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壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究 暨南大学本科生毕业论文
毕业论文
壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究
摘 要
硒代胱氨酸(SeC)是一种天然的含硒氨基酸，研究证明，SeC作为一种新型高效的抗肿瘤药物在肿瘤化学预防与治疗中发挥着重要的作用。然而，SeC进入肿瘤细胞与其作用需要较长一段时间，细胞渗透性较差。高分子载药纳米粒子是近年来发展起来的新剂型，药物经其包裹后，不仅可以提高药物稳定性，而且还可以大大提高药物的生物利用率。壳聚糖(CS)是一种优良的天然药物载体，具有良好的生物相容性，生物可降解性和无毒性,被广泛地用作医药载体。本文以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，液体石蜡为乳化体系，制备出粒径小，分散性好，载药率及包封率较高的SeC壳聚糖纳米粒子。最后通过细胞毒性实验，表明以壳聚糖纳米粒子为药物载体能够增强SeC对MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用，并增强其体外抗肿瘤活性。

关键词：壳聚糖纳米粒子；乳化交联法；硒代胱氨酸；体外抗肿瘤活性
Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystine-loaded chitosan nanoparticles
Abstract
Selenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel compound with broad-spectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as anticancer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biocompatible, biodegradable and nontoxic properties.
In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using glutaraldehyde as crossing agent, span80 as emulsifier and paraffin as oil phase. Lastly, it’s proved that chitosan nanoparticles loaded SeC had greater toxicity and antitumor activity to MCF-7.

Key words: Chitosan nanoparticles; cross-linking emulsification; Selenocystine; in vitro anticancer activity

目 录
摘 要 I
Abstract II
第一章 绪论 3
1.1 硒抗癌药物的研究进展 3
1.2 硒代胱氨酸的研究现状 3
1.2.1 硒代胱氨酸的性质 3
1.2.2 硒代胱氨酸的抗癌作用 3
1.3 纳米药物载体在肿瘤治疗中的应用 3
1.3.1 纳米技术的研究进展 3
1.3.2 纳米药物载体的研究进展 3
1.4 壳聚糖纳米粒子在纳米药物载体领域的制备和应用 3
1.4.1 壳聚糖的结构与性质 3
1.4.2 壳聚糖纳米粒子的制备 3
1.4.4 壳聚糖纳米粒子的应用 3
1.5 课题的研究意义与创新点 3
1.5.1 课题的研究意义 3
1.5.2 创新点 3
第二章 空白壳聚糖纳米粒子的制备 3
2.1 实验部分 3
2.1.1 材料与试剂 3
2.1.2 实验仪器 3
2.1.3 实验方法 3
2.2 实验结果与讨论 3
2.4.1 油相体系对壳聚糖纳米粒子的影响 3
2.4.2 油水比对壳聚糖纳米粒子的影响 3
2.4.3 表面活性剂用量对壳聚糖纳米粒子的影响 3
2.4.4 壳聚糖浓度对壳聚糖纳米粒子的影响 3
2.4.5 交联剂用量对壳聚糖纳米粒子的影响 3
2.5 本章小结 3
第三章 壳聚糖纳米粒子负载硒代胱氨酸的制备 3
3.1 实验部分 3
3.1.1 实验材料 3
3.1.2 实验仪器 3
3.1.3 实验方法 3
3.2 实验结果与讨论 3
3.2.1 粒径分布及其稳定性的分析 3
3.2.2 TEM分析 3
3.2.2 包封率与载药率的计算 3
3.3 本章小结 3
第四章 细胞毒性的研究 3
4.1 实验部分 3
4.1.1 实验试剂 3
4.1.2 实验仪器 3
4.1.3 实验原理 3
4.1.4 实验步骤 3
4.2 结果与讨论 3
4.2.1 粒径分布 3
4.2.2 TEM分析与EDX分析 3
4.2.3 载药率与包封率 3
4.2.4 细胞存活率 3
4.3 本章小结 3
第五章 总结与展望 3
5.1 总结 3
5.2 展望 3
致 谢 3
参考文献 3

IV
壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究
第一章 绪论
1.1 硒化学的研究进展
硒是机体生命活动不可缺少的一种微量元素，被称为“生命奇效元素”[1]。1817年，硒由瑞典学者Berzelius发现，并命名为Selenium。但由于毒性，硒曾被认为是一种对高级生物有害的元素。1957年美国营养学家Schwarz和Foltz首次用硒治疗动物肝坏死取得成功后，硒逐渐明确为动物体内必需的微量元素[2] 。1973年，Rotruck等人发现硒是谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的活性成分后[3]，已经陆续有25种含硒蛋白被发现。1975年Awasthi等人首次明确指出，硒是人体必需的微量元素[4]。此后，硒与硒化合物的生理作用受到普遍关注。1988年，我国已经把硒列为膳食营养素之一。近年来研究发现，硒与人类40种疾病有关，如大骨节病、克山病、白内障、癌症等。硒可以保护心脏、肝脏等免受损伤，对癌症、心血管疾病、艾滋病等起到治疗和控制作用[5-7]。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金属，抗逆境等多种生物学活性[8] 。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在，GSH-Px能减轻或阻断自由基所致的脂质过氧化连锁反应，保护蛋白质、清除自由基和DNA及生物膜的完整性，修复损伤分子部位；同时能提高机体免疫能力，抵抗疾病[9]。近年来，硒与硒化合物的抗肿瘤活性受到普遍关注，人们一直致力于设计和改造含硒化合物，以寻找抗肿瘤活性强，抗肿瘤谱广，毒副作用低，适用于临床的含硒抗肿瘤药物[1]。根据硒在自然界的存在形态，硒化合物可分为无机硒和有机硒化合物[10]。无机硒主要包括硒，硒酸盐(亚硒酸钠,亚硒酸锌等)，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氢，硒化钠，硒化钾等）等。有机硒主要包括硒多糖，含硒蛋白质，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有机硒化合物。硒在生物体内主要以有机硒化合物的形式存在，一类是含硒氨基酸，另一类是含硒蛋白质。无机硒具有较好的抗癌活性，但无机硒化合物脂溶性差，不易进入细胞，且具有蓄积毒性和致突变作用，限制了它在临床上的应用。而相比之下，有机硒化合物吸收率高，生物活性强，毒性低和环境污染小，不仅能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上也比无机硒显著，抗癌作用更强[11]。其中含硒氨基酸---硒代半胱氨酸（selenocysteine）是生物合成和掺入到蛋白质分子中的第21种氨基酸[12]。从此有机硒化合物的研究引起了广泛关注，Shahd等人在2005年报道了有机硒化合物Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治疗子宫内膜癌和乳腺癌[13]。

1.2 硒代胱氨酸的研究现状
1.2.1 硒代胱氨酸的性质
硒代氨基酸在有机硒化合物中，有特殊的重要性。在哺乳动物组中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸(SeCys) 和硒代蛋氨酸(SeMet)。硒代胱氨酸是胱氨酸分子中S被Se所取代后的含硒氨基酸[14]。结构式如图1.1。

图1.1 硒代胱氨酸的结构式
1.2.2 硒代胱氨酸的抗癌作用
SeC，是一种天然存在的含硒氨基酸，在化学预防与治疗方面具有巨大的潜力。Chen等[15]通过实验比较几种含硒化合物对八种人类癌症细胞的抗癌活性，实验证明，SeC与亚硒酸盐对A375，MCF-7，HepG2，SW620等癌细胞的细胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸盐等强。且SeC对人类正常纤维原细胞Hs68的细胞毒性很小，IC50>400 μΜ，毒性远小于亚硒酸盐。因此，SeC具有更广谱高效的抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒性较小。因此，SeC是一种新型高效的抗肿瘤药物。
虽然SeC作为抗肿瘤药物具有较强的抗肿瘤活性，但是从Chen等[16]实验结果表明，SeC的水溶性与稳定性较差，进入MCF-7细胞发挥作用的时间比较长，36 h之后才观察到明显的细胞凋亡的现象，且72 h后的IC50=16.2±5.2 μΜ，说明SeC不易进入肿瘤细胞，对细胞的渗透性不强。因此，希望借助纳米药物载体来提高细胞吸收，减少它进入肿瘤细胞的时间。
1.3 纳米药物载体在肿瘤治疗中的应用
1.3.1 纳米技术的研究进展
早在1959年，著名物理诺贝尔奖获得者Feynman就预言了纳米科技的出现及前景。1990年7月，在美国巴尔的摩召开了第一界国际纳米科技会议，标志着纳米科技的正式诞生。纳米，是尺寸度量单位，1纳米=10-9 米，相当于4个原子并列的直径。所谓纳米技术则是指0.1-100 nm内的物质或结构的构造技术，即纳米级材料的设计，制造，测量和控制技术[17]。纳米材料具有小尺寸效应、量子尺寸效应，表面效应和宏观量子隧道效应四大效应。当物体达到纳米级后，纳米粒子在热学、光学、磁学力学及电化学方面表现出独特的优势[18]。进入21世纪，纳米技术迅速发展，作为一个多学科交叉领域，涉及面广应用十分广泛。纳米技术与材料已经在航天，汽车，消费日用品，生物医学领域获得应用，并取得一些列举世瞩目的成果[19]。随着纳米技术向医学界不断渗透，纳米技术在生物医药方面的应用，特别在肿瘤的诊断和治疗方面，受到了广泛的关注[17]。纳米技术在肿瘤治疗中的应用主要表现在一下几个方面：控释载药微粒，靶向载药微粒，磁导航靶向载药微粒，基因载体[20]。其中，纳米药物载体在医学领域中控释缓释的应用极为广泛，提高药物的利用率疗效和减少药物的副作用已成为医药研究领域的一项重要课题。
1.3.2 纳米药物载体的研究进展
理想的纳米粒载体应是无毒和可生物 的。一种理想的纳米药物载体应具备以下特征[21] ：
①具有较高的载药量
②具有较高的包封率
③制备和纯化方法简便，容易放大到工业化生产
④载体材料可生物降解，毒性较低或没有毒性
⑤具有适当的粒径与粒型
⑥具有较长的体内循环时间
纳米药物载体的种类有以下几种（如图1.2所示）：①纳米聚合物药物载体 ，包括：聚合物纳米粒（纳米囊和纳米球）纳米树突状聚合物和聚合物胶束②纳米脂质体药物载体，③纳米病毒药物载体，④碳纳米管[22]。虽然，纳米药物载体作为载药系统有诸多优点，但仍存在一些问题，如生物相容性以及细胞毒性等。因此，寻找生物相容性好，低毒性的纳米药物载体成为了近年来研究的目标。

图1.2 纳米药物载体的类型
目前，用于纳米药物载体研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。合成聚合物主要有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（PLGA）、聚已内酯（PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐等。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他亲水性生物可降解聚合物[23]。但是，通过化学方法合成得到的大部分药物载体在生物相容性，可降解性以及细胞毒性等方面还存在不尽如意的地方[24]。近年来，生物大分子材料由于其可再生性，无毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等优点成为药物载体研究的热点，于是利用生物大分子材料来制备纳米药物载体的研究应运而生。用于纳米药物载体的生物大分子主要包含蛋白质和多糖两大类。蛋白质一般包括如明胶，白蛋白，丝蛋白等物质，多糖类一般包括如壳聚糖，海藻酸钠，环糊精，果胶等物质。由于生物大分子可以从自然界的动植物中获得，生物相容性良好，并且可被生物体内的酶降解，毒副作用较小，且分子上带有的羟基，氨基，羧基等大量可反应的官能团，可作为化学修饰的位点，因此它们作为药物载体材料具有广阔的应用前景[25]。
1.4 壳聚糖纳米粒子在纳米药物载体领域的制备和应用
1.4.1 壳聚糖的结构与性质
壳聚糖也称为甲壳胺或几丁聚糖壳聚糖，是一种天然的生物高分子线性多氨基多糖，为甲壳素的脱乙酰化产物。在自然界中，壳聚糖广泛存在于低等植物菌类，藻类的细胞，节肢动物虾，蟹，蝇蛆和昆虫的外壳，贝类，软体动物（如鱿鱼，乌贼）的外壳和软骨，高等植物的细胞壁等，每年生物合成的资源量高大100亿t，是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源[26]。壳聚糖的化学名称为 (1-4)2-氨基-2脱氧-D-葡聚糖，甲壳素的化学名称为(1-4)2-乙酰胺基-2脱氧-D-葡聚糖[27]。结构式如图1.3所示。

图1.3 壳聚糖与甲壳素的结构
(A) 甲壳素 (B)壳聚糖
壳聚糖的每个C6单元均含有一个氨基，两个自由羟基。由于氨基的存在，它是自然界中唯一带正电荷的碱性多糖。它不溶于水和有机溶剂，但是能溶于PH<6.5的乙酸（1-3 %）溶液中[28]。壳聚糖不与体内组织产生异物反应，在体内被溶菌酶降解为对人体无毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖[29]。曹等[30]通过研究表明，壳聚糖无细胞毒性，不溶血，不致敏，生物相容性良好，可以满足医药卫生及化妆品原料的基本要求。
1.4.2 壳聚糖纳米粒子的制备
壳聚糖缓释体系主要分为：壳聚糖纳米粒子，壳聚糖微球，壳聚糖缓释片，壳聚糖缓释膜，壳聚糖缓释凝胶5种类型[26]。其中，壳聚糖纳米粒子载药体系比其他体系更具优势。它能保护包埋物免受外界环境影响，以及屏蔽味道，颜色或气味，降低挥发性和毒性，控制可持续释放，增加药效等。近几年壳聚糖纳米粒子的制备和应用成为研究的热点[31]。
制备壳聚糖纳米粒子的方法有多种[32]，其选择的依据受以下因素影响：①目标粒径分布；②有效成分的热化学性质与稳定性；③有效成分的释药动力学与重现性；④载药纳米粒子的稳定性与毒性溶剂残留。
(1)乳化交联法
乳化交联法是制备壳聚糖纳米粒子的常用方法之一。它是利用壳聚糖的活性氨基基团与醛类的醛基交联，得到一种Schiff碱。其反应机理如图1.4。此法是将壳聚糖溶液加入含有表面活性剂的油相中形成W/O型乳剂，再加入一定量的交联剂如戊二醛，甲醛，三聚磷酸盐，柠檬酸盐，硫酸盐和京尼平等进行化学交联固化，通过离心纯化即可制得壳聚糖纳米粒子[33]。操作流程如图1.5。沈宏亮等[34]利用乳化交联法制备了左氧氟沙星羧甲基壳聚糖纳米粒子，并对壳聚糖纳米粒子的体外释药性能进行了深入的研究。

图1.4 壳聚糖交联反应方程式

图1.5 乳化交联法操作流程
采用乳化交联法，可以通过控制含水液滴的大小来控制纳米粒子的粒径，最终产物纳米粒子的粒径也取决于在形成乳液时的油相比，交联程度等。
(2)喷雾干燥法
喷雾干燥法是以热气流干燥雾化液滴为基础的。其操作流程如图1.6。此法是将壳聚糖溶于酸性溶液中，再将药物溶解或分散于该壳聚糖溶液，加入一定量的交联剂，在惰性的热气流中喷雾干燥，当液体通过蠕动泵输送到喷嘴后，压缩空气将液体雾化为小液滴，液滴与热空气被共同吹入一个腔体中，液滴中的酸迅速蒸发，从而形成壳聚糖含药纳米粒子[33]。纳米粒子的粒径取决于喷嘴的直径，喷嘴流率，雾化压力，入口温度和交联程度等因素[32]。He等[35]将配置好的壳聚糖水溶液与一定比例的戊二醛水溶液混合均匀，然后进行喷雾干燥，制备出的壳聚糖纳米粒子粒径在3-12 μm之间。

图1.6 喷雾干燥法操作流程
(3)逐层自组装
逐层自组装法适用于制备球壁厚度可控的空心纳米粒子。纳米粒子的球壳是通过溶质逐层沉降制得的。通过限制溶质沉降次数可控制空心纳米粒子的球壳厚度，除去纳米粒子中的核物质即可获得所需的空心结构。Shao等[36]等将聚苯乙烯磺酸钠/壳聚糖聚电解质溶液吸附于制备好的壳聚糖纳米粒子模板表面，经过调节pH值，层层沉积后，进一步处理即可得到所需的壳聚糖纳米粒子，如图1.7所示[32]。

图1.7 逐层自组装反应流程
(4)界面聚合法
界面聚合法是将含有亲水性单体溶液（多元胺，多元酚，多元醇等）乳化分散在疏水性的有机溶剂中，然后加入溶于该有机溶剂的疏水性单体（多元酰氯，多元硫酰氯，多异氰酸酯等），使两种单体在水/油界面处发生缩聚反应形成聚合物球壳。Wang等在温和的条件下通过界面聚合法一步制备多糖-多肽复合空心纳米粒子。先将壳聚糖与α-氨基NCA（N-carboxyanhydride）接枝共聚，再将一定量L-亮氨酸NCA分散至乙酸乙酯中，并用Span80乳化后与水溶性壳聚糖在一定条件下反应2 h，经进一步处理可得壳聚糖空心纳米粒子[32]。

图1.8 界面聚合法反应流程
(5)沉淀法
沉淀法是利用壳聚糖不溶于碱性溶液的性质制备纳米粒子。制备的方法是将用高压空气将壳聚糖溶液吹入碱性溶液如氢氧化钠，氢氧化钠甲醇溶液或乙二胺溶液中，沉降形成纳米粒子，如图1.9所示。然后用冷热水交替洗涤提纯产物。另一种操作方法为：在壳聚糖溶液中加入表面活性剂，然后再逐滴加入硫酸钠溶液，搅拌或超声30分钟后，离心分离出产物。此法制备的壳聚糖纳米粒子酸稳定性较强[31]。

图1.9 沉淀法反应示意图
(6)其他制备方法
制备壳聚糖纳米粒子的方法还有很多。溶剂蒸发法又称液中干燥法，常用的溶剂蒸发法是根据聚合物与药物的性质制成乳液体系，形成稳定乳液后，采用升温，减压抽提或连续搅拌等方法使有机溶剂扩散进入连续相并通过连续相和空气的界面蒸发，纳米粒子固化，并经过处理最终得到载药纳米粒子的过程[32]。目前最常用的方法是将壳聚糖醋酸溶液加入含表面活性剂的液体石蜡中，形成W/O型乳剂，升温再减压干燥除去溶剂，分离得到壳聚糖纳米粒子。Sinha等[28]采用此法制备了性质优良的壳聚糖纳米粒子。常见的壳聚糖纳米粒子制备方法还有离子凝胶法，反胶束法，壳聚糖包裹法和壳聚糖纳米粒子乙酰化法等[33]。
1.4.4 壳聚糖纳米粒子的应用
壳聚糖纳米粒子在肿瘤治疗方面应用广泛[33] 。它的应用主要有以下几方面：
(1)作为药物载体，可包埋多种类型药物
壳聚糖纳米粒子由于其良好的生物相容性，生物降解性和低细胞毒性，被广泛应用于药物载体方面。所包埋的常见药物有：牛血清白蛋白（BSA），青霉素，四环素，维生素，胰岛素等。Hejazi等采用乳化交联法制备了包载四环素的壳聚糖纳米粒子。经沙鼠动物实验发现，在酸性环境下的稳定性增加，能够黏附在胃黏膜上。Jaganathan等[37]采用乳化交联法制备了载有破伤风类毒素的壳聚糖纳米粒子，稳定剂海藻糖能够保持抗原蛋白质的活性，纳米粒子的包封率也从加入海藻糖前的40%提高到90%。
(2)缓控释给药
壳聚糖分子内具有活性基团氨基，可与含双官能团的醛类或酸酐类药物发生化学交联，使药物大量分布于交联结构，缓慢释放，包封在壳聚糖纳米粒子内的药物具有明显的缓释，控释特点。Wang等制备了壳聚糖胰岛素纳米粒子，其包封率高达70%，胰岛素的化学稳定性大于95%，并且胰岛素可以长时间稳定释放。Chandy 等[37]制备了壳聚糖包衣的PLA/PLGA纳米粒子，用于5-氟尿嘧啶的脑胶质瘤的靶向治疗，研究发现所得纳米粒子表面孔空隙率低，药物初次突释后呈典型的二相释药，可靶向结合脑胶质瘤，且稳定释放30 d以上。
(3)增加药物的靶向性
壳聚糖本身具有一定的黏膜黏附性，通过控制壳聚糖纳米粒子的大小，形状，选择适当的给药方法，能够提高壳聚糖纳米粒子的靶向效果。李扬等利用乳化分散法制备了左氧氟沙星羧甲基壳聚糖纳米粒子，体内外试验结果表明所载药物可如预想设计到达结肠定位释放。
(4)降低药物的毒副作用，提高疗效
载有药物的壳聚糖纳米粒子循血液循环到达靶区周围释放药物，使靶区周围很快达到有效的治疗药物浓度，而在机体其他部位药物的分布量较小，从而减少了对机体正常组织的毒副作用，同时由于载体壳聚糖本身具有一定的生理活性，且无毒，与药物可产生协同作用增强疗效。徐海涛等观察了壳聚糖-顺铂缓释纳米粒子对C6胶质瘤大鼠瘤内化疗的疗效，结果表明，壳聚糖-顺铂纳米粒子毒性小，安全性较高，疗效可靠。
(5)提高疏水性药物对细胞膜的通透性，增强细胞吸收
壳聚糖纳米粒子溶胀引起的扩散释药过程可以增加药物在吸收部位的浓度梯度，对药物的吸收具有协同促进作用。同时壳聚糖分子可以改变膜转运机制，打开细胞通道，有利于提高药物在细胞间瞬间渗透的能力，促进药物在细胞内发挥药效。Mooren等研究了泼尼松龙磷酸钠壳聚糖纳米粒子通过上皮细胞膜的情况，结果表明，壳聚糖纳米粒子可以改善上皮细胞膜对疏水性药物通透性。Mitra等将Doxorubicin（DXR）包封于壳聚糖纳米粒子中，不仅肿瘤实体内药物浓度提高，作用维持时间延长，治疗效果改善，不良反应也明显减轻。
(6)提高药物的稳定性
随着生物技术的发展，基因重组肽和蛋白质药物不断涌现，应用于临床的种类也越来越多。与化学合成药物相比，肽类药物具有毒副作用轻，吸收快的特点，但由于此类药物分子质量大，在体内外的稳定性差，在胃肠道内容易被酶降解，半衰期短，生物利用度极低，临床应用受限制。壳聚糖属亲水性聚合物，可制得不同大小的纳米粒子，将疫苗，蛋白质，抗生素类药物制成纳米粒子系统给药，不仅能有效防止药物在体内的快速降解，提高药物的稳定性，而且还能将药物缓慢释放并靶向送达体内的作用部位，从而达到长效缓释靶向的目的。Alexakis等制备了小牛胸腺DNA海藻酸酯纳米粒子，外面包覆壳聚糖制成载药纳米粒子后经过胃肠道时药物不被破坏，60%DNA可以从粪便等排泄物中得到。
1.5 课题的研究意义与创新点
1.5.1 课题的研究意义
恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病。癌症的化学预防是利用天然的或合成的化合物干预癌前病变，预防肿瘤的发生或使肿瘤细胞分化逆转，从而达到预防恶性肿瘤的目的。目前癌症化学预防研究的主要目标就是寻找高效低毒，作用机制明确的化学预防药物。硒代胱氨酸是一种新型高效的抗肿瘤药物，生物活性高，对正常细胞毒性小。但是研究表明，SeC不易进入肿瘤细胞，对细胞的渗透性不强。因此，希望借助纳米药物载体来提高细胞吸收，减少它进入肿瘤细胞的时间。本文通过乳化交联法制得壳聚糖纳米粒子载体负载硒代胱氨酸，并对MCF-7进行体外抗肿瘤活性实验，实验结果表明，壳聚糖能够增强硒代胱氨酸对MCF-7的细胞毒性，并在较短的时间内起作用。
1.5.2 创新点
通过以CSNPs为载体，有效增强SeC的体外抗肿瘤活性，并显著缩短SeC对MCF-7起作用的时间。

第二章 空白壳聚糖纳米粒子的制备
2.1 实验部分
2.1.1 材料与试剂
表2-1实验试剂
Table 2-1 Reagents used in experiment
试剂名称
规格
产地
液体石蜡
AR
天津市化学试剂公司
Span80
CP
天津市化学试剂公司
壳聚糖
D.D>90 % MW=60000
上海伯奥生物科技有限公司
戊二醛(25%)
AR
天津市百世化工有限公司
甲苯
AR
天津市百世化工有限公司
无水乙醇
AR
天津市百世化工有限公司
石油醚
AR
天津市百世化工有限公司
冰醋酸
AR
天津市百世化工有限公司
实验用水均为二次蒸馏水，药品称量均使用德国Sartorius 公司的电子分析天平，误差为±0.1 mg。玻璃仪器均经超声清洗40分钟，所有反应均在室温中（25 ℃）进行。
2.1.2 实验仪器
表2-2 实验仪器
Table 2-2 Apparatus used in experiment
仪器名称
型号
产地
电子天平
BP301S
德国Sartorius 公司
离心机
Centrifuge 5804R
Eppendorf
超声破碎仪
JY92-IIDN
宁波新芝生物科技股份有限公司
纳米粒度仪
Nano-ZS
英国马尔文(Malvern)公司
透射电子显微镜
TECNAI-10
荷兰Philips
相关仪器原理
（1）Nano-ZS型纳米粒度仪
英国马尔文公司(Malvern) Nano-ZS型纳米粒度仪，入射光为氦氖激光，波长λ = 633 nm，入射角90°，测量温度(25.0 ± 0.1) ℃；
常用的纳米粒度仪均采用激光作光源，故纳米粒度仪也称激光纳米粒度仪或激光粒度仪。激光粒度分析法是根据激光照射到颗粒后，颗粒能使散射的激光产生衍射或散射的现象来测试粒度分布的。其依据的光学原理为Fraunhofer衍射和Mie散射理论，因此相应的激光粒度分析仪分为激光衍射式和激光动态散射式两类。但是很多研究证明对于粒径小于1 μm的颗粒，必须用Mie散射理论求解粒径分布。散射式纳米粒度分析仪基于动态光散射（DLS）技术，与激光散射仪中动态光散射测量粒径分布的原理一样，是借助光子相关原理（PCS)检测因布朗运动及多普勒效应产生的散射光的微小频移而得到散射质点动态行为的信息技术。测试范围下限可达到1 nm，可测悬浮液、乳浊液、微乳液等体系。本论文中，利用纳米粒度仪来快速、准确方便地对纳米溶胶样品中颗粒的大小及分布、形态等进行测定。
(2) 透射电子显微镜
透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM），型号TEANAI-10型透射电子显微镜philips，或高分辨透射电子显微镜（High resolution transmission electron microscope，HRTEM)，它是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。本论文研究中以TEM观察壳聚糖纳米材料的结构。
2.1.3 实验方法
称取CS溶于2%乙酸溶液中，搅拌使其溶解后备用。取500 μL CS溶液缓慢滴加到含有表面活性剂span80的的液体石蜡中，经超声处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。
由于采用乳液交联法制备壳聚糖纳米粒子的影响因素有以下几个：壳聚糖溶液浓度，油水比，表面活性剂用量，pH值，搅拌速率，乳化时间，交联剂用量，交联时间和交联温度等。本实验将选取不同壳聚糖溶液浓度，不同油水比，不同的表面活性剂用量以及不同的交联剂用量，不同的油相体系，筛选出制备壳聚糖纳米粒子的最佳工艺条件，用以后续的载药制备。
(1)不同油相体系的选择（1）（2）（3）（4）（5）的方法是平行的，用最佳条件做就好了~

水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D>90%）的壳聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。
油相：分别选用液体石蜡，甲苯各25 mL，加入占其体积5%(1.25 g)的Span80,搅拌均匀后备用。
取500 μL CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加1%的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。
(2)不同油水比的选择
水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D>90%）的壳聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/ml的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。
油相：分别量取液体石蜡5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，加入占其体积5%的Span80,搅拌均匀后备用。
取500 μL CS溶液缓慢滴加到不同体积的油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加1%×3 ml的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。
(3)不同表面活性剂用量的选择
水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D>90%）的壳聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。
油相：量取液体石蜡25 mL，加入占其体积2%，3%，4%，5%，6%的Span80，搅拌均匀后备用。
取500 μL CS溶液缓慢滴加到含不同量Span80的油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。
(4)不同壳聚糖浓度的选择
水相：分别称取分子量为60000的壳聚糖（D.D>90%）的壳聚糖250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成浓度分别为10 mg/mL，15 mg/mL，20 mg/mL，25 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。
油相：量取液体石蜡25 mL，加入占其体积3%(0.75 g)的Span80,搅拌均匀后备用。
取500 μL 不同浓度的CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加1%的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。
(5)不同交联剂用量的选择
水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D>90%）的壳聚糖375 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成浓度为15 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。
油相：量取液体石蜡25 mL，加入占其体积3% (0.75 g)的Span80,搅拌均匀后备用。
取500 μL CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后分别逐渐滴加2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL 1 %的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。
取500 μL CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后分别逐渐滴加0.5%，1%，3%，5%，7%的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。
2.2 实验结果与讨论
2.4.1 油相体系对壳聚糖纳米粒子的影响
(1)粒径分布及其稳定性的分析
表2-3 和图2.1是不同的油相体系对壳聚糖纳米粒子粒径的影响.从图中可以看出，甲苯作为油相制备所得的纳米粒子粒径与PdI明显比液体石蜡制得的粒子大，这可能与油相体系的粘度有关。

表2-3 油相体系比对纳米粒子粒径的影响
Table 2-3 Effect of different oil phase on nanoparticles' sizes
No.
size(d.nm)
PdI
paraffin
toluene
paraffin
toluene
1
169.0
205.7
0.200
0.345
2
247.4
276.4
0.294
0.436
3
186.5
225.6
0.193
0.507
4
204.2
495.1
0.154
0.778

图2.1 油相体系对纳米粒子粒径的影响
Fig. 2.1 Comparison of different oil phase on nanoparticles’ size
2.4.2 油水比对壳聚糖纳米粒子的影响
(1)粒径分布及其稳定性的分析
表2-4与图2.2是不同油水比对壳聚糖纳米粒子粒径的影响。从表跟图中可以看出，粒子粒径在油相体积较小时粒径随油相体积增加而增加，当油相体积增加到一定量时，则随着油相体积的增加而减少。这可能是由于在油相体积较小时，水相纳米粒子分散不均匀，存在纳米粒子粘连现象，而交联剂的加入使得这些纳米粒子粘连现象加重，从PdI和粒径分布图看出，油相体积比小时PdI较大，分散不均匀。随着油水相体积比增大，水相纳米粒子能够被较厚的油相膜隔离开，降低了在超声分散过程中纳米粒子粘连的几率，从PdI和粒径分布图看出，油水相体积比增大，粒径分布更加均匀，粒径减小。
表2-4 油水比对纳米粒子粒径的影响
Table 2-4Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles ' sizes
No.
O/W(V/V)
Paraffin(ml)
Size(d.nm)
PdI
A-1
10:1
5
140.7
0.244
A-2
20:1
10
157.2
0.195
A-3
30:1
15
167.8
0.130
A-4
40:1
20
160.7
0.207
A-5
50:1
25
150.8
0.121

图2.2 油水比对纳米粒子的影响
Fig. 2.2 Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles' sizes

图2.3 不同油水比纳米粒子的粒径分布
Fig. 2.3 Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles' sizes
(A-1) O/W=10:1 (A-2) O/W=20:1 (A-3) O/W=30: 1 (A-4) O/W=40:1 (A-5) O/W=50:1
(2) TEM分析
TEM（TEANAI-10型透射电子显微镜，philips）观察形貌：将样品分散均匀，用铜网蘸取