DB21∕T 3692-2023 蓝莓常见品种鉴定技术规程 SSR分子标记法(辽宁省).pdf

ICS65.020.01CCS B 6021辽宁省地方标准DB21/T 36922023蓝莓常见品种鉴定技术规程SSR 分子标记法Technical specification for identification of common blueberry varietiesby SSR molecular markers2023-01-30 发布2023-03-02 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 36922023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14试验准备.25操作程序.26结果分析.4附录 A（规范性）仪器设备与化学试剂.5附录 B（规范性）溶液配制.6附录 C（规范性）核心引物信息.8附录 D（资料性）扩增图谱.9附录 E（资料性）指纹图谱.10附录 F（规范性）指纹图谱鉴定报告.11图 D.1引物 SSR1007、SSR1183、SSR160 在 12 个蓝莓主栽品种中的扩增图谱.9表 C.14 对 SSR 核心引物信息.8表 E.112 个蓝莓主栽品种的 SSR 数字指纹图谱.10表 F.1蓝莓品种 SSR 指纹图谱鉴定报告.11DB21/T 36922023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由辽宁省林业和草原局提出并归口。本文件起草单位：大连大学、大连森茂现代农业有限公司。本文件主要起草人：徐国辉，王贺新，楚立威，娄鑫，赵倩，温立柱，崔青青，周永斌。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：[phone]。文件起草单位通讯地址：大连大学（大连市经济技术开发区学府大街10号），联系电话：[phone]。DB21/T 369220231蓝莓常见品种鉴定技术规程SSR 分子标记法1范围本文件规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记法对12个常见蓝莓品种，进行鉴定过程中样品准备、DNA提取、DNA质量检测、PCR扩增、PCR产物检测等方面的技术要求。本文件适用于SSR分子标记技术构建12个常见蓝莓品种DNA指纹图谱过程中DNA分子数据采集和鉴别。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法LY/T 2426枣品种鉴定技术规程 SSR分子标记法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1聚合酶链式反应 PCRpolymerase chain reaction聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR)，是以DNA为模板，在DNA聚合酶、引物、dNTP的共同作用下使目标片段扩增并用于检测分析。3.2SSR 标记simple sequence rpeats marker由几个核苷酸（一般为16个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。3.3核心引物core primers扩增产物具有高度的稳定性和一致性，并具有较强的鉴别能力，可以用于进行12个蓝莓常见品种比对的人工合成引物。3.4SSR 指纹图谱SSR finger printDB21/T 369220232利用SSR核心引物，对不同的蓝莓品种进行PCR扩增，根据不同品种在DNA水平上的差异，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，获得的具有差异片段的成像图，并通过引物结合字母标记法对不同的蓝莓品种进行特异性标记。4试验准备4.1仪器与试剂仪器与试剂详见附录A。4.2溶液配制溶液配制方法详见附录B，其中试剂配制所用水应符合GB/T 6682规定的一级水的要求，其中银染、显色溶液的配制可以使用符合三级水的要求。4.3核心引物核心引物信息详见附录C。5操作程序5.1样品准备选取蓝莓新鲜叶片，-20 运输，-80 进行长期保存。5.2DNA 提取对于采集的新鲜嫩叶，使用试剂盒（TIANGEN）进行DNA提取。操作步骤如下：a)处理材料：取植物新鲜叶片 20 mg，加入液氮充分碾磨后转移至 1.5 mL 离心管中，加入 400 L缓冲液（LP2）和 6 L RNase A(10 mg/mL)，漩涡震荡 1 min，室温放置 10 min；b)加入 130 L 缓冲液（LP2），充分混匀，漩涡震荡 1 min；c)12,000 rpm(13,400 g)离心 5 min，将上清液移至新的离心管中；d)加入 1.5 倍体积的缓冲液（LP3）（例如 500 L 的上清液加 750 L 缓冲液（LP3），立即充分振荡混匀 15 s。此时会出现絮状沉淀；e)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱（CB3）中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm(13,400 g)离心 30 s，倒掉废液，吸附柱（CB3）放入收集管中；f)向吸附柱（CB3）中加入 600 L 漂洗液（PW）（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(13,400 g)离心 30 s，倒掉废液，吸附柱（CB3）放入收集管中；g)重复操作步骤 f；h)将吸附柱（CB3）放回收集管中，12,000 rpm(13,400 g)离心 2 min，倒掉废液。将吸附柱（CB3）置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；i)将吸附柱(CB3)转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50 L-200 L 洗脱缓冲液（TE），室温放置 2 min-5 min，12,000 rpm(13,400 g)离心 2 min，将溶液收集到离心管中，以待检测。5.3DNA 质量检测5.3.1琼脂糖凝胶电泳检测 DNADB21/T 369220233取1 L提取的DNA原液，在100 V的电压下，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳20 min左右，取出凝胶，在紫外凝胶成像系统上观察电泳条带应单一、无拖尾。5.3.2鉴定 DNA 的浓度和质量吸取1.5 L提取的DNA原液，通过Nano Drop检测DNA浓度和是否有RNA、蛋白质或酚污染，纯净样品DNA OD260/OD280的比值应在1.7-1.9之间。5.4PCR 扩增5.4.1反应体系SSR 的反应体系：正反向引物（10 mol/L）各1 L、2Taq PCR Master Mix 8 L、模板100 ng、添加灭菌超纯水至20 L。所使用的SSR引物根据已公布的蓝莓品种Drapper基因组自主研发获得。5.4.2反应程序94 预变性10 min，94 变性40 s，退火70 s（具体退火温度根据引物来定，详见附录C），72 延伸2 min，35个循环，72 延伸10 min。5.5PCR 产物检测扩增产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，通过扫描仪进行拍照，用人工读带和字母数字结合的方法进行分析。5.5.1凝胶制备将洗净晾干的玻璃板用水平灌胶的方式组装玻璃板，铁夹固定，取8 mL 5 TBE，16 mL30%丙烯酰胺，15 mL去离子水于烧杯中，加入0.28 mL的10%APS，14 L的TEMED(每100 mL聚丙烯酰胺加35 L TEMED)（参考LY/T 2426的方法进行凝胶制备），混匀灌入板中，插入梳子，等待聚合，拔出梳子，吸取多余的水，装板。5.5.2点样用微量移液器取3 L-5 L（具体数值依据点样孔大小确定）PCR产物加入样品槽，每加一个样品后，在电泳液中吸打清洗移液器两次，最后加入marker用于区分不同大小的条带。5.5.3电泳加样完毕后，加入电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板下方边缘，将电源线正极接下槽，负极接上槽。电压为120 V，根据指示剂位置调整时间，电泳到样品与marker到达胶板的末端处时停止电泳，电泳时间约为2 h。5.5.4银染显色a)玻璃板的分离：电泳结束之后，小心地将长、短玻璃分开；b)固定胶：将粘在一起的聚丙烯酰胺的长玻璃板放入塑料浅盘中，加入固定液，将玻璃板在摇床上缓慢摇动 20 min 或至电泳示踪液消失。凝胶可在固定液中静止过夜；c)染色：将凝胶浸入染色液中并在摇床上缓慢摇动 20 min；DB21/T 369220234d)显色反应：将凝胶浸入蒸馏水中，清洗两次，每次 10 s，然后取出，沥干水分，立即放入盛有预冷显色液的塑料盘中，并于摇床上缓慢摇动持续显色，直至全部条带出现；e)洗胶：用蒸馏水漂洗凝胶两次，每次 2 min；f)干胶：通过热对流或室温放置，使胶变干，然后在浅色的背景下扫描照相。5.5.5成像银染结果于凝胶成像仪上进行观察拍照。6品种鉴定6.1指纹图谱的构建在选取的12个常见蓝莓品种中，对4对核心引物SSR1007、SSR1153、SSR1183、SSR160在12个蓝莓品种中的扩增结果进行记录，扩增结果见附录E。每对引物只分析目标条带附近的扩增位点，按照电泳图中从上到下依次命名为A、B、C、D 等，将其整理为数字指纹图谱，图谱见附录F。6.2品种鉴定将需要进行品种鉴定的材料根据操作程序进行样品准备、DNA提取、DNA质量检测、PCR扩增与PCR产物检测，将统计得到的条带情况与前期构建的指纹图谱进行比对，得到与指纹图谱中一致的品种，认定为“疑似相同品种”，结合田间表型鉴定，对于需要鉴定的材料进行品种鉴定，并出具鉴定报告，鉴定报告见附录G。DB21/T 369220235附录A（规范性）仪器设备与化学试剂A.1仪器设备高压灭菌锅（105 136，最大工作压力0.22 MPa）；凝胶自动扫描仪（400百万像素）；高速冷冻离心机（最大离心力不小于15000 g）；PCR扩增仪（0 100）；多功能酶标仪；恒温水浴锅（室温99）；电子天平（最小显示0.0001 g）；电泳仪；垂直电泳槽（样品通量1.0 mm厚）；磁力搅拌器（0 r/min2500 r/min，室温100）；酸度计（-2.0020.000 pH）；微量移液器（2 L、10 L、100 L、200 L、500 L和1000 L）。A.2化学试剂TIANGEN新型植物基因组DNA试剂盒、液氮、无水乙醇、琼脂糖、Gold View染料、6 loadingbuffer、冰乙酸、琼脂糖、2000 bp DNA Ladder、100 bp DNA Ladder、2*Taq PCR Master Mix、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟基甲基氨甲烷（Tris）、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、过硫酸铵（APS）、硝酸银（AgNO3）、氢氧化钠（NaOH）、37%甲醛、SSR引物、灭菌超纯水。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。DB21/T 369220236附录B（规范性）溶液配制B.1配制 1 mol/L NaOH称取4 g NaOH，加水定容至100 mL。B.2配制 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液称取121.1 g Tris，浓盐酸调至pH 8.0，加水定容至1 L，高压灭菌备用。B.3配制 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液称取186.1 g EDTA-Na2，800 mL水，1 mol/L NaOH调至pH 8.0，加水定容至1 L后高压灭菌备用。B.4配制 1 TE（Tris-EDTA buffer solution）取1 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0），0.2 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），加水定容至100 mL。B.5聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂B.5.1配制70%乙醇取700 mL无水乙醇，加水定容至1 L。B.5.2配制5 TBE缓冲液分别称取54 g三羟基氨基甲烷，27.5 g硼酸，加入800 mL水加热溶解，再加入0.5 mol/L EDTA（pH8.0）溶液20 mL，加水定容至1 L。B.5.3配制1 TBE缓冲液取100 mL 10 TBE，加水定容至1 L。B.5.4配制10%过硫酸铵称取0.5 g过硫酸铵溶于5 mL水中。B.5.5配制12%聚丙烯酰胺凝胶溶液（40 mL）分别取30%丙烯酰胺16 mL、5 TBE 8 mL、10%过硫酸铵0.28 mL、TEMED 0.014 mL、加水15 mL、4 条件下保存。B.5.6配制染色液1 L的蒸馏水中加入3 g的硝酸银和5 mL的冰乙酸、100 mL无水乙醇。B.5.7配制显色液1 L的超纯水中加30 g的NaOH，冰浴冷却，使用前加入5 mL的37%甲醛。B.5.8配制固定/终止液DB21/T 369220237将5 mL的冰乙酸和100 mL的无水乙醇加入到500 mL蒸馏水中，定容至1 L。DB21/T 369220238附录C（规范性）核心引物信息本文件中PCR反应体系中规定使用的引物，用于12个常见蓝莓品种的鉴定，引物信息见表C.1。表 C.1 4 对 SSR 核心引物信息编号引物名称引物序列(53)退火温度1SSR160F：CCACCTTCGGTGGTCTCCCR：TGGCAGCAGTTGAGGGAACA572SSR1007F：TCTCCCTTCTCTCTCTGCACGR：ACTGTGTTTGTACTTCCGCCCT583SSR1153F:TGCTTTCCCATTGACCTGCCR:AGGACGAGATTTGCCCAGCA564SSR1183F：TGGACTCATGTCACTGTACCCAR：TGGCCCACATTGATGTGATGTTT56DB21/T 369220239附录D（资料性）扩增图谱本文件中通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后获得的谱带扩增情况见图D.1图D.1 引物SSR1007、SSR1183、SSR160、SSR1153在12个蓝莓主栽品种中的扩增图谱DB21/T 3692202310附录E（资料性）指纹图谱本文件通过引物结合字母标记法获得的指纹图谱情况见表E.1。表 E.1 12 个蓝莓主栽品种的 SSR 数字指纹图谱序号名称DNA 指纹图谱1杜克（Duke）1A2-3A4-2德雷帕（Draper）1A2-3-4A3休伦（Huron）1B2A3B4B4自由（Liberty）1C2B3C4-5蓝丝带（Blue Ribbon）1D2-3D4-6顶层（Top Shelf）1E2C3A4B7尾声（Last Call）1B2B3B4B8云雀（Meadowlark）1B2-3E4-9法新（Farthing）1B2D3F4B10莱宝（Norman）1F2C3B4C11优瑞卡（Eureka）1B2E3F4B12艾露（Magnifica）1B2-3G4CDB21/T 3692202311附录F（资料性附录）指纹图谱鉴定报告蓝莓品种SSR指纹图谱鉴定报告见表F.1。表 F.1 蓝莓品种 SSR 指纹图谱鉴定报告送检样品编号送检样品名称对照品种编号对照样品名称送检人检测单位依据标准检测引物数量：检测引物编号：SSR 指纹图谱检测结果：检测差异引物和谱带：结论：检测单位（公章）年月日