基于单核转录组测序分析面肩肱型肌营养不良症中肌肉微环境特征.pdf

Correspondir儿-ei生物工程494-BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期网络出版时间：2 0 2 3-0 6-2 8 12：56：57 D0I：10.13339/j.c n k i.s g l c.2 0 2 30 6 2 6.0 0 9网络出版地址：https:/ 例FSHD患者,男性1例,年龄6 5岁,病程43年；女性1例,年龄46 岁,病程32 年；采集双侧不对称病变的口轮匝肌（轻度组：2 例患者肌肉损伤相对正常侧；重度组：2 例患者肌肉损伤较重侧）。2 例健康志愿者，男性1例，年龄42 岁；女性1例，年龄38 岁；采集男性左侧和女性右侧正常口轮匝肌(对照组）。对6 个样本进行单细胞核转录组测序分析。过滤掉低质量细胞后，对所有样本的4430 3个细胞进行聚类分群和细胞类型鉴定，寻找各细胞类型中疾病组和对照组之间的差异表达基因，并对这些基因进行通路富集分析，分析其参与的生物学过程。通过基因集特征评分探索不同样本中特定细胞类型的功能状态差异，利用拟时序分析构建特定细胞类型的单细胞发育轨迹。结果从6 个样本的肌肉组织中共鉴定出10 种细胞类型，即肌细胞、卫星细胞、纤维/脂肪祖细胞（FAPs）、巨噬细胞、T淋巴细胞、肥大细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、脂肪细胞、施旺细胞。其中免疫细胞和FAPs介导的微环境失调在FSHD疾病进展中起重要作用。重度组M1型巨噬细胞的比例增加，促进了肌肉炎症和脂肪替代。疾病组FAPs处于分化紊乱的异常状态,并激活了促炎症、纤维化及脂肪化的相关基因,与FSHD的双侧肌肉不对称改变有关。最后，在重度组的巨噬细胞和FAPs中鉴定了一组关键基因：脂肪酸转位酶基因（C D 36），过氧化物酶体增殖物激活受体基因（PPARG），半乳糖凝集素1基因（LGALS1），骨形态发生蛋白5基因（BM P5），核受体亚家族4A组成员1基因（NR4A1），磷酸二酯酶基因10 A（PD E10 A），可作为FSHD的潜在治疗靶点。结论实验研究揭示了FSHD双侧肌肉样本的细胞谱系组成和转录异质性，探索了免疫细胞和FAPs在FSHD肌肉微环境中的作用,有助于FSHD的治疗和预后。关键词：单细胞转录组测序；面肩肱型肌营养不良症；肌肉微环境；免疫失调；纤维/脂肪祖细胞（FAPs）中图分类号：R746.2;Q75文献标识码：A文章编号：10 0 9-7 0 9 0(2 0 2 3)0 4-0 49 4-0 9Characterization of muscle microenvironment in facioscapulohumeral muscular dystrophy based on single-nuclRNA sequencingLIU Si-yu,SONG Tao,YIN Ning-bei(Department of Cleft Lip and Palate,Plastic Surgery Hosptal,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing100144,China)ng author:YIN Ning-bei.E-mail:.Abstract:Objective To analyze the composition and transcriptional heterogeneity of each cell lineage in muscle microenvironment of facioscapulohumeral muscular dystrophy(FSHD)by single-cell nuclear transcriptome sequencing,because the acti-vation of double homeobox 4 gene(DUX4)and its target genes is the key mechanism in pathogenesis of FSHD.Methods Twopatients with FSHD were enrolled,which included 1 male(aged 65-year-old,duration disease 43 years)and 1 female(aged46-year-old,duration disease 32 years).The bilateral asymmetric lesions of orbicularis oris muscle were collected(mildgroup:2 patients with relatively normal muscle side;severe group:2 patients with more severe muscle damage side).Twohealthy volunteers were selected,which inclued 1 male(aged 42-year-old)and 1 female(aged 38-year-old),the normal or-bicularis oris muscle was collected from the left side of male and the right side of female(control group).The single-cell nu-clear transcriptome sequencing analysis was performed on 6 samples.After the low-quality cells were filtered out,all sam-ples of 44 303 cells were clustered and cell types were identified,the differentially expressed genes between disease groupand control group in each cell type were searched,and pathway enrichment analysis was performed to analyze the biologicalprocesses involved.The functional status differences of specific cell types in different samples were explored by gene set fea-ture scoring,and the single cell development trajectory of specific cell types was constructed by pseudo time series analysis.Results A total of 10 cell types were identified from muscle tissue of 6 samples:myocyte,satellite cells,fibrous/adipose pro-作者单位：中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院唇聘裂中心，北京10 0 144作者简介：刘思宇（19 9 3），女，河北沧州市人，博士，住院医师，主要从事唇聘裂领域的基础和临床研究。电话：[phone]。E-mail:lsy_。通信作者：尹宁北(19 6 8），男，北京市人，博士，主任医师，主要从事唇聘裂领域的基础和临床研究。电话：[phone]。E-mail:。版权保护，不得翻录。495-BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期genitor cells(FAPs),macrophages,lymphoid T cells,mastocyte,endothelial cells,vascular smooth muscle cells,adipocytes,and Schwann cells.Among them,immune cells and FAP-mediated microenvironmental dysregulation play an important role inFSHD disease progression.The increased proportion of M1-type macrophages in severe group promoted muscle inflammationand fat replacement.FAPs in disease group were in an abnormal state of disturbed differentiation and activated genes promot-ing muscle inflammation,fibrosis and fat infiltration,associated with bilateral muscle asymmetric changes in FSHD.Finally,aset of key genes were identified in macrophages and FAPs in severe group:Fatty acid translocase gene(CD30),peroxisome pro-liferator activated receptor gamma gene(PPARG),galectin 1 gene(LGALSI),bone morphogenetic protein 5 gene(BMP5),nuclearreceptor subfamily 4 group A member 1 gene(NR4A I),phosphodiesterase 10A gene(PDE10A),which were potential therapeutictargets for FSHD.Conclusion It is demonstrated that the study reveals the cell lineage composition and transcriptional hetero-geneity of FSHD bilateral muscle samples and explores the role of immune cells and FAPs in FSHD muscle microenvironment,contributing to the treatment and prognosis of FSHD.Key words:single-cell transcriptome sequencing;facioscapulohumeral muscular dystrophy;muscle microenvironment;immunedysregulation;fibro/adipose progenitor cells(FAPs)面肩肱型肌营养不良症（facioscapulohumeralmusculardystrophy,FSHD)的典型特征是进行性肌无力，伴有肌萎缩,病理性纤维化及脂肪浸润 1 3。FSHD与表观遗传抑制失败引起的逆转录基因双同源盒蛋白4基因（double homeobox 4gene,DUX4)的异常表达有关。该基因在成年人组织中处于沉默状态,其在骨骼肌中的异常表达可导致细胞死亡 4.5。目前已经确定了10 0 多个由DUX4激活的靶基因,通过介导细胞毒性、氧化应激及炎症反应等引发FSHD 的病理变化6 8。除DUX4表达外,FSHD的关键病理机制仍然未知。研究表明，既往早期的DUX4表达有可能会改变肌肉稳态，导致FSHD疾病状态的持续存在和进展19 。这意味着，FSHD的病理改变可能不仅由DUX4驱动，还可能由异常的肌肉微环境驱动，例如持续地炎症和病理性纤维化状态 10,。此外,FSHD区别于其他肌营养不良的主要特征是肌肉病变的双侧不对称，但机制尚不清楚。因此,FSHD进展过程中肌肉微环境中发生改变的细胞类型可能成为未来治疗的新靶点，迄今为止，大多数关于FSHD的研究都是在表达DUX4的体外系统中进行的,涉及FSHD肌肉活检的转录组研究也主要限于普通转录组测序（bulkRNAsequencing,bulk RNA-seq)112。之前有两项关于FSHD的单细胞测序研究 13,14,也主要集中在肌源性细胞上，不涉及肌肉活检的多细胞类型分析。因此，笔者研究旨在通过单细胞核转录组测序（single nucleiRNA sequencing,snRNA-seq),全面表征FSHD肌肉微环境的细胞谱系组成和转录异质性,为理解FSHD的发病机制及药物靶向治疗提供更直观和新颖的视角。1材料与方法1.1实验材料1.1.1临床材料选择2 0 2 1年8 月至2 0 2 2 年4月就诊于中国医学科学院整形外科医院唇聘裂中心的2 例FSHD患者，男性1例,年龄6 5岁，病程43年；女性1例，年龄46 岁，病程32 年；采集双侧不对称病变的口轮匝肌。2 例健康志愿者,男性1例，年龄42 岁；女性1例，年龄38 岁；采集男性左侧和女性右侧正常口轮匝肌。收集各研究对象的临床和病理特征。遵守中国医学科学院整形外科医院伦理委员会规定，已获得研究对象或其家属的书面知情同意书，并得到医院医学伦理委员会批准1.1.2主要试剂、仪器与软件磷酸盐缓冲溶液、2%胎牛血清、细胞核EZ裂解缓冲溶液（Sigma,美国）。常温离心机、冷冻离心机、Qubit4.0Flouromete(ThermoFisher Scientific,美国）。Cellranger v 6.0,Seurat v 4.1.1,Monocle 2 v 2.22.0,SingleRv1.0软件(10 X Genomics,美国)。1.2方法1.2.1标本处理每个样本采集约2 50 mg肌肉组织，于4条件下保存送至实验室。用磷酸盐缓冲溶液反复清洗肌肉组织,去除残留血液和杂质,剪碎肌肉组织至3 5mm的小块。将肌肉组织重悬于0.5mL细胞核EZ裂解缓冲溶液中，并用研磨机在冰上均质化。匀浆依次通过70mm和40 mm细胞过滤器过滤，并在4(10 0 0 g)下离心5min以沉淀细胞核。将沉淀物重悬于1mL冷洗缓冲溶液（含有2%胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液），随后通过2 0 m细胞过滤器过滤，即得到单细胞核悬液1.2.2单细胞核转录组测序1.2.2.1细胞捕获和cDNA合成以 6 0 0 0 8 0 0 0个细胞核为最终目标捕获量，根据10 XGenomics的操作说明，利用微流控芯片将带有细胞标签序列（cellbarcode)的胶珠(bead)和单细胞核悬液中的细胞核一起包裹在液滴中，细胞核在液滴中发生裂解，使得细胞核中的mRNA与bead上面的cell barcode相连。通过在3 端使用poly(A)碱基互补来捕获特定的mR-496-BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期NA，从而构建逆转录文库。以cDNA为模板进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增，完成后进行cDNA质检及定量。1.2.2.2单细胞文库构建和测序根据操作指南使用 Chromium Single Cell 3GEM、Li b r a r y 和Gel BeadKitv3.1构建单细胞文库。使用cDNA酶切割为2 0 0 300bp左右的片段，然后进行末端修复并加人A尾结构，连接P7适配器接头，通过PCR扩增引入样品Tndex,最后筛选片段得到cDNA文库。使用Illumina的NovaSeq平台进行Pair-end双端文库测序，每个细胞的测序深度至少为430 0 0 个读数。1.2.3单细胞核测序数据分析1.2.3.1质控、降维和聚类分析使用 Cellranger 对下机数据进行比对和定量，获得cellxgene的表达式矩阵。使用Seurat对数据进行过滤。正常情况下默认过滤掉：只在3个细胞中表达的基因；过滤掉总基因数 50 0 0 或者 10%的细胞。对多样本进行整合并使用Seurat进行无监督聚类分群。聚类分群流程包括如下步骤：使用“Nor-malization函数的LogNormalize方法，进行表达量标准化；使用在3个细胞中表达并且高度可变的前2 0 0 0 个基因进行主成分分析，选取前2 0 个主成分用于后续的聚类和分群分析；采用louvain算法对归一化后的数据进行聚类分析；采用统一流形逼近与投影方法（uniform manifold approximation andprojection,UMAP)进行降维将结果可视化展示。1.2.3.2细胞类型鉴定基于wilcox算法筛选mark-er基因,以划分、注释细胞群。具体筛选标准为：基因在细胞群中的表达比例,pct.1或pct.20.25;表达倍数avg_log2FC0.25；P1;P 0.0 5。1.2.3.4通路富集分析针对不同细胞类型的DEG使用clusterProfiler进行京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。挑选显著富集的KEGG通路(P0.05）,从而确定DEG行使的主要生物学功能1.2.3.5拟时序分析使用Monocle软件包，根据cluster间差异表达的基因，以伪时间顺序构建单细胞发育轨迹。使用双倍数据流树（doubledata ratetree，DDRTree）来实现降维。最后使用Monocle包中的plot_cell_trajectory函数来进行可视化 151.2.3.6基因集特征评分使用基因集特征评分探索不同样品中特定细胞类型的功能状态，每个特征的详细基因列表在相应参考文献中提供。通过“Ad-dModuleScore函数计算基因集的归一化加权平均表达，并通过非参数Wilcoxon秩和检验比较不同样品之间的表达差异1.2.4观察指标FSH D 肌肉组织的基本细胞谱系组成；FSHD肌肉微环境中各细胞类型转录组特征；不同样本中特定细胞类型的功能状态及发育轨迹1.3统计学方法使用SPSS26.0(IBM)进行统计学分析。采用t检验比较各组间DEG的表达水平,P0.05为差异具有统计学意义。采用Wilcoxon秩和检验比较各组间基因集特征表达差异。检验水准值取双侧0.0 5。2绍结果2.1样本特征采集2 例FSHD患者双侧不对称病变的口轮匝肌和2 例正常口轮匝肌共6 个样本制备单细胞核悬液。样本中2 例FSHD患者口轮匝肌损伤相对正常侧为轻度组，编号M1、M 2;肌肉损伤较重侧为重度组，编号S1、S2;2 例健康志愿者的正常肌肉为对照组，编号N1、N2。见图1。6个样本N1、N2、M 1、M 2、S1、S2 的单细胞核悬液浓度分别为310、50 0、550、46 0、350、52 0/L；细胞总量分别为6 2 0 0、2 0 0 0 0、2 2 0 0 0、18 40 0.7 0 0 0、10 40 0 个；测序得到有效细胞数分别为30 9 3、10 59 0、136 48、13124、2 30 7、58 40 个；过滤掉低质量细胞后，分别纳人2 9 8 7、9 7 0 4、12 148、117 36、2 2 32、549 6 个细胞进行后续分析。2.2面肩肱型肌营养不良症肌肉组织的基本细胞类型对6 个样本的4430 3个细胞进行UMAP无监督聚类分析，分为2 3个cluster，根据典型标记基因共鉴定出10 种细胞类型（图2 A、B)：肌细胞 myocyte，14032个。用肌联蛋白基因（titingene,TTN）、肌动蛋白l基因(actinalpha1gene,ACTAI)标记,卫星细胞 satellitecells,719个。用配对盒7 基因(paired box7gene,PAX7)标记,纤维/脂肪祖细胞 fibrous/adiposeprogenitorcells(FAPs）,8 6 8 2 个。用血小板衍生生长因子受体基因(platelet derived growth factor recep-497BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期A重度组活检轻度组对照组单细胞样品制备10XGenomics snRNA-seq细胞聚类BS1S2M1MA:snRNA-seq流程图;B:FSHD患者口轮匝肌超声图1ssnRNA-seq流程和样本特征Fig.1Images of snRNA-seq process and sample characteristicstoralphagene,PDGFRA）标记，平滑肌细胞 smoothmuscle cells,6 780个。用肌球蛋白重链11基因(myosin heavy chain 1l gene,MYH11)、肌动蛋白基因(actin alpha 2 gene,ACTA2)标记,内皮细胞 en-dothelial,8563个。用血小板和内皮细胞黏附分子1基因(platelet and endothelial cell adhesion molecule 1gene,PECAMI)、血管性血友病因子基因(von wille-brand factor gene,VWF)标记,巨噬细胞 macrophage,1875个。用CD163分子基因(CD163molecule gene,CD163)标记,肥大细胞 mastocyte,309个。用羧肽酶A3基因(carboxypeptidase A3gene,CPA3)标记,T细胞 Tcells,445个。用CD247分子基因（CD247molecule gene,CD247)标记,脂肪细胞 adipocyte,1466个。用脂肪酸结合蛋白4基因（fattyacid binding protein 4 gene,FABP4)标记,施旺细胞 Schwann,1432个。用髓磷脂蛋白PO基因（myelinproteinzerogene,MPZ)标记。3组样品中各种细胞类型的比例存在较大差异（图2 C)。FSH D 重度组中,肌细胞比例明显下降（对照组2 6.8%，轻度组38.9%，重度组17.2%）；FAPs比例升高（对照组18.0%,轻度组19.6%,重度组2 2.0%）；脂肪细胞比例明显升高（对照组0.7%,轻度组2.2%,重度组11.0%)。FSHD两组中内皮细胞(对照组2 6.2%，轻度组15.6%，重度组19.4%）和平滑肌细胞（对照组2 1.0%,轻度组11.5%，重度组17.5%）比例均下降，免疫细胞中巨噬细胞比例均明显升高（对照组1.0%，轻度组5.0%，重度组6.4%）。1515FAPScelltype:myocyte(14032)odpoeyto10MastoeyteFAPs(8682)10mexrophageendothelial(8563)smoothmusclecells(6780)2disease:dVWnMInyocytomacrophage(1875)55Mild(23884)adipocyte(i466)NorumalSevere(7728)Schwann(1432)SdhwannNormal(12691)esatellitecells(719)0BmoothmucheeollsTcells(445)0andothohanmastocyte(309)1A-5051015-5051015UMAP_1UMAP_1myocyteendothelialmastoocytesmoothmusclecellsAGBLIcell TypeFAPsmacrophagesatellitecellsPAX7TcellsadipocyteSchwann454PDCFRAMYHIIACTA2MildMild4PECAMIVWFMS4A6ACD163NormalNormalCPA3THEMIS34CD247SevereSevere4PLINIFABP4CBDEFGH1JKLM0%25%50%75%100%0._10 000 20.000每种细胞比例每簇细胞D:myoctye;E:FAPs;F:endothelial;G:smooth muscle cells;H:macrophage;I:adipocyte;J:Schwann;K:satellite cells;L:T cells;M:mastocyte。A：U M A P细胞聚类分布,左侧按细胞类型分群，右侧按组别分群;B：各细胞类型标记基因表达；C:3组中各细胞类型比例图2 FSHD单细胞核转录图谱Fig.2 Single cell nuclear transcriptional profiles of FSHD498-BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期2.3面肩肱型肌营养不良症免疫细胞的转录异质性6个样本中共有2 6 2 9 个免疫细胞，分为3种类型,即T淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞。分别比较了FSHD重度组和轻度组免疫细胞与对照组间的DEG，其中巨噬细胞的上调基因在3种细胞中最多，提示巨噬细胞在FSHD免疫微环境中发挥了重要作用。接下来重点分析了巨噬细胞的转录特征，发现FSHD两组巨噬细胞都存在免疫功能失调和细胞毒性损伤。与轻度组相比,重度组巨噬细胞中参与脂肪细胞分化和脂质代谢的基因过氧化物酶体增殖物激活受体基因(peroxisome proliferator activated recep-torgammagene,PPARG)、脂肪酸转位酶基因(fatyacidtranslocasegene,CD36）、半乳糖凝集素1基因(galectin 1 gene,LGALS1)、T o l l 样受体4基因（tolllike receptor4gene,TLR4)高表达，提示巨噬细胞可能参与了损伤肌肉的病理性脂肪替代过程，上述基因的拮抗剂可作为潜在治疗靶点。此外,重度组巨噬细胞中诱导免疫炎症的基因GLIS家族锌指3基因(GLIS family zinc finger 3gene,GLIS3)、白细胞介素 6受体基因(interleukin 6 receptorgene,IL6R）、造血前列腺素D合酶基因（hematopoietic prostaglandin Dsynthase gene,HPGDS)、白三烯C4 合酶基因(leukotriene C4 synthase gene,LTC4S)表达上调。2.3.1面肩肱型肌营养不良症巨噬细胞差异基因的功能富集分析对FSHD巨噬细胞的DEG进行KEGG通路富集分析（图3）。与轻度组相比，重度组巨噬细胞富集到明显更多的上下调通路，表明重度组存在更严重的免疫功能失调状态。其中上调通路富集到脂质和动脉粥样硬化通路和过氧化物酶体增殖物激活受体通路，与肌肉的病理性脂肪浸润相关。以上提示巨噬细胞可能是FSHD免疫失调微环境中的主要调控子,并参与脂肪沉积的调控2.3.2不同样本中巨噬细胞的极化特征为深人了解巨噬细胞在不同样本之间的状态，利用M1和M2极化特征基因集计算了M1和M2极化评分 16 。结果显示,重度组巨噬细胞具有显著更高的M1评分（图4）。这表明FSHD中存在M1/M2型巨噬细胞的比例失调，过度的M1类型激活会损伤肌肉组织，诱发严重的炎症反应7。ALysosomeLipid and atherosderosisBRibosomeEndocytosisPhagosomeHIF-1 signaling pathwayAcutemyeloid leukemiacGMP-PKG signaling pathwayAutophagy-animalPPARsignaling pathwayPhagosomeOsteoclastdifferentiationInsulin signaling pathwayMitophagy-animalApelin signalingpathwayHiF-Isignaling pathwayTNF signaling pathwayRapl signaling pathwayndlegendJAK-STATsignaling pathwayupMAPK signaling pathwayLupPi3K-AktsignalingpathwaydowndownTNF signaling pathwayTh1 and Th2 cell differentiationNecroptosisHumanT-cell leukemia virusIinfectionApelin signaling pathwayIL-17signalingpathwayThl andTh2.celldifferentiationTranscriptionalmisregulation in cancerMAPKsignalingpathwayProtein processing in endoplasmicHuman T-cell leukemia virus 1 infectionreticulumLipidand.atherosclerosisAntigen processing and presentationThi7celldifferentiationTh17cell differentiationAntigenprocessingandpresentation6420244048-logl0(Pvalue)log10(Pvalue)A：重度组;B:轻度组图3FSHD巨噬细胞的KEGG富集分析Fig.3Images of KEGG enrichment analysis of FSHD macrophages2.3.3面肩肱型肌营养不良症免疫细胞表达DUX4直接靶基因既往研究表明,DUX4及其靶基因的异常表达主要发生在肌源性细胞中，但尚未有研究发现免疫细胞是否也可直接表达DUX4及其靶基因 18.19 。为证实上述问题，将YaoZ等 鉴定的DUX4直接靶基因集与笔者研究中免疫细胞的表达基因重叠，结果表明少量DUX4直接靶基因也在免疫细胞中异常表达（图5），证实免疫细胞可能是FSHD的非肌源性贡献者。2.4面肩肱型肌营养不良症中纤维/脂肪祖细胞的转录异质性2.4.1两组纤维/脂肪祖细胞的差异基因为研究FSHD组FAPs的异质性，分别比较了FSHD重度组、轻度组与对照组之间的DEG,并鉴定了一组与疾病相关的功能性DEG。结果表明,下调的功能性DEG在FSHD两组间差异很小，主要是调节细胞正常功能的基因；上调的功能性DEG在重度组明显增加,如成脂因子PPARG；促调亡、促炎症基因神经轴突导向因子1基因（n e t r i n 1g e n e,NT N1)、轴BME&ClinMed,July2023,Vol.27,No.4499生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期0.004 10.835.1e-060.00760.500.64disease0.40.16diseaseNormalNormalMildMild0.25Severe0.2Severe三000.Q400.010.0500-0.2-0.25NormalMildSevereNormalMildSevere图4巨噬细胞M1和M2极化评分Fig.4Images of macrophage M1 and M2 polarization scores01PRAZSCAN4Z-score(normalized scale.data)Percent?20%40%060%080%0100%-10123图5FSHD免疫细胞的DUX4靶基因重叠热图Fig.5Heat map of DUX4 target gene overlap of FSHD immunecells突导向受体蛋白3基因（roundaboutguidance receptor3gene,ROBO3)、胰岛素样生长因子结合蛋白6 基因(insulin like growth factor binding protein 6 gene,IGF-BP6)等仅在重度组上调。此外，还发现了4个与FAPs诱导纤维及脂肪化密切相关的关键基因：骨形态发生蛋白5基因（bone morphogenetic protein 5gene,BMP5），核受体亚家族4A组成员1基因（nu-clear receptor subfamily 4 group A member 1 gene,NR4A1），磷酸二酯酶10 A基因（phosphodiesterase10Agene,PDE10A）和PPARG。以上基因或可作为FAPs的潜在治疗靶点。其中前3个基因在两组中均差异表达，与促纤维化状态相关;PPARG仅在重度组差异表达，促使FAPs启动脂肪分化程序，转化为脂肪细胞,与重度组中FAPs介导的脂肪浸润相关。对FSHD组FAPs的DEG进行KEGG功能富集分析，发现两组下调通路差异不明显，但重度组上调通路增加了过氧化物酶体增殖物激活受体通路和脂肪细胞的脂解调节通路，提示重度组FAPs参与了脂质沉积的病理过程(图 6)。2.4.2两组纤维/脂肪祖细胞发育轨迹为了解FAPs在FSHD中的发育轨迹,对6 个样AThermogenesisBOxidative phosphorylationOxidative phosphorylation一ThermogenesisPPAR signalingpathwayChemical carcinogenesis-reactive oxygen speciesRegulation of lipolysis in adipocytesRibosomePathways of neurodegeneration-multiple diseasesComplement and coagulation cascadescGMP-PKG signaling pathwayOxytocin signaling pathwayWnt signaling pathwayTNF signalingpathwaylegendAMPK signalingpathwaylegendOsteoclastdifferentiationLupTNF signaling pathwayLupErbB signaling pathwaydownIdownFluid shear stress and atherosclerosisFox0 signaling pathwayEGFRtyrosinekinaseinhibitorresistanceReaxin signaling pathwayMAPKsignalingpathwayTranscriptional misregulation in cancerLipidandatherosclerosisP13K-Akt signaling pathwayRelaxin signaling pathwayMAPK signaling pathwayECM-receptorinteractionP13K-Akt signaling pathwa