原位分子杂交组织化学.pptx

原位分子杂交组织化学二、原位杂交得基本原理二、原位杂交得基本原理三、原位杂交组织化学技术得应用 1 1 1 1、细胞特异性、细胞特异性、细胞特异性、细胞特异性mRNAmRNAmRNAmRNA转录得定位转录得定位转录得定位转录得定位;2 2 2 2、癌癌癌癌基基基基因因因因、抑抑抑抑癌癌癌癌基基基基因因因因及及及及各各各各种种种种功功功功能能能能基基基基因因因因在在在在转转转转录录录录水水水水平得表达平得表达平得表达平得表达 及其变化得研究及其变化得研究及其变化得研究及其变化得研究;3 3 3 3、病原微生物检测、病原微生物检测、病原微生物检测、病原微生物检测;4 4 4 4、基因在染色体上得定位基因在染色体上得定位基因在染色体上得定位基因在染色体上得定位;5 5 5 5、检测染色体得变化检测染色体得变化检测染色体得变化检测染色体得变化;6 6 6 6、分裂间期细胞遗传学得研究。分裂间期细胞遗传学得研究。分裂间期细胞遗传学得研究。分裂间期细胞遗传学得研究。四、核酸探针得种类根据探针得核酸性质不同根据探针得核酸性质不同根据探针得核酸性质不同根据探针得核酸性质不同 DNADNADNADNA探针、探针、探针、探针、RNARNARNARNA探针、探针、探针、探针、cDNAcDNAcDNAcDNA探针、探针、探针、探针、cRNAcRNAcRNAcRNA探针、探针、探针、探针、寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针根据探针得标记方法不同根据探针得标记方法不同根据探针得标记方法不同根据探针得标记方法不同 放射性探针放射性探针放射性探针放射性探针:32323232P P P P、3 3 3 3H H H H、35353535S S S S 非放射性探针非放射性探针非放射性探针非放射性探针:生物素标记生物素标记生物素标记生物素标记 地高辛标记地高辛标记地高辛标记地高辛标记 荧光标记荧光标记荧光标记荧光标记 DNA DNA探针探针1 1 1 1、克隆在质粒载体中克隆在质粒载体中克隆在质粒载体中克隆在质粒载体中,可以无限增殖可以无限增殖可以无限增殖可以无限增殖,制备简便。制备简便。制备简便。制备简便。2 2 2 2、不易降解。不易降解。不易降解。不易降解。3.3.3.3.标记得方法较成熟多样标记得方法较成熟多样标记得方法较成熟多样标记得方法较成熟多样(切口平移等切口平移等切口平移等切口平移等)cDNA cDNA 探针探针1 1 1 1、互补于互补于互补于互补于 mRNA mRNA mRNA mRNA 得得得得DNA DNA DNA DNA 分子。分子。分子。分子。2 2 2 2、逆转录合成逆转录合成逆转录合成逆转录合成,不含内含子序列不含内含子序列不含内含子序列不含内含子序列,适宜基因表达得检测。单链比双适宜基因表达得检测。单链比双适宜基因表达得检测。单链比双适宜基因表达得检测。单链比双链灵敏度高链灵敏度高链灵敏度高链灵敏度高,且不需变性且不需变性且不需变性且不需变性,使能与靶使能与靶使能与靶使能与靶mRNAmRNAmRNAmRNA结合得探针浓度提高。结合得探针浓度提高。结合得探针浓度提高。结合得探针浓度提高。cRNAcRNA探针探针1.1.1.1.单链分子单链分子单链分子单链分子,杂交反应效率高。杂交反应效率高。杂交反应效率高。杂交反应效率高。2.2.2.2.可控制转录方向可控制转录方向可控制转录方向可控制转录方向,得到同义得到同义得到同义得到同义RNA RNA RNA RNA 探针探针探针探针(与与与与mRNAmRNAmRNAmRNA同序列同序列同序列同序列),),),),或反义或反义或反义或反义RNA RNA RNA RNA 探针探针探针探针(cRNA,cRNA,cRNA,cRNA,与与与与mRNAmRNAmRNAmRNA 互补互补互补互补)。3.3.3.3.可检测可检测可检测可检测DNA DNA DNA DNA 和和和和mRNA,mRNA,mRNA,mRNA,还可观察基因得转录状况。还可观察基因得转录状况。还可观察基因得转录状况。还可观察基因得转录状况。4.4.4.4.易于降解易于降解易于降解易于降解,标记方法复杂。标记方法复杂。标记方法复杂。标记方法复杂。寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针1.1.1.1.链短、分子量小、序列复杂度低链短、分子量小、序列复杂度低链短、分子量小、序列复杂度低链短、分子量小、序列复杂度低,杂交时间比克隆探针短。杂交时间比克隆探针短。杂交时间比克隆探针短。杂交时间比克隆探针短。2.2.2.2.可识别靶序列中一个碱基得变化可识别靶序列中一个碱基得变化可识别靶序列中一个碱基得变化可识别靶序列中一个碱基得变化,故成套探针用于碱基点突变得检测。故成套探针用于碱基点突变得检测。故成套探针用于碱基点突变得检测。故成套探针用于碱基点突变得检测。3.3.3.3.一次可大量合成一次可大量合成一次可大量合成一次可大量合成,价格低廉价格低廉价格低廉价格低廉,易于标记。易于标记。易于标记。易于标记。4.4.4.4.缺点缺点缺点缺点:与克隆探针比较与克隆探针比较与克隆探针比较与克隆探针比较,特异性差特异性差特异性差特异性差,杂交信号弱。杂交信号弱。杂交信号弱。杂交信号弱。设计筛选寡核苷酸探针得原则设计筛选寡核苷酸探针得原则1.1.1.1.长长长长30-50bp,30-50bp,30-50bp,30-50bp,长探针则杂交时间长长探针则杂交时间长长探针则杂交时间长长探针则杂交时间长,短则特异性短则特异性短则特异性短则特异性差。差。差。差。2.2.2.2.碱基成分碱基成分碱基成分碱基成分:G G G GC C C C含量为含量为含量为含量为 40%40%40%40%-60%-60%-60%-60%。3.3.3.3.探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针分子内不能有互补区。探针种类探针种类探针种类探针种类 优点优点优点优点 缺点缺点缺点缺点 cDNA cDNA cDNA cDNA 1 1 1 1、制、制、制、制备简单备简单 2 2 2 2、放射比活性高、放射比活性高、放射比活性高、放射比活性高 3 3 3 3、信号特异性、信号特异性、信号特异性、信号特异性强强强强 4 4 4 4、杂交体较稳定、杂交体较稳定、杂交体较稳定、杂交体较稳定 1 1 1 1、变变性后才能使用性后才能使用性后才能使用性后才能使用 2 2 2 2、要基因克隆、要基因克隆、要基因克隆、要基因克隆 3 3 3 3、组织组织穿透力差穿透力差穿透力差穿透力差 4 4 4 4、易于退火、易于退火、易于退火、易于退火 cRNA cRNA cRNA cRNA 1 1 1 1、信号特异性、信号特异性、信号特异性、信号特异性强强强强 2 2 2 2、不需、不需、不需、不需变变性性性性 3 3 3 3、杂杂交后可用交后可用交后可用交后可用RNaseRNaseRNaseRNase除去除去除去除去 未未未未杂杂交得探交得探交得探交得探针针 4 4 4 4、杂杂交体非常交体非常交体非常交体非常稳稳定定定定 5 5 5 5、不会退火不会退火不会退火不会退火 1 1 1 1、易被易被易被易被RnaseRnaseRnaseRnase降解降解降解降解 2 2 2 2、易吸附于器皿上易吸附于器皿上易吸附于器皿上易吸附于器皿上 3 3 3 3、组织组织穿透力差穿透力差穿透力差穿透力差 4 4 4 4、需做亚克隆需做亚克隆需做亚克隆需做亚克隆寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸 1 1 1 1、易制备、易制备、易制备、易制备 2 2 2 2、使用方便、使用方便、使用方便、使用方便 3 3 3 3、组织组织穿透力穿透力穿透力穿透力强强强强 4 4 4 4、不需做克隆不需做克隆不需做克隆不需做克隆 5 5 5 5、不会退火、不会退火、不会退火、不会退火 6 6 6 6、只要知道氨基酸顺序便、只要知道氨基酸顺序便、只要知道氨基酸顺序便、只要知道氨基酸顺序便 可制备探针可制备探针可制备探针可制备探针 1 1 1 1、需核酸合成仪、需核酸合成仪、需核酸合成仪、需核酸合成仪 2 2 2 2、需明确需明确需明确需明确mRNAmRNAmRNAmRNA顺顺序序序序 3 3 3 3、单单碱基碱基碱基碱基错误错误将影响将影响将影响将影响杂杂交交交交 4 4 4 4、杂交体不太稳定杂交体不太稳定杂交体不太稳定杂交体不太稳定 五五、探针标记探针标记 探针得标记物分为放射性标记和非放射探针得标记物分为放射性标记和非放射性标记两大类性标记两大类:放射性标记物一般为放射性标记物一般为125125I I、3535S S或或3232P;P;非放射性标记有生物素或地高辛得间接非放射性标记有生物素或地高辛得间接标记标记,也有也有FITCFITC或者罗丹明对探针分子得或者罗丹明对探针分子得直接标记。直接标记。10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流大家有疑问的，可以询问和交流探针标记方法比较探针标记方法比较1.1.敏感性敏感性敏感性敏感性:放射性探针地高辛探针生物素探放射性探针地高辛探针生物素探放射性探针地高辛探针生物素探放射性探针地高辛探针生物素探针针针针2.2.对人危害性对人危害性对人危害性对人危害性:放射性探针、生物素探针放射性探针、生物素探针放射性探针、生物素探针放射性探针、生物素探针3.3.放射性探针受半衰期限制放射性探针受半衰期限制放射性探针受半衰期限制放射性探针受半衰期限制,不可长期保存。不可长期保存。不可长期保存。不可长期保存。4.4.生物素探针受内源性生物素影响生物素探针受内源性生物素影响生物素探针受内源性生物素影响生物素探针受内源性生物素影响,可致假阳性可致假阳性可致假阳性可致假阳性;地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。地高辛探针则显色复杂。探针标记方法探针标记方法 探针标记方法很多探针标记方法很多探针标记方法很多探针标记方法很多,大致分为大致分为大致分为大致分为:引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。引入法和化学修饰法。*引入法引入法引入法引入法:运用标记好得核苷酸来合成探针运用标记好得核苷酸来合成探针运用标记好得核苷酸来合成探针运用标记好得核苷酸来合成探针;*化学修饰法化学修饰法化学修饰法化学修饰法:采用化学方法将标记物掺入已采用化学方法将标记物掺入已采用化学方法将标记物掺入已采用化学方法将标记物掺入已合成得探针分子中去合成得探针分子中去合成得探针分子中去合成得探针分子中去,或改变探针原有得结构或改变探针原有得结构或改变探针原有得结构或改变探针原有得结构,使之产生特定得化学基团。使之产生特定得化学基团。使之产生特定得化学基团。使之产生特定得化学基团。引入法较化学修饰法更常用,按其整合得方法不同,引入法分为:*缺口平移法 *随机引物法 *末端标记法 *PCR扩增标记法 *RNA体外转录法缺口平移法缺口平移法 原理原理原理原理:利用利用利用利用DNADNADNADNA酶酶酶酶I I I I在双链在双链在双链在双链DNADNADNADNA得各股单链得不同位得各股单链得不同位得各股单链得不同位得各股单链得不同位 置上造成随机切口置上造成随机切口置上造成随机切口置上造成随机切口,再利用大肠杆菌再利用大肠杆菌再利用大肠杆菌再利用大肠杆菌DNADNADNADNA聚合酶进聚合酶进聚合酶进聚合酶进 行行行行53535353修复修复修复修复,将已标记将已标记将已标记将已标记dNTPdNTPdNTPdNTP 掺入到新合成得掺入到新合成得掺入到新合成得掺入到新合成得DNADNADNADNA 链中。链中。链中。链中。随机引物法随机引物法 原理原理原理原理:将长将长将长将长6 6 6 6个核苷酸得寡核苷酸片段个核苷酸得寡核苷酸片段个核苷酸得寡核苷酸片段个核苷酸得寡核苷酸片段(随机引物随机引物随机引物随机引物)与与与与 单链单链单链单链DNADNADNADNA或变性得双链或变性得双链或变性得双链或变性得双链DNADNADNADNA随机互补结合随机互补结合随机互补结合随机互补结合(退火退火退火退火),),),),在在在在 引物得引物得引物得引物得3333羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物羟基末端逐个加上核苷酸直至下一个引物,即形成标记得即形成标记得即形成标记得即形成标记得DNADNADNADNA探针。探针。探针。探针。末端标记法末端标记法 原原理理:将将标标记记物物导导入入线线性性DNADNA或或RNARNA得得55端端或或33端端得得一一类类 标记方法。主要分为标记方法。主要分为:5:5末端标记法末端标记法,33末端标记末端标记 法法,T4T4聚合酶替代法。聚合酶替代法。五、ISHH基本程序(以检测组织细胞内得mRNA为例)(一一)杂交前处理杂交前处理 玻片预处理玻片预处理玻片预处理玻片预处理(灭活灭活灭活灭活Rnase)Rnase)Rnase)Rnase)切片处理切片处理切片处理切片处理(增强组织通透性和探针穿透性增强组织通透性和探针穿透性增强组织通透性和探针穿透性增强组织通透性和探针穿透性)1 1、玻片预处理玻片预处理(灭活灭活Rnase)Rnase)玻片置于热肥皂水浸泡玻片置于热肥皂水浸泡玻片置于热肥皂水浸泡玻片置于热肥皂水浸泡4 4 4 4小时以上小时以上小时以上小时以上 自来水自来水自来水自来水 清洗干净置于酸缸中浸泡过夜清洗干净置于酸缸中浸泡过夜清洗干净置于酸缸中浸泡过夜清洗干净置于酸缸中浸泡过夜 清水洗净烘清水洗净烘清水洗净烘清水洗净烘 干干干干 烘箱温度最好在烘箱温度最好在烘箱温度最好在烘箱温度最好在150150150150或以上烤干或以上烤干或以上烤干或以上烤干4 4 4 4小时小时小时小时 以上。以去除任何以上。以去除任何以上。以去除任何以上。以去除任何RNARNARNARNA酶酶酶酶、盖玻片在有条件时盖玻片在有条件时盖玻片在有条件时盖玻片在有条件时 最好用硅化处理最好用硅化处理最好用硅化处理最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放锡箔纸包裹无尘存放、粘附剂粘附剂粘附剂粘附剂:常用得粘附剂多聚赖氨酸溶液。常用得粘附剂多聚赖氨酸溶液。常用得粘附剂多聚赖氨酸溶液。常用得粘附剂多聚赖氨酸溶液。2 2 2 2、切片处理切片处理切片处理切片处理:增强组织通透性和探针穿透性增强组织通透性和探针穿透性增强组织通透性和探针穿透性增强组织通透性和探针穿透性1)1)1)1)充分脱蜡充分脱蜡充分脱蜡充分脱蜡2)2)2)2)防止探针与组织中碱性蛋白静电结合防止探针与组织中碱性蛋白静电结合防止探针与组织中碱性蛋白静电结合防止探针与组织中碱性蛋白静电结合,降低背景降低背景降低背景降低背景 稀酸处理稀酸处理稀酸处理稀酸处理(0(0(0(0、2 2 2 2 mol/l HCL 10min)mol/l HCL 10min)mol/l HCL 10min)mol/l HCL 10min)乙酰化乙酰化乙酰化乙酰化(0(0(0(0、25%25%25%25%乙酸酐乙酸酐乙酸酐乙酸酐10101010min)min)min)min)3)3)3)3)去污剂去污剂去污剂去污剂:增加组织通透性增加组织通透性增加组织通透性增加组织通透性,利于探针进入利于探针进入利于探针进入利于探针进入 0 0 0 0、01%01%01%01%-0-0-0-0、3%Triton X-100 15min3%Triton X-100 15min3%Triton X-100 15min3%Triton X-100 15min4)4)4)4)酶消化酶消化酶消化酶消化:使经固定后被遮蔽得靶核酸暴露使经固定后被遮蔽得靶核酸暴露使经固定后被遮蔽得靶核酸暴露使经固定后被遮蔽得靶核酸暴露 蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K、链酶蛋白酶、胃蛋白酶链酶蛋白酶、胃蛋白酶链酶蛋白酶、胃蛋白酶链酶蛋白酶、胃蛋白酶 1 1 1 1ug/mlug/mlug/mlug/ml蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K,37,15-30minK,37,15-30minK,37,15-30minK,37,15-30min 5)5)5)5)杂交缓冲液孵育杂交缓冲液孵育杂交缓冲液孵育杂交缓冲液孵育:阻断非特异性结合位点阻断非特异性结合位点阻断非特异性结合位点阻断非特异性结合位点 3 3、防止防止RNARNA酶得污染酶得污染由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNARNARNARNA酶酶酶酶,为为为为防止其污染影响实验结果防止其污染影响实验结果防止其污染影响实验结果防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程都需戴在整个杂交前处理过程都需戴在整个杂交前处理过程都需戴在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套消毒手套消毒手套消毒手套、所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日日日日置高温置高温置高温置高温(160)(160)(160)(160)烘烤以达到消除烘烤以达到消除烘烤以达到消除烘烤以达到消除RNARNARNARNA酶得目得酶得目得酶得目得酶得目得、要破坏要破坏要破坏要破坏RNARNARNARNA酶酶酶酶,其最低温度必需在其最低温度必需在其最低温度必需在其最低温度必需在150150150150左右左右左右左右、(二二)杂交反应杂交反应:将杂交液滴于经预杂交处理得组织细胞将杂交液滴于经预杂交处理得组织细胞将杂交液滴于经预杂交处理得组织细胞将杂交液滴于经预杂交处理得组织细胞切片上切片上切片上切片上,加盖硅化得盖玻片加盖硅化得盖玻片加盖硅化得盖玻片加盖硅化得盖玻片,按所要求得温度按所要求得温度按所要求得温度按所要求得温度进行得孵化。进行得孵化。进行得孵化。进行得孵化。杂交液杂交液 1)1)1)1)一定浓度得探针一定浓度得探针一定浓度得探针一定浓度得探针2)2)2)2)高浓度高浓度高浓度高浓度NaNaNaNa+:使杂交率增加使杂交率增加使杂交率增加使杂交率增加,减少静电结合减少静电结合减少静电结合减少静电结合3 3 3 3)硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖:10%:10%:10%:10%硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖硫酸葡聚糖,形成探针混合液基质形成探针混合液基质形成探针混合液基质形成探针混合液基质,对对对对DNADNADNADNA有浓缩作用有浓缩作用有浓缩作用有浓缩作用,可提高杂交得反应速度可提高杂交得反应速度可提高杂交得反应速度可提高杂交得反应速度10101010倍以上倍以上倍以上倍以上,但不影响探针得洗脱强度但不影响探针得洗脱强度但不影响探针得洗脱强度但不影响探针得洗脱强度;杂交时常用浓度为杂交时常用浓度为杂交时常用浓度为杂交时常用浓度为5%5%5%5%10%,10%,10%,10%,但浓度高时会使溶液得粘度增大但浓度高时会使溶液得粘度增大但浓度高时会使溶液得粘度增大但浓度高时会使溶液得粘度增大,不利杂交探不利杂交探不利杂交探不利杂交探 针得渗透。针得渗透。针得渗透。针得渗透。4 4 4 4)牛血清白蛋白、载体牛血清白蛋白、载体牛血清白蛋白、载体牛血清白蛋白、载体DNADNADNADNA或或或或RNA:RNA:RNA:RNA:阻断非特异阻断非特异阻断非特异阻断非特异 性结合性结合性结合性结合,降低背景。降低背景。降低背景。降低背景。探针浓度探针浓度探针浓度探针浓度:以最低浓度达到与靶核酸得最大饱和结合度以最低浓度达到与靶核酸得最大饱和结合度以最低浓度达到与靶核酸得最大饱和结合度以最低浓度达到与靶核酸得最大饱和结合度 0 0 0 0、5-55-55-55-5、0 0 0 0ug/mlug/mlug/mlug/ml,10-20,10-20,10-20,10-20ul/ul/ul/ul/片片片片杂交时间杂交时间杂交时间杂交时间:一般为一般为一般为一般为1620162016201620小时小时小时小时杂交严格度杂交严格度杂交严格度杂交严格度:反应体系中避免非同源性或只有部分同源性得核酸顺序形成反应体系中避免非同源性或只有部分同源性得核酸顺序形成反应体系中避免非同源性或只有部分同源性得核酸顺序形成反应体系中避免非同源性或只有部分同源性得核酸顺序形成杂交复合物得条件。杂交复合物得条件。杂交复合物得条件。杂交复合物得条件。低杂交温度、低甲酰胺得浓度、高离子强度条件下低杂交温度、低甲酰胺得浓度、高离子强度条件下低杂交温度、低甲酰胺得浓度、高离子强度条件下低杂交温度、低甲酰胺得浓度、高离子强度条件下,严格度低严格度低严格度低严格度低,反之严格度高。严格度愈高反之严格度高。严格度愈高反之严格度高。严格度愈高反之严格度高。严格度愈高,杂交反应特异性愈强杂交反应特异性愈强杂交反应特异性愈强杂交反应特异性愈强,但敏感性愈但敏感性愈但敏感性愈但敏感性愈低。低。低。低。