免疫分析法-.pptx

免疫分析法主讲人：xx1 概概 要要Section headerSection headerSection header 前 言 免疫分析法简介 应用与展望 免疫分析法 致 谢2 前前 言言前言 免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了解其再免疫应答反应中对机体有益的防卫功能和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学学科。自六十年代竞争分析原理提出，定量免疫获得巨大的进展。下面简要介绍免疫分析：3 免疫分析法免疫分析法简简介介 简介 什么叫免疫分析？它是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。4免疫分析法免疫分析法简简介介简介 特点特点可逆性可逆性比例性比例性和反和反应阶段性段性特异性特异性5 免疫分析法免疫分析法简简介介简介特异性特异性：特异性：抗原与抗体抗原与抗体结合反合反应的的专一性一性分子基分子基础:抗原表位与抗体抗原表位与抗体分子高分子高变区之区之间空空间构型的构型的互互补性性6免疫分析法免疫分析法简简介介简介 可逆性可逆性可逆性：可逆性：抗原与相抗原与相应抗体抗体结合成复合物后，合成复合物后，在一定条件下又可解离在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗体均能保持原有的解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构构和活性。和活性。影响因素：影响因素：抗体抗体对相相应抗原的抗原的亲合力合力亲合力越合力越高，高，结合越牢固，越不易解离合越牢固，越不易解离 环境因素境因素对复合物的影响复合物的影响pHpH、离子、离子强度度 7免疫分析法免疫分析法简简介介 简介比例性和反比例性和反应阶段性段性比例性：比例性：抗原与抗体抗原与抗体发生可生可见反反应需遵循一定的量比关系需遵循一定的量比关系抗原抗体反抗原抗体反应比例性示意比例性示意图前前带(prezone)：抗体：抗体过量量后后带(postzone)：抗原：抗原过量量等价等价带(equivalence(equivalence zone)zone)：抗原抗体比例合：抗原抗体比例合适适 8免疫分析法免疫分析法简简介介简介第一第一阶段：特异性段：特异性结合合阶段，反段，反应快，不可快，不可见 第二第二阶段：反段：反应可可见阶段，反段，反应慢，慢，出出现凝集、凝集、沉淀和沉淀和细胞溶解等胞溶解等现象象 9免疫分析免疫分析检测检测分析检测 免疫分析免疫分析检测 免免疫疫标记技技术是是将将一一些些既既易易测定定又又具具有有高高度度敏敏感感性性的的物物质标记到到特特异异性性抗抗原原或或抗抗体体分分子子上上，通通过这些些标记物物的的增增强放放大大效效应来来显示示反反应系系统中中抗抗原原或或抗抗体体的的性性质与与含含量量。10免疫分析免疫分析检测检测分析检测免疫学检测历史演进放射免疫放射免疫检测（兴起于起于2020世世纪7070年代年代)酶联免疫免疫检测（兴起于起于2020世世纪8080年代，各年代，各临床机构普遍使用）；床机构普遍使用）；以化学以化学发光光为代表的代表的光生物学光生物学标记及免及免疫疫检测技技术（2020世世纪9090年代开始推广使年代开始推广使用，用，产品步入成品步入成长期）三个期）三个阶段。段。11免疫分析免疫分析检测检测分析检测技术的分类 放射免疫技放射免疫技术 按示踪物及按示踪物及 荧光免疫技光免疫技术标记种种类分分为 酶免疫技免疫技术 化学化学发光免疫技光免疫技术 金免疫技金免疫技术按按测定物反定物反应体系体系 匀相免疫匀相免疫测定定的物理状的物理状态分分为 非匀相免疫非匀相免疫测定定12免疫分析免疫分析检测检测分析检测放射免疫分析放射免疫分析RIARIA 放射免疫分析是以放射性核素作示踪剂的标记免疫分析方法，具有高度的灵敏性，特异性和精确性，特别适用于激素，多肽等含量微少物质的超微量分析。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。13免疫分析免疫分析检测检测分析检测采用标记抗原（Ag*）和非标记抗原（Ag)竞争性结合有限量特异性抗体（Ab)的反应。14免疫分析免疫分析检测检测分析检测荧光免疫技术 荧光免疫技术的基本原理 利用荧光素标记抗体，使之在涂片上或组织切片上以一定的条件与标本中的待测抗原特异性结合，通过高发光效率的点光源，经过滤色板发出一定波长的光，使标本结合的荧光素激发而产生荧光，借助荧光显微镜来进行观察，可以判断待测抗原或抗体的有无。15免疫分析免疫分析检测检测分析检测常用荧光物质 1、异硫氰酸荧光素（FITC)最大吸收波长为490495nm,最大发射波长为520 530nm,可呈现明亮的黄绿色荧光。2、四乙基罗丹明（RB200)最大吸收波长为570nm,最大发射波长为595600nm,呈桔红色荧光，可与FITC的翠绿色荧光形成鲜明的对比，常用于双重标记或对比染色。3、四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC)最大吸收波长为550nm,最大发射波长为620nm,呈橙红色荧光。16免疫分析免疫分析检测检测分析检测4、藻红蛋白（R-RE)最大吸收波长为565nm,最大发射波长为 578nm,可与FITC一起共用488nm激发光，常用于双色免疫荧光染色。5、镧系螯合物 6、酶作用后产生荧光的物质（荧光底物）17应应用与展望用与展望应用与展望 放射免疫分析（RIA）的应用放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA125、CA199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。18应应用与展望用与展望应用与展望 免疫荧光技术在医学检验中的应用 1、荧光抗体技术在临床检验上已用作细菌，病毒，和寄生虫的检验及自身免疫疾病的诊断等方面。2、免疫荧光间接染色法可用于测定血清中的抗体，用于流行病学调查和临床回顾诊断。其突出特点是能以简单方法同时检测抗体和与抗体其特异反应的组织成分，并能在同一组织中同时检查抗不同组织成分的抗体。19应应用与展望用与展望应用与展望 酶免疫技术 酶免疫技术（EIA）是目前临床应用最多的一种免疫分析技术。主要原理是用酶标记的抗体（或抗原）用于免疫学反应，并以相应底物被酶分解的显色反应对样品中的抗原（或抗体）进行定位分析和鉴定；亦可根据酶催化底物显色的深浅，测定样品中待测抗原或抗体的含量。20应应用与展望用与展望应用与展望 非均相非均相酶免疫分析免疫分析均相均相酶免疫分析免疫分析非均相液相非均相液相酶免疫分析免疫分析非均相固相非均相固相酶免疫分析免疫分析以以聚聚苯苯乙乙烯制制品品作作为载体体的的酶联免疫吸附免疫吸附实验-ELISA酶免疫分析技免疫分析技术根据抗原抗体根据抗原抗体结合反合反应后是否需要分离后是否需要分离结合与游合与游离的离的酶标记物，分物，分为非均相非均相酶免疫免疫测定和均相定和均相酶免疫免疫测定定21应应用与展望用与展望应用与展望 发光免疫技术发光免疫分析法光免疫分析法分类：光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。化学发光：是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。22应应用与展望用与展望应用与展望 新型免疫分析法新型免疫分析法 分子印迹技术 分子印迹技术利用化学手段合成一种高分子聚合物一分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)，MIP能够特异性吸附作为印迹分子的待测物，在免疫分析中可以取代生物抗体，被科学家誉为“人工抗体”。23应应用与展望用与展望应用与展望 实例1 20072007年北京化工大年北京化工大 学的老学的老师在研究在研究了以了以杀虫虫剂乐果果为模板分子，制模板分子，制备了了乐果印迹聚合物，并用果印迹聚合物，并用该印迹聚合物装填印迹聚合物装填的固相萃取柱的固相萃取柱对茶叶中的茶叶中的农药乐果果进行行了分离了分离纯化，化，获得了得了满意的效果，加意的效果，加标乐果在柱中的回收率达果在柱中的回收率达100 100。24应应用与展望用与展望应用与展望 流动注射免疫分析 为提高免疫分析的分析速度和自动化程度，自20世纪80年代中期以来，国外出现了一种新的免疫分析法一流动注射免疫分析法(flowinj ection immunoassay，FIIA)。FIIA综合了两者的特点且可以计算机控制缓冲液的流速、自动进样、检测器的检测及数据处理，具有一些突出的优点，在临床生物样品的检测、低分子药物浓度的临床监测及环境污染物如农药及其代谢物的含量 测定等方面具较广的应用前景。这种分析方法 具有分析时间短、需要样品量小和操作简便等特点。利用FIIA对一些样品分析，测定耗时不足1 rain25应应用与展望用与展望应用与展望 免疫-PCR技术 免疫PCR方法(immuno polymerase chain reaction，I-PCR)是Sano等于1992年将免疫学反应和PCR技术相结合而创建的一种新的检测技术，同时具有抗原一抗体反应的特异性和PCR扩增技术的高效性。它运用PCR强大的扩增能力来放大抗原一抗体特异性反应的信号，使实验中只需数百个抗原分子即可检测，甚至在理论上可检测到1至数个抗原分子。目前，国内外报道的I-PCR的敏感性一般比现行的ELISA法高1O-108倍。目前主要用于检测肿瘤标志物、细胞因子、神经内分泌活性多肽、病毒抗原、细菌、酶、支原体、衣原体等微量抗原。26应应用与展望用与展望应用与展望 27应应用与展望用与展望应用与展望 多组分免疫分析 多组分免疫分析技术(Multi-analyte immunoassay，MIA)现在有两种设计方式：多探针标记法，它基于用不同标记物对多种抗原或半抗原标记，用竞争法测定各物质的量；多组分定位包被空间分辨分析法，即利用空间的不同位置标记同种标记物来测定，在不同的固相体系或同一固相载体上的不同反应区带上包被不同 抗体，用于固相免疫同时测定。目前，该法已取得了相当成功的应用成果。28应应用与展望用与展望应用与展望 药物安全问题已成为21世纪消费者面临的首要问题。为了保证药物的安全，就需要有快速、灵敏的检测技术作支撑和保障。目前，传统的检测方法存在样品前处理时间长，仪器设备昂贵，对技术人员的要求高等弊端。免疫检测技术以其明显的优势处于检测技术的前沿。今天所论述的传统的和新型的免疫检测新技术主要是针对免疫检测的主要环节和今后药物安全检测的发展要求，将这几种技术运用到药物安全检测中必将提高药物安全检测的有效性和实用性。29致致 谢谢致谢感谢xxx老师的悉心指导，全体组员的鼎力配合，感谢大家！30