色谱分析法基础.pdf

色谱分析法基础2、1 概述经典的分离方法:沉淀.蒸储和萃取；现代分析中，大量采纳色谱和电泳分离方法。迄今 为止,色谱方法是最为有效的现代分离分析手段！色谱法是一种物理化学分离方法。将这种分离方 法与适当的检测手段相结合，应用于分析化学领域，就 是色谱分析法。一.色谱法简介色谱法早在1906年由俄 国植物学家M-Rswett(茨 维特)使用CaCOs粉末作 为固定相，石油醛作为流动相,坡璃管作 为色谱柱，分离植物中色 素时发现并命名的色 谱法”(chro mato g raphy)色谱法是一种分离技术，其研究对象是复杂的混合物质。二.色谱法的历史俄国植物学家茨维特Tsweet首先将这种层析现象用于分离 植物色素红萝卜素、叶黄素和叶绿素A、B,并将这种方法命名为色谱法色谱（是最先创立的色谱方法）20年后（1931）Kuhn（库恩）为了证实蛋黄中的叶黄素是植物 叶黄素与玉米黄质的混合物，参考了Tsweet的论文并采纳的色谱法进行其研究工作（吸附色谱）1938年,Martin（马丁 USyng e（辛格）采纳水分饱和的硅胶为固定相,以含有乙醇的氯仿为流动相分离乙酰基氨基酸同时提出了色谱塔板理论分配色谱 1951年,Martin和James采纳气体作为流动相，以自动滴定仪作为检测器分析脂肪酸气相色谱法。建立形成色谱学 理论中有着重要地位的塔板理论和Van Deemter方程,以及保留时间、保留指数、峰宽等概念。1952年,A.J、P、Martin和 R、L.M.Syng e获得了诺贝 尔化学奖。在他们获得诺贝尔奖的论文中还指出“采纳气 体代替液体作为流动相分离各类化合物的估计性是存在 的。”假如流动相用气体来代替，对分离更有好 处，“使用特别细的颗粒填料和柱的两端施加较大的压差,应能得到较小的理论塔板商”1957年,Go lay又提出了使用毛细管柱代替填充柱可获得极 高的分离效率一一毛细管气相色谱法从此,气相色谱法得以蓬勃发展。气相色谱学的诞生及其获得广泛的应用使色谱学逐渐成为分析化学的一个重要分支学科I960年代，为了分离蛋白质.核酸等不易汽化的大分子物质，气 相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。I960年代末 科克兰等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效 液相色谱的时代。1971年科克兰等人出版了液相色谱的现代实践一书,标志着高效液相色谱法(HPLC)正式建立。I937U972年,15年中有12个No加/奖是有关色谱研究的!三、色谱的分类1.色谱过程中两相的物理状态分类2、色谱分离过程的作用原理分类S3.定相的使用分类1、色谱过程中两相的物理状态分类r 1)气相色谱(go：S色谱(GSC)、气一液色谱(GLC)(2)液相色谱(LC)：S色谱(LSC)、液一液色谱(LLC)I 3)超临界流体色谱(SFC)2、色谱分离过程的作用原理分类/吸附色谱法 adso rptio n chro mato g raphy不同组份在固定相的吸附作用不同分配色谱法 partitio n chro mato g raphy不同组份在固定相上的溶解能力不同离子交换色谱法 io n exchang e chro mato g raphy不同组份在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同I空间排阻色谱法 steric exclusio n chro mato g raphy不同尺寸分子在固定相上的渗透作用S3、定相的使用的形式分类柱色谱 co lumn chro mato g raphy平面色谱 plane chro mato g raphy纸色谱法 paper chro mato g raphy薄层色谱法 thi四、色谱法的特点分离效率高复杂混合物,有机同系物,异构体，手性异构体。灵敏度高 能够检测出Fig/g(IO)级;1至ng/g(l(P)级的物质量。1=1分析速度快一般在几分钟或几十分钟内能够完成一个试样的分析。(4)应用范广气相色谱:沸点低于350 的各种有机或无机试样的分析。液相色谱:高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析和制备。2、2色谱流出曲线及有关术语-色谱分离过程及流出曲线口二、色谱相关术语三、色谱流出曲线的意义“1、色谱分离过程Packed co lumnA+BSamplel2TimeDistance migrated混合组分的分离过程及检 测器对各组份在不同时期 的响应色谱分离基本原理:使用外力使含有样品的流动相(气体.液体或超临界流体)通过一定于柱或平板上.与流动相互不相溶的固定相表面。样品中各组份在两相中进行不同程度 S的作用。与定相作用强的组份随流动相流出的速度慢，反之，与固定相作用弱的组份随流动相流出的速度快o由于流出的速度的差异,使得混合组份最终形成各个 单组份的“带(band)”或“区(zo ne)”,对依次流出的各个单组份物质可分别进行定性、定量分析。2、色谱流出曲线由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线即色谱流二、色谱相关术语1、色谱峰(peak):当某组分从色谱柱中流出时，检测器对该组 分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线。2、基线(baseline):在正常操作条件下(操作条件稳定后)，仅有流动相通过检测器时，仪器记录到的一条平行于横轴的直线。目中co所示。1)基线噪尸(baseline no ise):由各种因素引起的基线起伏。信号强度2)基线漂移(baselinedrift):基线随时间定向的缓慢变化。噪声与漂移Rn为嚎声，d为漂移3.峰高(peak heig ht):色谱峰顶点与基线的距离。以人表图中A及4.区域宽度(peak width):用于衡量柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。通常有三种表示方法：1)标准偏差(standard deviatio n)a:0 607倍峰高处色谱峰宽度的一半中EF的一半o2)半峰宽(peak width at half-heig ht)Fi/2：峰高一半处的峰宽,旨中居/2=2，35 c3)峰底宽(peak width at peak base)Y:色谱峰两侧拐点上切线在基线上的截距,图中 OY=4a5、保留值pretentio n value):是试样各组分在色谱柱中滞留时间的数值,它反映组分与固定相间作用力大小，通常用保留时间和保留体积表示。它是色谱定性分析和色谱过程热力 学特性的重要参数。S1)死时间(dead time)lM：不被定相吸附或溶解的组分(如空气.甲烷)从进样到出现其色谱蜂最大值所需的时间,中ON所示。tM也是流动相流经色谱柱所需的时间。据加可求出流动相平均流 速柱长二L 死时间一 tM2)保留时间(retentio n time)稻臬组分通过色i晋柱所需时间，即试样从进样到出现峰极大值时的时间，图中o B 所示。在一定色谱体系和操作条件下,任何一种化合物都有一个确 定的保留时间，这是色谱定性的依据。3)倜整保留时间(adjusted retentio n time)t%：扣除死时间后的S保留时间，它是组分在定相中的滞留时间。中4 所示，即t R=Rt%反映了组分在色谱过程中，与固定相相互作用所消耗的时间,是各组分产生差速迁移的物理化学基础。4)死体积(dead vo lume)心：色谱柱内载气所占的体积。M M Qv,o其中必，。为柱出口的载气流速(mLmin)5)保留体积(retentio n vo lume)%：指从进样到待测物在柱 后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。VR=tR%,。6)倜整保留体积(adjusted retentio n vo lume)V ir:扣除死体 积后的保留体积。匕=VR-VM=h,Qv,o7）相对保留值（relative retentio n time）,2组份2的调整保留值与组份I的调整保留值之比。土意:只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长心填充情况及流动相流速无关，因此，在色谱分析中，尤其是GC中广泛用于定性的依据!2.r21亦可用来表示固定相（色谱柱）的选择性叫如值越大,相邻两组分的t R相差越大,分离得越好。=1，两组分不能被分离。三.色谱流出曲线的意义（重要信息）:/色谱峰数二样品中单组份的最少个数;/色谱保留值定性依据;/色谱峰高或面积定量依据;/色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价 指标；/色谱峰间距 依据。定相或流动相选择是否合适的02、3色谱基本理论一、描述分配过程的参数 二、色谱分离的基本理论 塔板理论速率理论一描述分配过程的参数1.分配系数神/协0 constant K）0描述组分在定相和流动相间的吸附-脱附过程或溶解挥发过程（分配）的参数，称为分配系数。组分在固定相中的浓度=cs 组分在流动相中的浓度二%色诺柱2.分配比便次，0factor or capacity factor,容量因子，容量比,k）在一定温度和压力下，组分在两相间的分配达平S衡时,分配在定相和流动相中的质量比。组分在固定相中的质量 ms csVs组分在流动相中的质量 mM cMVM它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及S定相的体积有关。某组分的M直可由实验测得，它等于该组分的调整保留时间与死时间的比值，即JrTm _ Ir _%rx 一 一tM m%或友=九（1+左）3.K.k与选择因子a的关系:Ir 网二 k(B)二 K(B)4(A)-k(A)K(A)称为相比，它也是反映色谱柱柱型及其结构的重要特性。对填充柱/=635;对毛细管柱,0=501500。两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。结论:K或4反映的是某一组分在两相间的分配，它们都与组分及两 相的性质有关，并随柱温、柱压的变化而变化。K与两相体积无关，而左则随固定相的量而改变。假如两组分的K或k值相等，则a=l,两个组分的色谱峰必将重合,说明无法实现分离。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。塔板理论(P/aCe theory)1.塔板理论的假设2.理论塔板高度和理论塔板数3.有效塔板高度和有效塔板数4.塔板理论的不足k1952年,Martin 和提出。用塔板概念来描述组分在柱中的 分配行为。分储塔:在塔板上多次气液平衡，按沸点不同 而分离。色谱柱:组分在两相间的多次分配平衡，按分 配系数不同而分离。塔板是从精帽塔中借用的，是一种半经验理 论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态1、塔板理论的假设在柱内一小段长度H内，组分能够在两相间迅速达 到平衡。这一小段长称为理论塔板高度H。载气进入色谱柱，不是连续的而是脉动式的，每次进 气为一个板体积。试样开始时都在第。号塔板上,且试样沿色谱柱方向的纵向扩散可略而不计。(4)分配系数在各塔板上是常数。为讨论方便,假设：塔板数为5,进样量：lmg,k=l、塔板号 0 12 3 47AV 0,004 _0：027j0：0：078jM(平衡后)0.027小10.15-/5 6 7 8 9|0.078 0.027 0.0041 0.078 0.027 0.004色谱流出曲线方程式：0.10-/X.10.05-/C _1 1 1_5 10 15N图179 k=l的组分在n=5的色谱柱中的流出曲线厂(r)2Cq?2-u e Leyc/2万2、理论塔板高度和理论塔板数若柱长为L,则每块理论塔板高度”为可见理论塔板数由组分保留值和峰宽决定。由上述两式明白,理论塔板数越多.理论塔板高 度”越小、色谱峰越窄,则柱效越高。3、有效塔板高度和有效塔板数通常以有效塔板数如和有效塔板高度财表示:，=5.54()尸=16(,21/2 1effL感谢您的聆听!