第六章基因操作中大分子的分离和分析.pptx

第六章基因操作中大分子的分离和分析分离核酸应注意以下几点分离核酸应注意以下几点:减少化学因素对核酸得降解减少化学因素对核酸得降解:酸、碱酸、碱减少物理因素对核酸得降解减少物理因素对核酸得降解:机械力机械力防止核酸得生物降解防止核酸得生物降解:进行核酸分离时最好新进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品鲜生物组织或细胞样品,若不能马上进行提取若不能马上进行提取,应将材料贮存于液氮中或应将材料贮存于液氮中或-70-70冰箱中。冰箱中。1、1DNA提取得步骤提取得步骤一、细胞破碎一、细胞破碎二、除去与核酸结合得蛋白质等杂质二、除去与核酸结合得蛋白质等杂质三、除去其她杂质核酸三、除去其她杂质核酸四、获得四、获得DNA样品样品一、细胞破碎一、细胞破碎 目前细胞破碎主要有物理破碎目前细胞破碎主要有物理破碎(主要就是机主要就是机械破碎械破碎)和非物理破碎和非物理破碎(主要化学破碎和生物酶主要化学破碎和生物酶解解)(一一)、物理破碎、物理破碎 目前常用物理破碎得方法主要有目前常用物理破碎得方法主要有:均质珠子研磨均质珠子研磨振荡、液氮研磨、乳钵研磨、冻融、煮沸、超声波振荡、液氮研磨、乳钵研磨、冻融、煮沸、超声波(ultrasonication)(ultrasonication)和微波加热和微波加热(microwave heating)(microwave heating)等。等。1 1、微波加热对于革兰氏阳性细菌非常有效、微波加热对于革兰氏阳性细菌非常有效,但就是加热但就是加热必须适中必须适中,否则否则DNADNA可能被破坏。可能被破坏。2 2、热激处理包含、热激处理包含冷冻冷冻和和融解融解两步两步,冷冻冷冻主要就是用液氮、主要就是用液氮、冰箱冰箱(7070、20)20)或冰或冰,而而融解融解主要就是主要就是3737、5050、65 65 或或100100水浴水浴,其中冻融循环次数和孵育其中冻融循环次数和孵育时间可以根据不同要求变化。时间可以根据不同要求变化。如如,Lee(1996),Lee(1996)等通过用吖啶橙染色直接统计经三次热等通过用吖啶橙染色直接统计经三次热激激(70/65)70/65)联合溶菌酶和联合溶菌酶和SDSSDS处理后得细胞裂解处理后得细胞裂解率为率为90%90%。热激处理比其她物理处理得剪切力要小很多热激处理比其她物理处理得剪切力要小很多,而且提而且提取效率、得到片段完整性较好。取效率、得到片段完整性较好。3 3、珠子打击法珠子打击法(bead beating)(bead beating)n加入不同直径得玻璃珠加入不同直径得玻璃珠,有利于不同细胞有利于不同细胞DNADNA得提取得提取:直径为直径为710 710 1180 m 1180 m 玻璃珠可打碎土壤块和植玻璃珠可打碎土壤块和植物细胞物细胞;425 425600 m 600 m 玻璃珠可打碎真菌、植物和其她真玻璃珠可打碎真菌、植物和其她真核细胞核细胞;106 m 106 m 玻璃珠可打碎细菌细胞。玻璃珠可打碎细菌细胞。n在使用玻璃珠研磨法时在使用玻璃珠研磨法时,应在珠子大小和数量上具有应在珠子大小和数量上具有合适得配比合适得配比,这样才能有效地破碎和抽提微生物得营这样才能有效地破碎和抽提微生物得营养细胞、内生孢子或分生孢子得养细胞、内生孢子或分生孢子得DNADNA。珠子打击法优点珠子打击法优点:有更好得裂解效率和产量有更好得裂解效率和产量,而且其而且其DNADNA产量随着打击时间和打击速度得增加而增加产量随着打击时间和打击速度得增加而增加,因此因此,可以用较小得抽提缓冲液体积处理较小得样品得到满可以用较小得抽提缓冲液体积处理较小得样品得到满意得获得率。意得获得率。珠子打击法缺点珠子打击法缺点:随着打击处理而增加产量得同时随着打击处理而增加产量得同时,剪剪切力增大并导致小片段增加切力增大并导致小片段增加,从而影响从而影响PCRPCR得敏感性得敏感性,甚至可能增加嵌合体形成率而影响随后得分子生物学甚至可能增加嵌合体形成率而影响随后得分子生物学处理及结果处理及结果,特别就是引起多样性分析得偏差。特别就是引起多样性分析得偏差。(二二)非物理破碎法非物理破碎法 非物理破碎法相对比较温和非物理破碎法相对比较温和,利于保持利于保持DNADNA得完整性。其主要就是包括化学破碎和生物酶得完整性。其主要就是包括化学破碎和生物酶解。解。1、化学破碎、化学破碎 目前化学破碎法常用得化学试剂主要就是目前化学破碎法常用得化学试剂主要就是阴离子型去污剂阴离子型去污剂SDS(SDS(十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠)、Sarkosyl(N-Sarkosyl(N-十二烷基肌氨酸钠十二烷基肌氨酸钠)和阳离子型去和阳离子型去污剂污剂CTAB(CTAB(十六烷基三乙基溴化铵十六烷基三乙基溴化铵)等。等。大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静继续保持安静2、生物酶解、生物酶解在生物酶解中最普遍使用得就是溶菌酶在生物酶解中最普遍使用得就是溶菌酶,其主要就是通过其主要就是通过水解细胞壁而达到裂解细胞得目得水解细胞壁而达到裂解细胞得目得,特别就是对革兰氏阳特别就是对革兰氏阳性菌得破碎性菌得破碎,同时溶菌酶还可以水解糖苷键和腐殖酸得化同时溶菌酶还可以水解糖苷键和腐殖酸得化合键从而改善合键从而改善DNADNA纯度。纯度。由于生物酶解比较温和由于生物酶解比较温和,故其常常还需要跟化学、物理等故其常常还需要跟化学、物理等裂解方法联合使用。裂解方法联合使用。目前除了使用溶菌酶外目前除了使用溶菌酶外,也有添加旨在提高革兰氏阳性菌也有添加旨在提高革兰氏阳性菌裂解得消色肽酶裂解得消色肽酶(achromopeptidase)(achromopeptidase)、消化蛋白得蛋白酶、消化蛋白得蛋白酶K(proteinase K)(K(proteinase K)(主要通过酶解膜蛋白来提高裂解细胞以主要通过酶解膜蛋白来提高裂解细胞以及消化蛋白而有利于随后得核酸分离纯化及消化蛋白而有利于随后得核酸分离纯化)以及在富含有以及在富含有机酸得样品中有利于核酸释放得链霉蛋白酶机酸得样品中有利于核酸释放得链霉蛋白酶(pronase)(pronase)等。等。n一般来说一般来说,单独使用一种处理方法效果都不会单独使用一种处理方法效果都不会很好很好,而适当得组合可产生很好得效果。而适当得组合可产生很好得效果。二、除去与核酸结合得蛋白质等杂质二、除去与核酸结合得蛋白质等杂质n苯酚对蛋白质有极强得变性作用苯酚对蛋白质有极强得变性作用,而对而对DNA无影响无影响;n氯仿也可使蛋白质变性氯仿也可使蛋白质变性,对对DNA无影响无影响;n蛋白酶可降解蛋白质蛋白酶可降解蛋白质,故在实验中也常使用。故在实验中也常使用。注注:苯酚得残留会严重干扰后续得分子操作苯酚得残留会严重干扰后续得分子操作,故用苯酚去除蛋白质后还故用苯酚去除蛋白质后还需用氯仿需用氯仿/异戊醇异戊醇(24:1)抽提两次抽提两次,以去除残留得蛋白质和苯酚。以去除残留得蛋白质和苯酚。三、除去其她杂质核酸三、除去其她杂质核酸 在在DNADNA提取中会有少量得提取中会有少量得RNARNA杂质残留杂质残留,但但RNARNA极易降解极易降解,一般情况下对后续得一般情况下对后续得DNADNA操作无操作无大影响。如要求大影响。如要求DNADNA纯度较高时可加入纯度较高时可加入RNARNA酶酶(RNase)(RNase)以降解以降解RNARNA。四、获得四、获得DNA样品样品含含DNA得水相可用以下几种沉淀剂沉淀得水相可用以下几种沉淀剂沉淀:a、无水乙醇无水乙醇(最常用最常用):易于从易于从DNA沉淀中除去。但所需得沉淀中除去。但所需得体积大体积大(2倍倍),由于使用得管多为由于使用得管多为 一次性一次性,比较浪费。比较浪费。b、异丙醇异丙醇:能与自由水紧密结合。结合了溶解能与自由水紧密结合。结合了溶解DNA得水分得水分子子,使使 DNA沉淀。可常温沉淀沉淀。可常温沉淀,离心离心,加入体积为加入体积为0、61倍体积倍体积,但不易除去但不易除去,需用需用70%酒精洗涤几次酒精洗涤几次,否则对后续否则对后续分子操作有影响。异戊醇分子操作有影响。异戊醇:几乎不能与自由水结合几乎不能与自由水结合,但可分但可分离有机醇与溶液层离有机醇与溶液层,还可去气泡还可去气泡,也可做去蛋白得辅助剂。也可做去蛋白得辅助剂。c、PEG(聚乙二醇聚乙二醇,分子量分子量60008000)选择性沉淀选择性沉淀:低浓度低浓度PEG(如如1%)选择沉淀大分子选择沉淀大分子DNA,在构建基因组文库则用在构建基因组文库则用低浓度低浓度PEG沉淀几十沉淀几十kb;高浓度高浓度PEG(20%),选择沉淀小分选择沉淀小分子子,几百几百bp。如。如:PBR322 4、3kb 用用PEG 12%沉淀。沉淀。PEG选择沉淀得分辨率达选择沉淀得分辨率达100bp。沉淀时得注意事项沉淀时得注意事项:(1)(1)当当DNADNA分子量分子量1kb1kb或浓度较低或浓度较低,1g/ml,1kb,(2)DNA1kb,加入沉淀剂后再加入糖原加入沉淀剂后再加入糖原,几分钟可几分钟可完全完全;(3)DNA200bp,(3)DNA1 mmol/L or EDTA10 mmol/L,1 mmol/L or EDTA10 mmol/L,则用则用乙醇沉淀得不到乙醇沉淀得不到 DNA,DNA,应选其她方法沉淀应选其她方法沉淀DNADNA。DNA样品得贮存样品得贮存:n44短期贮存短期贮存;n-20-20长期贮存长期贮存,冰上缓解冻冰上缓解冻(取时取时););n也可将也可将DNADNA样品以乙醇沉淀得形式保存在样品以乙醇沉淀得形式保存在-20-20。Figure3、4Preparationofacellextract、PreparationofacellextractPreparationofacellextractFigure3、5Removalofproteincontaminantsbyphenolextraction、PurificationofDNAfromacellextractPurificationofDNAfromacellextractFigure3、6CollectingDNAbyethanolprecipitation、ConcentrationofDNAsamples%两种经典得化学试剂提取法两种经典得化学试剂提取法:1 1、CTABCTAB法法 2 2、SDSSDS法法 CTAB CTAB法法(1)(1)原理原理:nCTAB,CTAB,十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵就是一种去污剂就是一种去污剂,可溶解可溶解细胞膜细胞膜,她能与核酸形成复合物她能与核酸形成复合物,在高盐溶液中在高盐溶液中(0(0、7 7 mol/L NaCl)mol/L NaCl)就是可溶得就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定程当降低溶液盐浓度到一定程度度(0(0、3 mol/L NaCl)3 mol/L NaCl)时时,从溶液中沉淀从溶液中沉淀,通过离心就通过离心就可将可将CTABCTAB与核酸得复合物同蛋白质、多糖类物质分开与核酸得复合物同蛋白质、多糖类物质分开,然后将然后将CTABCTAB与核酸得复合物沉淀溶解于高盐溶液与核酸得复合物沉淀溶解于高盐溶液,再再加入乙醇使核酸沉淀加入乙醇使核酸沉淀,CTAB,CTAB能溶解于乙醇。能溶解于乙醇。(2)具体操作具体操作:在所需量得在所需量得CTABCTAB抽提液中加入抽提液中加入巯基乙醇巯基乙醇,使终浓度达使终浓度达2 2(v/v)(v/v)。将此溶液预热至。将此溶液预热至6565。对于每克新鲜得叶组织大。对于每克新鲜得叶组织大约需要约需要4ml4ml得得ME/CTABME/CTAB抽提液。抽提液。用液氮用液氮(196)196)或干冰或干冰(78)78)冷却粉碎器冷却粉碎器/匀浆器匀浆器,将将0 0、5 g5 g植物组织粉碎成细粉植物组织粉碎成细粉,然后将组织转移到然后将组织转移到2 2、0 ml0 ml离心管。离心管。加入加入800 l800 l预热得预热得Me/CTAB,Me/CTAB,混合使之充分湿润混合使之充分湿润,于于6565温育温育20min,20min,不时颠倒混匀。不时颠倒混匀。待冷至室温后待冷至室温后,加入加入800 l800 l氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(24:1),(24:1),颠倒混匀至颠倒混匀至溶液呈乳浊状溶液呈乳浊状(但不要振荡但不要振荡)。25,10000 rpm25,10000 rpm离心离心10 min10 min。上清上清(约约700 l)700 l)转移至另一干净得离心管中转移至另一干净得离心管中,加入加入5 5 l RNaseAl RNaseA贮液贮液,37,37温育温育30 min30 min。加入加入700 l700 l氯仿氯仿/异戊醇异戊醇,颠倒混匀颠倒混匀,25,10000 rpm,25,10000 rpm离心离心10 min10 min。上清上清(约约600 l)600 l)转移至另一干净得转移至另一干净得1 1、5 ml5 ml离心管中离心管中,加入加入600 l600 l异丙醇异丙醇,颠倒混匀颠倒混匀,室温或室温或-20-20放置放置20 20 minmin。25,12000 rpm,25,12000 rpm,离心离心10 min,10 min,收集沉淀。收集沉淀。去上清去上清,加加1ml70%1ml70%乙醇洗涤沉淀两次乙醇洗涤沉淀两次(25,12000(25,12000 rpm,rpm,离心离心10 min)10 min)晾干晾干DNA,DNA,溶于溶于50 l ddH50 l ddH2 2O,4O,4保存备用。保存备用。(3)(3)优缺点优缺点:能很好地去除糖类物质能很好地去除糖类物质;在提取得前期能同时得到高含量得在提取得前期能同时得到高含量得DNA及及RNA;步骤多步骤多,复杂复杂,提取得提取得DNA分子量比分子量比SDS法小。法小。(4)(4)说明说明:巯基乙醇得作用巯基乙醇得作用:a、就是一种蛋白质得辅助变性剂就是一种蛋白质得辅助变性剂;b、主要作还原剂主要作还原剂,加入溶液中可防止整个溶液得氧加入溶液中可防止整个溶液得氧化化,大大提高大大提高DNA得率。由于气体得率。由于气体(多酚类物质多酚类物质)刺鼻刺鼻,通风柜操作。通风柜操作。SDSSDS法法(1)原理原理:n利用高浓度得利用高浓度得SDS,SDS,在较高温度在较高温度(5565)(5565)条件下裂解条件下裂解细胞细胞,蛋白质变性蛋白质变性,释放出核酸释放出核酸,然后采用提高盐浓度及然后采用提高盐浓度及降低温度得做法使蛋白质及多糖杂质沉淀降低温度得做法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用得就最常用得就是加入是加入5M5M得得KAcKAc于冰上保温于冰上保温,在低温条件下在低温条件下KAcKAc与蛋白质与蛋白质及多糖结合成不溶物及多糖结合成不溶物),),离心除去沉淀后离心除去沉淀后,上清液中得上清液中得DNADNA用酚用酚/氯仿抽提氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中得反复抽提后用乙醇沉淀水相中得DNADNA。(2)过程过程:将将0 0、3 g3 g植物材料于液氮速冻植物材料于液氮速冻,然后在研钵中将其磨碎然后在研钵中将其磨碎,将粉末转至将粉末转至2 ml2 ml离心管中。离心管中。加入加入1 1、2 ml2 ml预热至预热至6565得提取缓冲液得提取缓冲液(其中加入其中加入3 l 3 l 巯基乙醇巯基乙醇,增加增加DNADNA得稳定性得稳定性),),置置6565水浴中放置水浴中放置3030分钟分钟,不时颠倒混匀。不时颠倒混匀。加入加入0 0、45 ml 5M45 ml 5M得醋酸钾得醋酸钾,混匀混匀,冰浴冰浴2020分钟分钟,在在10000 10000 rpmrpm离心离心20 min20 min。需要得话需要得话,用纱布过滤除去沉淀用纱布过滤除去沉淀,上清液转入另一离心上清液转入另一离心管中。管中。加入等体积氯仿加入等体积氯仿:异戊醇异戊醇(24:1),(24:1),轻轻颠倒混匀轻轻颠倒混匀,12000,12000 rpmrpm离心离心15 min15 min。转移上清液到另一新离心管中转移上清液到另一新离心管中,加加5l RNaseA5l RNaseA贮液贮液,37,37温育温育30 min30 min。加入等体积氯仿加入等体积氯仿:异戊醇异戊醇(24:1),(24:1),轻轻颠倒混匀轻轻颠倒混匀,12000 rpm,12000 rpm离心离心15 min15 min。转移上清液到另一新离心管中转移上清液到另一新离心管中,加入加入0 0、7V7V异丙醇异丙醇,轻轻轻颠倒混匀轻颠倒混匀,-20,-20放置放置3030分钟沉淀核酸。分钟沉淀核酸。25,12000 rpm,25,12000 rpm,离心离心10 min,10 min,收集沉淀。收集沉淀。弃上清弃上清,70,70乙醇洗两次。凉干乙醇洗两次。凉干DNA,DNA,溶于溶于50 l 50 l ddH2O,4ddH2O,4保存备用。保存备用。(3)(3)与与CTABCTAB法比较法比较:nSDSSDS法较温和法较温和,对对DNADNA得切割不大得切割不大,可获得大分子量得可获得大分子量得DNADNA。故该法可建立基因组文库。故该法可建立基因组文库,多酚类物质得材料适多酚类物质得材料适用。用。n该法极易造成该法极易造成SDS-DNASDS-DNA共沉淀。共沉淀。n对对SDSSDS质量要求较高。质量要求较高。n称取称取SDSSDS时时,动作要缓慢动作要缓慢,因因SDSSDS易于形成微颗粒。溶解易于形成微颗粒。溶解时时,水应沿壁使水轻缓流下水应沿壁使水轻缓流下,56,56助溶。助溶。例1:水稻基因组DNA提取n取取3-5g新鲜水稻叶片新鲜水稻叶片,用液氮速冻用液氮速冻,在研钵中快速研成粉末状在研钵中快速研成粉末状,转入转入50ml离心管中离心管中;n立即加入立即加入20ml预热至预热至65得提取缓冲液得提取缓冲液,65水浴水浴30min;n加入加入7、5ml5M醋酸钾醋酸钾,轻轻混匀轻轻混匀,冰上放置冰上放置20min,4000rpm离心离心20min。将上清转入另一干净得。将上清转入另一干净得50ml离心管中离心管中;n加入加入15ml氯仿氯仿:异戊醇异戊醇(24:1),轻轻颠倒混匀轻轻颠倒混匀,4000rpm离心离心20min。将上清转入另一个干净得将上清转入另一个干净得50ml离心管中离心管中;n加入加入15ml冰预冷得异丙醇冰预冷得异丙醇,轻轻颠倒混匀轻轻颠倒混匀,-20放置放置30min;n4000rpm离心离心20min,弃上清弃上清,用用20ml70%得乙醇洗一遍得乙醇洗一遍,倒置离心倒置离心管于干净得滤纸管于干净得滤纸,室温晾干沉淀室温晾干沉淀;n将沉淀重悬于将沉淀重悬于0、6mlTE缓冲液缓冲液,加加10l10mg/mlRNA酶酶,37保保温温10min;n转入干净得转入干净得2ml离心管中离心管中,加入等体积得酚加入等体积得酚:氯仿氯仿:异戊醇异戊醇(25:24:1),12000rpm离心离心10min;n将上清转入一干净得将上清转入一干净得2ml离心管中离心管中,加入加入1/10体积冰预冷得体积冰预冷得3M醋酸钠醋酸钠(pH5、2),2倍体积冰预冷得无水乙醇倍体积冰预冷得无水乙醇,12000rpm离心离心30min。弃上。弃上清清,用用70%得乙醇洗一遍得乙醇洗一遍,晾干后晾干后,容于容于500lTE,保存于保存于-20备用。备用。例2:细菌DNA大量提取n吸取吸取1ml过夜培养得细菌于过夜培养得细菌于50ml不加抗生素得不加抗生素得PSA中中,28,200rpm过夜培养过夜培养;n6000rpm离心离心5分钟分钟,收集菌体收集菌体;n用用50ml冰冷得冰冷得1TE冲洗菌体两次冲洗菌体两次;n将菌体重新打散将菌体重新打散,悬于悬于20ml1TE中中;n加入加入(37预消化预消化1小时小时)得蛋白酶、得蛋白酶、SDS使其终浓度分别为使其终浓度分别为625 g/ml(w/v)及及1、25(w/v),冰浴冰浴45分钟至有白色分钟至有白色SDS析出析出;n室温放置室温放置30分钟分钟,不时轻轻摇动不时轻轻摇动;n3%NaCl饱和得苯酚、苯酚饱和得苯酚、苯酚/氯仿氯仿(1:1,v/v)及氯仿各抽提一次及氯仿各抽提一次,收集上清于新得离心管收集上清于新得离心管;n加入加入1/10体积得体积得3MNaAc(pH4、8),再加等体积冰冷得异丙醇再加等体积冰冷得异丙醇,混匀后置室温混匀后置室温30min,待出现无色透明得白色絮状待出现无色透明得白色絮状DNA,用用Tip头吸出头吸出,室温干燥后溶于室温干燥后溶于1xTE中中;nDNA保存于保存于-20oC,可长期保存。可长期保存。例例4:4:人类人类DNADNA提取提取n親手提取自己得親手提取自己得DNAn作為作為“紀念紀念DNA雙螺旋結構發現五十周年系列展覽雙螺旋結構發現五十周年系列展覽”得得一部分一部分,現場萃取現場萃取DNA制成挂件模型實驗制成挂件模型實驗,昨天在北京王府井昨天在北京王府井新東安廣場舉行。新東安廣場舉行。十幾名學生在英國老師斯蒂娜得指導下親手萃取了自己十幾名學生在英國老師斯蒂娜得指導下親手萃取了自己得絮狀得絮狀DNA,並制作成可愛得挂件並制作成可愛得挂件,挂在脖子上。據悉挂在脖子上。據悉,這次開這次開放式實驗活動將持續到放式實驗活動將持續到3日。日。圖為北京外國語大學學生小周看見自己得圖為北京外國語大學學生小周看見自己得DNA奇跡般地奇跡般地出現在試液中出現在試液中,驚奇不已。驚奇不已。本報記者吳平本報記者吳平張紅晉攝影報道張紅晉攝影報道京華時報京華時報(2003年年10月月2日第日第2版版)1、2质粒质粒DNA得提取得提取1 1、碱裂解法、碱裂解法碱裂解法由碱裂解法由BirnboimBirnboim和和DolyDoly设计并于设计并于19791979年发表年发表,基于染色基于染色体体DNADNA与质粒与质粒DNADNA变性与复性得差异而达到分离目得。变性与复性得差异而达到分离目得。在在pHpH高达高达1212、5 5得碱性条件下得碱性条件下,染色体染色体DNADNA得氢键断裂得氢键断裂,双螺双螺旋结构解开而变性旋结构解开而变性,质粒质粒DNADNA得大部分氢键也断裂得大部分氢键也断裂,但超螺但超螺旋共价闭合环状得两条互补链不会完全分离。旋共价闭合环状得两条互补链不会完全分离。当以当以pH4pH4、6 6得得KAcKAc高盐缓冲液调节其高盐缓冲液调节其pHpH至中性时至中性时,变性变性得质粒得质粒DNADNA又恢复原来得构型又恢复原来得构型,保存在溶液中保存在溶液中,而染色体而染色体DNADNA不能复性而形成缠连得网状结构。不能复性而形成缠连得网状结构。通过离心通过离心,染色体染色体DNADNA与不稳定得大分子与不稳定得大分子RNARNA、蛋白质、蛋白质-SDSSDS复合物等一起沉淀下来而被除去。复合物等一起沉淀下来而被除去。基本原理基本原理:Figure3、11 Plasmid purification by the alkaline denaturation method、三种溶液三种溶液:溶液溶液I:50mM葡萄糖葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA:pH8、0;溶液溶液II,0、2NNaOH/1%SDS;溶液溶液III:3M醋酸钾醋酸钾/2M醋酸醋酸 提取步骤提取步骤:pET28c(+)电泳结果电泳结果 碱抽提法所用试剂得生化作用碱抽提法所用试剂得生化作用 n提取过程中所用得材料有提取过程中所用得材料有:LB:LB培养基、葡萄糖培养基、葡萄糖/Tris/EDTA/Tris/EDTA溶液溶液(5Ommol/L(5Ommol/L葡萄糖葡萄糖;25mmol/L;25mmol/L TrisHCl;pH8TrisHCl;pH8、0,lOmmol/L EDTA)0,lOmmol/L EDTA)、TETE缓冲液、缓冲液、3mol/L3mol/L乙酸钾溶液、乙酸钾溶液、NaOH-SDSNaOH-SDS溶液、溶菌酶液、溶液、溶菌酶液、异丙醇、异丙醇、100%100%乙醇和乙醇和70%70%乙醇等。乙醇等。溶菌酶溶菌酶:溶菌酶就是糖苷水解酶溶菌酶就是糖苷水解酶,水解菌体水解菌体细胞壁得主要化学成分肽聚糖中得细胞壁得主要化学成分肽聚糖中得-1,4-1,4糖糖苷键苷键,因而具有溶菌作用。因而具有溶菌作用。葡萄糖葡萄糖:葡萄糖增加溶液粘度葡萄糖增加溶液粘度,维持渗透压维持渗透压,防止防止DNADNA受机械剪切力作用而降解。受机械剪切力作用而降解。EDTA:EDTA EDTA:EDTA螯合螯合MgMg2+2+和和CaCa2+2+等金属离子等金属离子,抑制抑制脱氧核糖核酸酶对脱氧核糖核酸酶对DNADNA得降解作用得降解作用,同时有利同时有利于溶菌酶得作用。于溶菌酶得作用。NaOH-SDSNaOH-SDS液液:NaOH:NaOH浓度为浓度为0 0、2 mol/L,2 mol/L,加抽加抽提液时提液时,该系统得该系统得pHpH就高达就高达1212、6,6,因而促使因而促使染色体染色体DNADNA与质粒与质粒DNADNA得变性。得变性。nSDSSDS就是离子型表面活性剂就是离子型表面活性剂,她可以溶解细胞她可以溶解细胞膜上得脂质与蛋白膜上得脂质与蛋白,因溶解膜蛋白而破坏细因溶解膜蛋白而破坏细胞膜、解聚细胞中得核蛋白胞膜、解聚细胞中得核蛋白,还能与蛋白质还能与蛋白质结合成为结合成为R-O-S0R-O-S03 3-RR+一蛋白质得复合物一蛋白质得复合物,使使蛋白质变性沉淀下来。蛋白质变性沉淀下来。KAc:pH4KAc:pH4、8 8得得KAcKAc溶液就是为了把溶液就是为了把pHl2pHl2、6 6得抽提液调节至中性得抽提液调节至中性,使变性得质粒使变性得质粒DNADNA能够能够复性复性,并能稳定存在。并能稳定存在。n高盐高盐:3mol/L KAc:3mol/L KAc有利于变性得大分子染色有利于变性得大分子染色体体DNADNA、RNARNA以及以及SDS-SDS-蛋白复合物得凝聚而沉蛋白复合物得凝聚而沉淀。染色体淀。染色体DNADNA因为中和了核酸上得电荷因为中和了核酸上得电荷,减减少相斥力而互相聚合少相斥力而互相聚合,钾盐与钾盐与RNARNA、SDS-SDS-蛋白蛋白复合物作用后复合物作用后,形成钾盐形式复合物形成钾盐形式复合物,使沉淀使沉淀更完全。更完全。无水乙醇无水乙醇:沉淀沉淀DNA,DNA,她得优点就是可以任意比例和水相混她得优点就是可以任意比例和水相混溶溶,且乙醇与核酸不会起任何化学反应且乙醇与核酸不会起任何化学反应,对对DNADNA很安全。很安全。DNADNA溶液就是溶液就是DNADNA以水合状态稳定存在以水合状态稳定存在,当加入乙醇时当加入乙醇时,乙乙醇会夺去醇会夺去DNADNA周围得水分子周围得水分子,使使DNADNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。酚酚-氯仿氯仿:酚与氯仿就是非极性分子酚与氯仿就是非极性分子,水就是极性分子水就是极性分子,当当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时蛋白水溶液与酚或氯仿混合时,蛋白质分子之间得水分子蛋白质分子之间得水分子就被酚或氯仿挤去就被酚或氯仿挤去,使蛋白质失去水合状态而变性。经过使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心离心,变性蛋白质得密度比水得密度大变性蛋白质得密度比水得密度大,因而与水相分离因而与水相分离,沉淀在水相下面沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中得从而与溶解在水相中得DNADNA分开。而酚分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大与氯仿有机溶剂比重更大,保留在最下层。保留在最下层。异戊醇异戊醇:异戊醇能降低分子表面张力异戊醇能降低分子表面张力,能减少抽提过程中泡能减少抽提过程中泡沫得产生。同时异戊醇有助于分相沫得产生。同时异戊醇有助于分相,使离心后得上层水相、使离心后得上层水相、中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。2、通过试剂盒分离纯化质粒、通过试剂盒分离纯化质粒DNA 分离纯化过程就是通过一个简单得结合洗涤洗脱程序来完成得。优点:该方法操作简单,回收效率高,洗脱出来后得DNA可立即使用,无需浓缩、沉淀或脱盐。1、3琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离纯化得分离纯化得DNADNA就是否真得存在、就是否有降就是否真得存在、就是否有降解现象解现象,以及以及DNADNA经限制性内切酶酶切后其产物经限制性内切酶酶切后其产物得大小如何等都就是在基因操作中时刻面对得得大小如何等都就是在基因操作中时刻面对得问题。问题。目前最成熟得检测目前最成熟得检测DNADNA得技术就就是琼脂糖凝得技术就就是琼脂糖凝胶电泳。胶电泳。一、琼脂糖得特点及凝胶电泳得原理一、琼脂糖得特点及凝胶电泳得原理 琼脂糖就是从海藻中提取出得一种线性多琼脂糖就是从海藻中提取出得一种线性多糖聚合物。在高温水溶液中会溶解糖聚合物。在高温水溶液中会溶解,在常温下在常温下凝固并形成一定大小孔径得惰性介质。在电场凝固并形成一定大小孔径得惰性介质。在电场得作用下得作用下,DNA,DNA可在孔洞中迁移。可在孔洞中迁移。琼脂糖凝胶电泳就是以琼脂糖为支持物琼脂糖凝胶电泳就是以琼脂糖为支持物,在适在适当条件下对带电生物大分子进行电泳得技术。当条件下对带电生物大分子进行电泳得技术。主要用于主要用于DNADNA分子得分离、纯化和鉴定。分子得分离、纯化和鉴定。琼脂糖凝胶电泳得原理琼脂糖凝胶电泳得原理:DNA:DNA分子在溶液中带负分子在溶液中带负电荷电荷,在电场中向正极移动在电场中向正极移动,由于由于DNADNA分子得分分子得分子质量差别子质量差别,电泳后不同大小得电泳后不同大小得DNADNA分子呈现迁分子呈现迁移位置得差异移位置得差异,把已知分子质量得标准把已知分子质量得标准DNADNA与待与待测测DNADNA同时电泳同时电泳,比较两者在凝胶板上所呈现得比较两者在凝胶板上所呈现得区带区带,就可以鉴定出待测就可以鉴定出待测DNADNA得大小。得大小。二、琼脂糖凝胶电泳基本操作步骤二、琼脂糖凝胶电泳基本操作步骤 在琼脂糖中加入电泳缓冲液在琼脂糖中加入电泳缓冲液微波加热溶解微波加热溶解温温度降至度降至6060左右时左右时,加入电泳染料加入电泳染料混匀后倒入凝胶混匀后倒入凝胶槽槽待凝胶完全凝结后待凝胶完全凝结后,小心拔去梳子小心拔去梳子放入电泳槽放入电泳槽中中,倒入电泳缓冲液倒入电泳缓冲液,缓冲液高过凝胶面缓冲液高过凝胶面0 0、5cm 5cm 点点样样根据需要设置电泳电压和时间根据需要设置电泳电压和时间,开始电泳开始电泳电泳电泳结束后在凝胶成像仪上观察、照相结束后在凝胶成像仪上观察、照相进一步分析。进一步分析。琼脂糖凝胶电泳得操作过程琼脂糖凝胶电泳得操作过程染色体染色体DNADNA琼脂糖电泳图谱琼脂糖电泳图谱紫外线光源灵敏度紫外线光源灵敏度紫外线光源灵敏度紫外线光源灵敏度:302nm254nm366nm302nm254nm366nm电泳结果分析电泳结果分析:0 0、8%8%得琼脂糖凝胶得琼脂糖凝胶,应呈现一条清晰带。应呈现一条清晰带。n若呈长带状弥散荧光则表明若呈长带状弥散荧光则表明DNADNA降解降解,原因可能有原因可能有:就是否灭菌器皿及试剂就是否灭菌器皿及试剂;材料收集就是否立即冷冻材料收集就是否立即冷冻,研磨研磨(后后)提取就是否融化提取就是否融化;就是否剧烈振动就是否剧烈振动,吸管口吸管口过窄过窄,产生气泡。反复吸打及冻融等问题。产生气泡。反复吸打及冻融等问题。n若在溴酚蓝处出现明亮得荧光若在溴酚蓝处出现明亮得荧光,则有则有RNA,RNA,可用可用RNaseRNase消消化。消化后用氯仿抽提化。消化后用氯仿抽提,乙醇沉淀方法纯化。乙醇沉淀方法纯化。n若在样品槽内有荧光出现若在样品槽内有荧光出现,可能样品中可能样品中DNADNA未完全溶解未完全溶解或浓度过高或浓度过高,或样品不纯或样品不纯,可能就是大量带正电荷得杂可能就是大量带正电荷得杂质与质与DNADNA样品结合。样品结合。凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA片段得大小范围片段得大小范围(bp)0、3%琼脂糖50000 10000、7%琼脂糖20000 10001、4%琼脂糖6000 3004、0%聚丙烯酰胺1000 10010、0%聚丙烯酰胺500 2520、0%聚丙烯酰胺 50 1 三、琼脂糖凝胶电泳得影响因素三、琼脂糖凝胶电泳得影响因素1 1、凝胶浓度、凝胶浓度 凝胶浓度得选择取决于凝胶浓度得选择取决于DNADNA分子得大小。具体得浓度分子得大小。具体得浓度及分离及分离DNADNA片段得大小范围如下表。片段得大小范围如下表。2 2、DNADNA分子得大小和构象分子得大小和构象n线状双链线状双链DNADNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶上电分子在一定浓度琼脂糖凝胶上电泳距离与泳距离与DNADNA得分子质量对数成反比。得分子质量对数成反比。n但当但当DNADNA分子处于不同构象时分子处于不同构象时,她在电场中移动她在电场中移动距离不仅和分子质量有关距离不仅和分子质量有关,还和她本身构象有还和她本身构象有关。有相同分子质量得线状关。有相同分子质量得线状DNADNA开环状开环状DNADNA超超螺旋螺旋DNADNA。3 3、电泳缓冲液、电泳缓冲液n目前常用得缓冲液有目前常用得缓冲液有TAE(40 mol/L Tris-TAE(40 mol/L Tris-乙酸、乙酸、1 mmol/L EDTA)1 mmol/L EDTA)和和TBE(90 mmol/L TBE(90 mmol/L 硼酸、硼酸、1 1 mmol/L EDTA)mmol/L EDTA)。nTAETAE缓冲液得缓冲能力较低缓冲液得缓冲能力较低,适用于低电压长时适用于低电压长时间电泳间电泳;TBE;TBE有较强得缓冲能力有较强得缓冲能力,就是比较通用就是比较通用得缓冲液。得缓冲液。4 4、指示剂、指示剂 电泳过程中电泳过程中,常使用一种有颜色得标记物以指示常使用一种有颜色得标记物以指示样品得迁移过程。目前常用得核酸电泳指示剂就是溴样品得迁移过程。目前常用得核酸电泳指示剂就是溴酚蓝酚蓝,呈蓝紫色。呈蓝紫色。5 5、染色、染色溴化乙锭溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)可很好地掺入到双链可很好地掺入到双链DNA中中,在在紫外光得激发下会呈现橙红色得荧光紫外光得激发下会呈现橙红色得荧光,便于鉴定便于鉴定,可用于对可用于对DNA进进行染色和观察。行染色和观察。SYBRGreenI:新型低毒新型低毒,高灵敏度染料高灵敏度染料,加入样品中加入样品中,价格较价格较EB贵。贵。强烈诱变剂强烈诱变剂1、4聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(PAGE)可很好得分辨可很好得分辨100bp-100bp-1kb1kb大小得核酸分子。对单链大小得核酸分子。对单链DNADNA来说来说,其分辨率可达其分辨率可达1bp,1bp,这种分辨能力在这种分辨能力在DNADNA序列测定中发挥了重要作用。序列测定中发挥了重要作用。特点特点:分辨率高分辨率高;载样量大载样量大;回收回收DNADNA纯度高纯度高;适于适于寡聚核苷酸及寡聚核苷酸及DNADNA序列分析序列分析,DNA500bp,DNA4000kb。DNA分子得迁移方向随所分子得迁移方向随所用电场方向得周期性变化而不断改变。可成功分离到用电场方向得周期性变化而不断改变。可成功分离到分子量高达分子量高达107bp得得DNA大分子。大分子。脉冲场凝胶电泳实际上就是一种交替变化电场方向得脉冲场凝胶电泳实际上就是一种交替变化电场方向得电泳电泳,以一定得角度并以一定得时间变换电场方向以一定得角度并以一定得时间变换电场方向,使使DNADNA分子在微观上按分子在微观上按“Z”“Z”字形向前泳动字形向前泳动,从而到达分从而到达分离大分子离大分子DNADNA得目得。得目得。与常规得直流单向电场凝胶电泳不同与常规得直流单向电场凝胶电泳不同,这项技术采用这项技术采用定时改变电场方向得交变电源定时改变电场方向得交变电源,每次电流方向改变后每次电流方