscreen out differentially expressed genes(DEGs)in metastases and functional enrichment analysis【基金项目国家自然科学基金资助项目（8 17 0 2 36 2)【作者简介】阎俊（1995）,男，甘肃庆阳人，博士研究生，研究方向：普通外科相关疾病的临床及基础研究。E-mail:通信作者】孙祺（198 7 ），男，山东人，副研究员，研究方向：普通外科疾病临床及基础研究。E-mail：s u n q i 48 7 5 16 3.c o m中国现代普通外科进展2 0 2 3年9 月第2 6 卷第9 期was employed.Resaults:Compared with normal tissue,12064 DEGs were found in liver metas-tases and 12265 DEGs were found in ovarian metastases.KEGG functional analysis showed thatcancer and PI3K-AKT pathways were enriched mostly.FZD9,RET,IFNG were significantly differen-674tially expressed in liver metastases,and WNT2,WNT7B,IFNG were significantly differentially ex-pressed in ovarian metastases.Conclusion:Transcriptome sequencing of the patient found thatthe DEGs between the metastatic and normal tissues were mainly enriched in pathway in cancer.FZD9,IFNG,WNT2 and other DEGs may be related to tumor metastasis.【K EYW O RD S】Co l o n c a n c e r Distant metastasisRNA sequencingKEGGfunction统计显示约2 0%的结直肠癌患者在首诊时已发生转移,40%的患者经治疗后出现复发或转移 1。远处转移是患者预后不良的重要危险因素，结直肠癌的5年生存率约为6 5%，但转移性结直肠癌的5年生存率仅为14%,发生多器官转移时不到5%2-3。同时，非孤立性远处转移患者数量少，现有文献鲜有报道。因此,进一步阐释结肠癌的转移机制,探索肿瘤转移的作用位点，对于改善转移性结直肠癌患者的预后具有重要的意义。本研究通过对1例结肠腺癌伴肝脏、盆腔转移患者的组织样本进行RNA测序,筛选出与肝转移及子宫卵巢转移相关的差异表达基因，对差异基因进行功能分析，探究可能参与结直肠癌远处转移及影响器官转移特异性的潜在基因与作用靶点。1材料和方法1.1材料2 0 2 1年西安交通大学第一附属医院普通外科院收治1例49 岁女性患者，结肠镜检示回盲部隆起性病变，经病理检测为结肠腺癌，术前进行全腹部增强CT检查考虑肝脏、盆腔转移。行腹腔镜辅助右半结肠切除术+盆腔转移癌切除术+全子宫、双附件切除术+肝部分切除术。术前与患者及家属沟通并签署标本留取知情同意书。术中待组织切除取出后，解剖组织，留取癌旁上皮组织及转移病灶处组织标本，干冰运输，-8 0 保存。1.2转录组测序送检标本包括正常组织（normaltissue,NT）、肝转移组织(liver metastases,LM)和卵巢转移组(ovarian metastases,OM)。使用 Trizol 试剂盒分别提取NT组、LM组、OM组组织的总RNA后，分别用NanoPhotometer分光光度计检测样品纯度，用Agilent 2100 RNANano 6000AssayKit 检测RNA样品的完整性和浓度。检测样品合格后，纯化mRNA,构建文库，并使用Agilent2100生物分析仪对文库进行质检。检测质量合格后，文库由北京安诺优达基因科技有限公司基于Illumina平台，通过PE150测序策略,进行测序。1.3测序数据过滤Illumina平台测序得到原始下机序列(RawReads）后，对RawReads进行过滤。数据处理步骤如下：(1)去除接头污染的Reads；(2)去除低质量的Reads；（3）去除含N比例大于5%的Reads。过滤后获到高质量的序列（Clean Reads）,经质控合格后，基于CleanReads进行数据比对分析和转录组深层分析。1.4差异表达基因分析通过DESeq2进行基因差异表达的分析，差异表达基因的筛选主要以差异倍数(Fold change)以及q值（矫正后P值)为参考。差异基因的筛选标准定为llog2 Fold changel1 和q0.05。1.5功能分析对差异基因进行GO数据库的富集及功能分析。GO共有3个亚层，分别描述基因参与的生物过程、细胞组分、分子功能。使用KEGG数据库对差异基因进行通路分析。该数据库可以对蛋白质交互网络在各种各样的细胞活动过程起的作用做出预测。1.6统计学处理采用R软件。数据采用xs表示，组间比较采用t检验进行，多组间比较采用ANOVA单因素方差分析,P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1患者术后病理患者术后病理示：“回盲部 结肠溃疡型中分化腺癌，侵及肠壁全层达浆膜下纤维脂肪组织，并由外向内侵及子宫肌壁深肌层及双侧卵巢组织、宫颈。切除肝组织内有中分化腺癌浸润，结构符合结肠癌肝转移。免疫组织化学结果显示，肝:CD20(+),CDX2(+),SATB2（+)；子宫:CA125(-),ER(-),PR(-)。2.2转移灶与正常组织基因表达量差异分析RNA测序发现,LM与NT相比，上调基因58 37 个，下调基因6 2 2 7 个。OM与NT相比，上调基因5552 个，下调基因6 7 13个，绘制差异表达基因火山图与层次聚类分析热图。再利用k均值聚类算法，将差异基因分为6 个相近的聚类集合，每个聚类集合中的基因其表达趋势相近。见图1。阎俊，等.基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异2.3差异基因GO功能分析利用GO数据库分析差异表达基因，对其功能进行限定和描述（图2)。GO功能富集分析发现,LM相比NT,差异基因在生物过程部分富集于大分子代谢过程的调节、细胞代谢过程的调节和细胞组织成分等。差异基因在细胞组分部分富集于膜和膜细胞器等。差异基因在分子功能部分富集于结合和离子结合。OM相比NT,其差异基因在生物过程部分富集于细胞进程。差异基因在细胞组分部分富集于膜和膜细胞器等。差异基因在分子功能部分富集于结合和离子结合。2.4差异基因KEGG功能分析利用KEGG数据库分析差异基因富集的信号通路，预测其在各类信号活动中的作用。LM相比NT,差异表达基因主要LM_NT00(Iped)6i-00L涉及137 个代谢通路（图3A），其中最为富集的是癌症通路。此外，PI3K-AKT通路和人乳头瘤病毒感染也是差异基因较为富集的通路。OM相比NT，差异表达基因主要涉及12 9 个代谢通路(图3B）,其中最为富集的是癌症通路，之后是PI3K-AKT通路、人乳头瘤病毒感染等。2.5富集通路中的差异基因选择富集程度最高的癌症通路进一步分析。LM与NT相比,该通路中FZD9、G NA S-A S1、RET 等基因上调最显著，而VEGFD、NO S2、CO L4A 5等基因下调最显著。OM与NT相比，该通路中WNT2、EPO、W NT 7 B等基因上调最显著，而NOS2、VECFD、ECF等基因下调最显著。见图4。OM_NTADown008UpNone(Iped)6i-0L675ColorKeyBDownUpNone00C-5.5ValueO-10-5FoldChange(log2)SubClass1,4371genes5263?OL-TTTTT一510-15-10-50510FoldChange(log2)Sub Class 3,828genes5TT63?OL-TTTTTSub Class 5,1720 genesD5263?9-OL-TTTTTSubClass2,1010genes5一269-OL-SubClass 4,6122genes2630?OL-TTTTTSubClass6,2797genes63?OL-TTTTT1图1差异表达基因的火山图、热图、聚类图A、B:LM 与OM相比NT差异基因的火山图,蓝点为显著下调基因,黄点为显著上调基因,灰点为差异不显著基因；C:NT、LM、O M 三处组织差异基因热图；D：差异表达基因的k均值聚类图中国现代普通外科进展2023年9 月第2 6 卷第9 期AEnrichment of molecularfunctioncation binding-transtion metalon bindington binding676protein dimercarbohydrate derivative bindsmallmofecule bindingtranscriptionregulatoractivitycatalytic.activitybindingEnrichment of biological processregulation.of macromoleculeHog(FDR)26.9919.0611.123.18Sizedrug binding136Enrichment of cellular componentendoplasrmbrane4og(FDR)regulation of celilar metabolic process15.10cellutarcomponeorganizaticregulation.of.transcnption,DNA-teregulation of nucieic acid-templated transcriptionregulation of RnA bios)cellutarcomponent arganization or biogenesisregulation of RNAmetabolicprocesregulation.of gene expresiorregulation of biosynthett process.ogIFDR)intracelutar30.1511.14perinuclear region of cytoplasm7.18membrane3.22cytosolSizentrit34521.3212.493.66Size1membrane part3integral component ofmembrane46organlle membrane:membrane-bounded.organelle Rich_RatioEnrichmentofcellularcomponentoytosoi-cytoskeletal part:membraneorganelle.membrarmembranintrinsic component ofmembranintegral component of membranmembrane-boundedorganellenuclear partRich_RatioEnrichmentof biological processregulationof RNAbiosynthe4og(FDR)34.5624.0913.623.14Size123cytoplasm46Rich_RatioEnrichmentofcellularcomponentytosol-ogIFOR)regulation.of nucteobase-containing compound meproceprotein localizatmacromolecule localizationregulation of biosyntheetic.procesregulation of macromoleculeblosytheticprocessregulation of.ellular macromolecule biosynthetic processregulationof gene expresioncellularprocessBHog(FOR)7.262cytoskeletal part5.895membrane.4.528organelle membraneaweuu3.1605ize16234.5624.0913.62membranepart3.14izentrins1integral component of membrane:cytoplasmmembrane-boundedorganellenuclear part46Rich_RatioA:LM与NT相比在生物过程、细胞组分和分子功能3个亚层的富集差异；B:OM与NT相比在生物过程、细胞组分和分子功能3个亚层的富集差异10Log2FoldChangeLog2Foldchange图4富集通路中显著差异基因A:KEGG富集道路中LM与NT差异基因；图3差异表达基因的KEGG功能富集分析B:KEGG富集道路中OM与NT差异基因A：LM 中差异表达基因的KECC富集通路；B:OM中差异表达蛋白激酶B通路的异常激活相关 5。本研究显示，基因的KEGG富集通路SNHG15在LM组织中高表达，这与文献报道Lnc-3讨论RNA SNHG15 在肝转移灶中的高表达一致,该Lnc-结肠癌的远处转移是患者术后死亡的主要原因，RNA与淋巴途径的肝转移显著相关。同时KEGG功探究多发远处转移患者不同病灶的基因差异表达，有能分析也显示LM差异基因主要富集于癌症通路与助于寻找影响结肠癌侵袭性及转移器官特异性的靶PI3K-AKT通路。结直肠癌卵巢转移的转移途径一点，可能为抑制肿瘤转移提供潜在的治疗价值。般认为与血运、种植、淋巴转移相关。但目前关于卵本研究对1例转移性结肠癌患者肝脏、卵巢转巢转移瘤的分子机制研究尚不明确6 。一项38 例结移灶组织,通过RNA测序技术，与正常组织对比筛肠癌卵巢转移患者的测序结果显示最常见的突变基选差异基因，并进行GO和KEGG功能富集分析。结因为TP53、A PC、K RA S、SM A D 4和PIK3CA7。本项直肠癌肝转移的临床机制主要是肿瘤细胞通过门目测序中发现,该患者的卵巢转移灶中APC、K RA S、静脉系统和淋巴结进行转移 4。其分子机制主要与SMAD4和PIK3A基因均存在显著差异性表达。长链非编码RNA的调控以及磷脂酰肌醇-3-激酶/研究针对富集通路筛选出了差异倍数最大的Rich_Ratio图2差异表达基因的GO功能富集分析BARich_RatioLM vs.NTAVEGFD-NOS2COL4A5IFNGFASLGCTNNA2-DLL1RXRGFASWNT2BLAMB4WNT2EPOFGF22-HSP9OAB7P-AC012400.1GNG4RETGNAS-AS1-FZD9-10OMvs.NTBNOS2VEGFDEGFIFNGKLK3-AC243960.2CASP7-IL7-AC026462.1-AC107871.1BIRC7FZD9-WNT3A-IGF1TPM3P6-GNAS-AS1-GNG8-WNT7B-EPOWNT2070-1055阎俊，等.基于二代测序技术分析结肠癌肝转移与卵巢转移之间的分子机制差异基因,LM中上调最显著的基因FZD9，该基因编码跨膜结构域蛋白，是Wnt信号蛋白的受体,研究显示参与肺癌特征性转移的Wnt通路 8 。另一显著上调的基因RET是一种原癌基因,RET的融合在非小细胞肺癌中预示潜在的靶向致癌驱动,其突变与多种肿瘤的淋巴结转移相关 9-10 。在LM中下调显著的IFNG基因编码干扰素细胞因子,参与固有与适应性免疫过程。多种肿瘤模型证明IFNG是自然杀伤细胞控制肿瘤细胞迁移的主要介质 1。干扰素的下调可能导致肿瘤细胞免疫逃逸而发生远处转移。OM的肿瘤通路中显著上调的基因Wn2、W n t 3A、Wnt7B，属于WNT基因家族，该家族由编码分泌信号蛋白的结构相关基因组成，这些蛋白与肿瘤发生和一些发育过程有关,且胃肠道肿瘤对这一通路具有高度依赖性 12 。同时越来越多的证据表明,经典和非经典Wnt信号传导都可以以高度组织特异性的方式支持肿瘤转移。一项针对胰腺癌循环肿瘤细胞的单细胞RNA测序结果显示,Wnt2表达增加了CTC非锚定系统的形成及其转移倾向 13。而Wnt3A被证实可以调控肿瘤干细胞的表型从而影响其转移能力 14。而WNT7B介导胰腺腺癌中的自分泌Wnt/-catenin传导和不贴壁细胞的生长 15。OM中显著下调的ECF，编码表皮生长因子，该蛋白是一种有效的有丝分裂因子,在多种细胞类型的生长、增殖和分化中起着重要作用。EGF受体的过表达与多种恶性肿瘤的转移正相关,EGF信号通路能够直接刺激转移细胞的生长，最近的研究表明,EGF信号是乳腺癌、前列腺癌和肾癌骨转移的重要媒介 16 。另外，OM中显著下调的CASP7,其编码的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶被激活时可诱导细胞调亡。CASP7在肿瘤组织中可以抑制侵袭并诱导肿瘤细胞的凋亡，低CASP7表达被证明是前列腺癌和宫颈癌复发及转移的独立预测因子 17-18 。综上所述，本研究对1例多发转移结肠癌患者的组织进行了转录组测序，筛选出转移灶差异表达的基因,并发现其主要富集于KEGG的肿瘤通路及PI3K-AKT通路。并进一步筛选出富集通路中差异倍数最显著的基因,肝转移灶中FZD9、RET、I FNG、CT NNA 2等基因差异表达明显，卵巢转移灶中WNT2、WNT7B、I FNG、K LK 3等基因差异表达明显，其中部分基因在其他肿瘤模型中报道与肿瘤的侵袭与转移相关，但尚未在结肠癌中证实，它们有可能参与结肠癌远处转移的调控过程。本研究之后将进一步验证这些基因靶点与结肠癌转移的关系,探究其潜在的治疗价值，以期减少结肠癌的转移并改善预后。参考文献1 Biller LH,Schrag D.Diagnosis and treatment of metastatic colorectalcancer:A reviewJJ.J Am Med Associat,2021,325(7):669-685.2 Cronin KA,Ries LA,Edwards BK.The surveillance,epidemiology,and end results(SEER)program of the national cancer instituteJJ.Cancer,2014,120 Suppl 23:3755-3757.3 Luo DK,Liu Q,Yu WC,et al.Prognostic value of distant metastasissites and surgery in stage IV colorectal cancer:a population-basedstudyJ.Inter J Color Dis,2018,33(9):1241-1249.4俞巍，邢颖，张洪义.结直肠癌肝转移的机制研究热点与展望 J中国临床医生杂志，2 0 19,47(8)：90 1-90 4.5赵伽木，张伟，周洪渊，等.结直肠癌肝转移的最新研究进展 J.中华肝胆外科杂志，2 0 2 1,2 7(2)：156-16 0.6陈怡,张颖,王颖.结直肠癌卵巢转移的研究现状及进展 .中华结直肠疾病电子杂志，2 0 2 0,9(5)：498-50 1.7 Ganesh K,Shah RH,Vakiani E,et al.Clinical and genetic determi-nants of ovarian metastases from colorectal cancerJ.Cancer,2017,123(7):1134-1143.8 Dimeo TA,Anderson K,Phadke P,et al.A novel lung metastasissignature links wnt signaling with cancer cell self-renewal and ep-ithelial-mesenchymal transition in basal-like breast cancerJ.Can-cer Res,2009,69(13):5364-5373.9 Digumarthy SR,Mendoza DP,Lin JJ,et al.Imaging features andpatterns of metastasis in non-small cell lung cancer with RET rear-rangementsJJ.Cancers,2020,12(3):693.10 Wang S,Wang B,Xie C,et al.RET proto-oncogene gene mutationis related to cervical lymph node metastasis in medullary thyroidcarcinomaJJ.Endoc Pathol,2019,30(4):297-304.11 Mittal D,Vijayan D,Putz EM,et al.Interleukin-12 from CD103(+)Batf3-dependent dendritic cells required for NK-cell suppression ofmetastasisJ.Cancer Immunol Res,2017,5(12):1098-1108.12 Zhan T,Rindtorff N,Boutros M.Wnt signaling in cancerJ.Onco-gene,2017,36(11):1461-1473.13 Yu M,Ting DT,Stott SL,et al.RNA sequencing of pancreatic cir-culating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis J.Nature,2012,487(7408):510-513.14 Malanchi I,Santamaria A,Susanto E,et al.Interactions betweencancer stem cells and their niche govern metastatic colonizationJ.Nature,2011,481(7379):85-89.15 Arensman MD,Kovochich AN,Kulikauskas RM,et al.WNT7Bmediates autocrine Wnt/-catenin signaling and anchorage-inde-pendent growth in pancreatic adenocarcinomaJJ.Oncogene,2014,33(7):899-908.16 Lu X,Kang Y.Epidermal growth factor signalling and bone metas-tasisJ.Br J Cancer,2010,102(3):457-461.17 Hudson RS,Yi M,Esposito D,et al.MicroRNA-106b-25 clusterexpression is associated with early disease recurrence and targetscaspase-7 and focal adhesion in human prostate cancerJ.Oncogene,2013,32(35):4139-4147.18 Fernandez J,Zamudio H,Rodriguez M,et al.Gene signature basedon degradome-related genes can predict distal metastasis in cervi-cal cancer patientsJJ.Tumor Biol,2017,39(6):1010.(收稿日期：2 0 2 2-0 9-13)（本文编辑：张；技术编辑：张珂）677