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基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析王佳琦，王欣，邓小梅，吴蔼民（华南农业大学林学与风景园林学院，广东广州510642）摘要：【目的目的】花榈木 Ormosia henryi 是重要的木本药用植物。研究花榈木萜类次生代谢物积累规律，分析萜类生物合成通路和相关的关键酶基因，对花榈木药用价值的开发具有重要意义。【方法方法】采用液相色谱-质谱联用技术与高通量转录组学测序，利用生物信息学分析方法从差异代谢产物和表达基因中寻找萜类生物合成的关联酶基因。【结果结果】代谢组数据中共检测到了 15 种萜类化合物，其中含有甘草次酸、齐墩果酸和芳樟醇等具有药用活性的物质，多数在叶片中相对含量高于其他组织部位。转录组数据筛选出 49 个与萜类合成有关的候选基因，分析后发现：甲羟戊酸(MVA)途径中的差异基因在幼叶中表达较高，甲基赤藓糖磷酸酯(MEP)途径的差异基因在老叶中表达较高。根据加权基因共表达网络(WGCNA)分析，发现 MYB、WRKY、bHLH 和 HB-HD-ZIP 等转录因子家族在花榈木的萜类合成中起重要作用，并推测了 6 个可能与萜类物质生物合成有关的转录因子，即 HB-HD-ZIP(c64527.graph_c1)、GRF(c76195.graph_c0)、DBB(c66970.graph_c2)、DBB(c75593.graph_c0)、HB-HD-ZIP(c63393.graph_c0)和 C3H(c70385.graph_c1)。【结论结论】从花榈木代谢组和转录组数据库中初步获得了重要的萜类物质及可能参与萜类化合物生物合成途径的候选关键酶基因，为进一步阐明花榈木萜类化合物生物合成的分子机制奠定基础。图 8 表 1 参 36关键词：花榈木；代谢组；转录组；萜类化合物；生物合成中图分类号：S722文献标志码：A文章编号：2095-0756(2023)05-0970-12AnalysisofcandidategenesforterpenesynthesisinOrmosia henryibasedonmetabolomeandtranscriptomeWANGJiaqi，WANGXin，DENGXiaomei，WUAimin（CollegeofForestryandLandscapeArchitecture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642,Guangdong,China）Abstract:ObjectiveOrmosia henryiisanimportantwoodymedicinalplant.Thisstudyaimstoexploretheaccumulationpatternofterpenesecondarymetabolitesandanalyzetheterpenebiosynthesispathwayandrelatedkey enzyme genes,which is of great significance to the development of medicinal value in O.henryi.Method Liquid chromatography-mass spectrometry and high-throughput transcriptomic sequencing wereusedtofindtheassociatedenzymegenesofterpenebiosynthesisfromdifferentiallyexpressedgenesbasedonbioinformaticsanalysis.ResultAtotalof15terpenecompoundsweredetectedinthemetabolomicdataandtheycontainedenoxolone,oleanolicacid,linaloolandothersubstanceswithmedicinalactivity,mostofwhichwererelativelyhigherinleavesthaninothertissueparts.Transcriptomedatascreened49candidategenesrelatedtoterpenesynthesis,andafteranalysisitwasfoundthatdifferentialgenesintheMVApathwaywerehighlyexpressedinyoungleaveswhiledifferentialgenesintheMEPpathwaywerehighlyexpressedinoldleaves.BasedonWGCNAanalysis,itwasfoundthattranscriptionfactorfamiliessuchasMYB,WRKY,bHLH收稿日期：2022-11-28；修回日期：2023-03-09基金项目：广东省林业科技创新项目(2017KJCX028)作者简介：王佳琦(ORCID:0000-0002-6444-7077)，从事花榈木次生代谢研究。E-mail:。通信作者：吴蔼民(ORCID:0000-0001-8322-8833)，教授，博士，从事林木生物学研究。E-mail:浙江农林大学学报，2023，40（5）：970981Journal of Zhejiang A&F Universitydoi:10.11833/j.issn.2095-0756.20220737andHB-HD-ZIPplayedanimportantroleinterpenesynthesisofO.henryi,and6transcriptionfactorsthatmightberelatedtoterpenebiosynthesiscontentwerepredicted,namelyHB-HD-ZIP(c64527.graph_c1),GRF(c76195.graph_c0),DBB(c66970.graph_c2),DBB(c75593.graph_c0),HB-HD-ZIP(c63393.graph_c0)andC3H(c70385.graph_c1).Conclusion Important terpenes and candidate key enzyme genes that mayparticipateinthebiosynthesispathwayoftheseterpeneshavebeenpreliminarilyobtainedfromthedatabaseofmetabolomicsandtranscriptomeofO.henryi.Ch,8fig.1tab.36ref.Key words:Ormosia henryi;metabolome;transcriptome;terpenoids;biosynthesis花榈木 Ormosia henryi 为豆科 Leguminosae 红豆属 Ormosia 重要木本药用植物，主要产于东南亚和南美洲，属于国家二级保护植物，在野外处于中度濒危状态1。花榈木常以根、根皮及茎、叶入药。全国中草药汇编记述，其性味归经为辛、温，有毒，具有活血化瘀、祛风、消肿之功。研究发现：红豆属植物含有生物碱、黄酮、苯丙素、萜类和挥发油等多种化学成分，其中萜类化合物是一类重要的活性物质2。迄今为止，已从红豆属不同植物中发现大量的萜类化合物，如丁香酚、苯乙醇、榄香素和棕榈酸等化合物，并发现多种物质具有消炎、抗氧化、抗菌的作用34。萜类物质是多种药用植物的主要活性化合物，并且是天然化合物中规模最大种类最多的一类物质56，了解花榈木中萜类物质能够提高对花榈木的药用认知。植物萜类化合物主要由甲基赤藓糖磷酸酯(MEP)途径或甲羟戊酸(MVA)途径产生的二甲基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)生成7。萜类化合物分子骨架是基于异戊二烯或其异构体二甲基烯丙基焦磷酸 C5 单元构成的，根据骨架碳链长度的不同，主要分为半萜、单萜、二萜、三萜等几种类型的萜类化合物8。MEP 途径仅发生在质体中，MVA 途径却分布在细胞质、内质网和过氧化物酶体之间9。IPP 与 DMAPP 通过戊烯基转移酶的催化，缩合产生萜类化合物前体物质香叶酰二磷酸(GPP)、法呢基二磷酸(FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。其中 GPP 是合成单萜类化合物前体物质，GGPP 是合成二萜前体物质，FPP 则是合成倍半萜和三萜化合物的前体物质1011。随后通过萜类合成酶(TPS)和氧角鲨烯环化酶(OSCs)催化前体形成不同种萜类化合物，这 2 种酶的多样性使得萜类化合物的种类有很多1213。TPS 基因家族主要分为 7 个亚家族，分别命名为 TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-d、TPS-e/f、TPS-g和TPS-h。其中 TPS-a、TPS-b和 TPS-g 属于被子植物特有分支，这 3 个分支完全由专门的单萜、倍半萜或二萜生物合成基因组成，主要在植物生态相互作用中起作用。TPS-d 是裸子植物特异性亚家族，主要包含特异性代谢的裸子植物 TPSs14。TPS-c 和 TPS-e/f 是被子植物与裸子植物所共有的亚家族，TPS-c 分支成员只包含“DXDD”序类，是单功能柯巴基焦磷酸合酶(CPS)。与 TPS-c 类似，TPS-e/f 分支成员只包含“DDXXD”序类，是单功能的贝壳杉烯合成酶(KS)1516。植物 OSC 家族是一个超基因家族，主要包含达玛烯二醇合成酶(DS)17、-香树脂醇合成酶(-AS)18、香树脂醇合成酶(-AS)19和羽扇豆醇合成酶(LUS)20。近些年来对萜类的研究越来越广泛，但是豆科植物花榈木中的萜类化合物种类以及生物合成情况却未见报道。本研究利用代谢组学测序数据首次对花榈木中的萜类物质进行鉴定，并结合转录组测序结果，利用生物信息学方法分析花榈木中萜类的主要合成情况，分析相关基因在花榈木不同组织部位中的表达水平，为研究花榈木的药用活性物质以及花榈木中萜类的代谢调控途径奠定基础。1材料与方法1.1材料2021 年 4 月 23 日于华南农业大学(中国广州)苗圃中采集 3 年生花榈木新鲜的根、茎、树皮、老叶和幼叶 5 个组织部位样品，每样品重复 4 次，纯净水冲洗干净，立即在液氮中冷冻，并分成 2 个部分，一部分立即在80 下保存用于总 RNA 提取，另一部分在真空下冷冻干燥用于代谢物提取。1.2代谢组测定将采摘的根、茎、树皮、老叶和幼叶样品冻干磨粉后，精确称量各个样品粉末 0.5g，分别用 5第 40 卷第 5 期王佳琦等：基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析971mL 体积分数为 80%的 HPLC 级甲醇提取过夜，其中内标为 1molL1的白杨素。4 下 12000g 离心30min，取上清液装入样品瓶中，进行超高效液相色谱质谱(UHPLCQ-TOF/MS)分析。为了分离花榈木不同器官的代谢物，采用超高效液相色谱串联质谱法(QExactivePlus)进行测定。为保证平行试验每个样品平行 4 针。将 1L 样品进入 2.1mm100.0mm、1.9m 粒径的 HypersilGOLD 色谱柱，柱温 30，流速 0.3mLmin1。流动相 A 为体积分数 0.1%的 HPLC 级甲酸，流动相 B 是 HPLC 级乙腈。梯度洗脱：02.0min，010%流动相 B；2.010.0min，10%55%流动相 B；10.010.1min，55%80%流动相 B；10.113.0min，80%流动相 B；13.014.0min，80%95%流动相 B；14.018.0min，95%10%流动相 B。全扫描质谱和数据关联扫描(dd-MS2)的分辨率分别设置为 70000 和 17500，在正负离子模式下均使用加热的 ESI 源。在正负模式下，喷雾电压被设定为 3.5 和 3.2kV。毛细管温度被设定为 320，辅助气体加热器的温度被设定为 350。使用 CompoundDiscoverer3.2 对原始数据进行分析，然后根据综合分子量、质荷比(m/z)、保留时间(RT)和二级光谱，与代谢物数据库 mzCloud、mzVault 和 Chemspider 进行对比。1.3RNA 提取与文库构建总 RNA 由 RNAprepPureAssay 试剂盒提取，RNA 质量用 NanoPhotometer分光光度计测定。为了进行转录组测序，样品被送到百迈客生物技术公司。库的制备在 IlluminaHiseq2000 平台上进行测序，并产生成对的读长(reads)。首先，使用内部的 perl 脚本处理 fastq 原始数据，以去除含适配器的读数、含 ploy-N 的读数和低质量读数。经过 Trinity 软件组装获得一个非冗余的基因数据库(universalgene,unigene)，并进一步使用 HMMER软件与 Pfam 数据库比对，获得 unigene 的注释信息。1.4差异基因和基因功能分析以常用的基因表达水平估算方法中每千个碱基转录每百万映射读取的片断(fragmentsperkilobasemillion，FPKM)值进行表达量统计。使用错误发现率(falsediscoveryrate,FDR)0.01和|log2CF|2(CF为差异倍数,foldchange)的阈值，写入 R 中的 DESeq2 包，对花榈木不同部位样本进行差异基因表达分析21。使用 TBtools 构建差异显著基因(DEGs)的热图，京都基因和基因组百科全书(KEGG)对DEGs 的富集分析是使用 R 中的 ClusterProfiler 包进行的，加权基因共表达网络(WGCNA)是在 R 包WGCNA 的帮助下进行的，并使用相关 P 值建立统计学意义。2结果与分析2.1代谢组数据分析根据总离子流图所得到的化合物精确相对分子质量、出峰时间、二级碎片信息，与 mzCloud 和mzVault 数据库比对，共鉴定出 15 种萜类化合物(表 1)。为了分析花榈木不同组织部位中萜类化合物的分布情况，对 5 个部位的萜类化合物的相对含量进行了热图分析(图 1A)，发现不同部位的萜类相对含量差别较大。能明显看出幼叶、老叶与根中萜类相对含量较高，与之相反的是茎与皮中相对含量比较少，并发现甘草次酸(enoxolone)、齐墩果酸(oleanolicacid)、芳樟醇(linalool)和二氢丹参酮(dihydrotanshinone)等具有抗氧化、抗炎免疫调节、抗心血管疾病和镇定作用的萜类化合物22，表明萜类化合物可能是花榈木中主要的药用活性物质。2.2转录组数据分析为了筛选花榈木中与萜类生物合成相关的潜在基因，利用 RNA-seq 对花榈木 5 个部位的所有转录组进行分析。使用 IlluminaHiseq2000 平台进行测序，在去除低质量和短的读数后，总共获得了 1.92.4M 的高质量待分析数据，共获得 96302 个最长转录本，并与 NR、eggNOG、TrEMBL、Pfam、SwissProt、KEGG、COG、KOG 及 GO 等 9 个数据库比对，确定编码序类有 47809 条，并对其进行功能注释。计算出 FPKM 值，代表每个基因的表达水平。对花榈木 5 个部位的转录组进行差异基因分析，共得到13840 个差异显著基因(DEGs)。在差异基因分析中发现，与其他 3 个部位样本相比，叶的特异差异基因更多，茎中的特异差异基因最少(图 2)。2.3参与萜类生物合成相关基因表达分析根据其他物种萜类生物合成信息，花榈木萜类物质合成途径大致可分为萜类前体物质的合成、萜骨972浙江农林大学学报2023 年 10 月 20 日架的合成和后修饰 3 个阶段，其中萜类化合物的前体 GPP、FPP 和 GGPP 主要来自植物的 MVA 和MEP 途径。MVA 通路共鉴定到 8 个基因，包括 2 个乙酰辅酶 A 乙酰转移酶(AACT,c68943.graph_c2,c73242.graph_c0)、2 个羟甲基戊二酰辅酶 A 合成酶(HMGS,c57495.graph_c0,c70166.graph_c1)、1 个羟甲基戊二酰辅酶 A 还原酶(HMGR,c68938.graph_c1)、1 个甲羟戊酸激酶(MK,c70988.graph_c0)、1 个磷酸甲羟戊酸激酶(PMK,c71400.graph_c0)、1 个甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD,c76163.graph_c2)；MEP通路共鉴定到 10 个基因，包括 4 个 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS,c62607.graph_c0,c70494.graph_c2,c75298.graph_c5,c75577.graph_c0)、1 个 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶(DXR,c71705.graph_c2)，1 个 4-焦磷酸胞苷-2-甲基-D-赤藓醇激酶(CMK,c73279.graph_c4)、1 个 2-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合酶(MDS,c62387.graph_c0)、1 个羟甲基丁烯基-4-焦磷酸合酶(HDS,c56719.graph_c0)、2 个羟甲基丁烯基-4-磷酸还原酶(HDR,c29394.graph_c0,c70095.graph_c0)。为了更直观地比较萜类生物合成途径主要基因在不同组织中的表达情况，采用 FPKM 值对花榈木不同组织部位的合成途径基因表达量作图。发现参表1花榈木中萜类化合物质谱信息Table1Massspectralinformationofterpenoidsin O.henryi名称分子式质荷比保留时间/min峰面积根茎老叶皮幼叶齐墩果酸C30H48O3456.3608713.411264762138689614439205545014461185143二氢丹参酮C18H14O3278.093907.1252934692375644531107725283941587275945119942WalleminoneC15H24O3252.1722112.87727142310259254853813979390127128102273216甘草次酸1C30H46O4470.338679.0111078252110749752197454772601573210142324熊果酸C30H48O3456.3599113.63140193042125843931876353221941192055746京尼平苷酸C16H22O10374.121601.93216460987112195727491296979766110552007928甘草次酸2C30H46O4470.3386113.353668591912850863458999029178222213863劳丹醇酸C20H36O3324.2668412.8571810075277243742716036084838629568芳樟醇C10H18O154.1354912.167242364729920831182137439983613100226脱落酸C15H20O4264.136428.3041324567878231961271011305169624808273积雪草苷C48H78O19958.511418.8444835086224491311166594651693269899393498LagochilinC20H36O5356.2554912.385103226851123683784466068027515252木香烃内酯C15H20O2232.146149.727600726697407604654641435364973618鸡蛋花素C15H14O6290.078919.824117970991879441746582014830113618679PrespataneC15H24204.1874312.689159172621479579290771043596638310627三萜齐墩果酸ABTPSOSC相对表达量1.000.800.600.400.200甘草次酸 1熊果酸甘草次酸 2Walleminone脱落酸Prespatane二氢丹参酮劳丹醇酸Lagochilin芳樟醇京尼平苷酸积雪草苷木香烃内酯鸡蛋花素c63712.graph_c0c72335.graph_c1c70917.graph_c0c70182.graph_c0c64128.graph_c1c73567.graph_clc59217.graph_c1c74748.graph_c1c59217.graph_c0c76783.graph_c0c59217.graph_c2c76636.graph_c0c65961.graph_c0c71944.graph_c0倍半萜二萜单萜根茎老叶皮幼叶萜烯苷A.萜类化合物积累情况热图。B.萜类化合物合成相关基因TPS、OSC的FPKM热图。使用“scale”函数将数据按行归一化。用深红色和深蓝色表示代谢物的积累水平和基因的相对表达从高到低。图1花榈木不同组织中萜类化合物积累和 TPS、OSC 基因表达量的热图Figure1HeatmapofterpenoidaccumulationandTPSandOSCgeneexpressionindifferenttissuesofO.henryi第 40 卷第 5 期王佳琦等：基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析973与 MVA 途径的基因在幼叶中表达量普遍较高，MEP 途径相关基因在老叶中表达量较高，与萜类相对含量比较对应，可能与叶中的萜类化合物的积累有关(图 3)。还检测出 2 个异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI,c31804.graph_c0,c89450.graph_c0)，它们在叶中的表达量并不高，可能这些基因与萜类化合物相对含量并不密切相关。MVA 和 MEP 这 2 个途径后生成萜类化合物的前体，还需要 3 个比较重要的酶参与：香叶基二磷酸合成酶(GPPS)、法尼基二磷酸合成酶(FPPS)和香叶基香叶基焦磷酸合成酶(GGPPS)。在花榈木的转录组数据中共检测到 2 个 FPPS 基因(c86328.graph_c0,c75342.graph_c0)，2 个 GPPS 基因(c36059.graph_c0,c76294.graph_c0)，5 个 GGPPS 基因(c55157.graph_c0,c71336.graph_c0,c65845.graph_c2,c63610.graph_c0,c69470.graph_c0)，表达情况如图 3 所示。2 个 GGPPS 基因 c55157.graph_c0 和 c69470.graph_c0 在幼叶中表达量比较高，多数二萜在幼叶中的积累量也是最多的(图 1)，可能这 2 个基因是花榈木二萜物质合成的关键酶基因。TPSs 是催化合成不同种单帖、二萜和倍半萜类化合物的酶，OSCs 可以催化合成三萜类化合物，在花榈木转录组中还鉴定出 6 个 TPSs 和 8 个 OSCs 基因，其表达谱如图 1B 所示。这些基因的表达在花榈木中出现了组织差异性，每个组织中都有其表达量高的基因，其中与 MVA 和 MEP 途径基因表达情况相似：在幼叶和老叶中表达量高的基因占比较大。这些 TPSs 和 OSCs 的组织差异表达可能是导致花榈木中萜类多样性和具有不同积累模式的主要原因。为了进一步了解研究中 6 个 TPSs 的假设功能，根据其蛋白序列，将其与已经在拟南芥 Arabidopsisthaliana、葡萄 Vitis vinifera 和番茄 Lycopersicon esculentum 等物种中确定的 TPS 进行系统发育分析(图 4)。发现与之前报道相似，花榈木中的 TPSs 主要分布在 TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-e 和 TPS-g 亚家族。c70917.graph_c0 和 c72335.graph_c1 被 分 类 到 TPS-b 中，可 能 这 2 个 基 因 在 功 能 上 比 较 类 似；c64128.graph_c1 被分到 TPS-e 亚家族，说明 c64128.graph_c1 可能在花榈木中行使着 KS 酶功能；c73567.graph_c1 则被分到 TPS-c 亚家族中，表明它可能有着 CPS 酶的功能。为了进一步推测花榈木OSCs 的功能，对每个基因再次进行了美国国家生物技术信息中心数据库的比对注释，发现除c71944.graph_c0 基因是编码 LUC 的基因外，其他 7 个都是编码-AS 的基因。2.4萜类生物合成相关基因共表达网络分析与鉴定为进一步分析萜类化合物合成相关基因，利用 WGCNA 对确定的全部 DEGs 进行了共表达分析。这些 DEGs 被聚类为 10 个分支，每个不同颜色标记的模块代表了 1 个分支(图 5)。模块是由具有相似表达模式的基因簇组成的，MEturquoise 模块包含的基因数量最多(3761 个基因)，而 MEmagenta 模块的基因数量最少(104 个基因)。其中有 7 个模块与一些特定的萜类化合物表现出明显的正相关(相关系数0.80)(图 5)。除了 c63712.graph_c0 基因外，共有 5 个 TPSs和 8 个 OSCs 基因表达差异明显，推测这AG1G0G7G01585481 1766402 4145685001 0018434001 7542 5137289282 7665061 3471 0201 1933281 0922594226124633771 2846763449612793964096073985771 7471 2461 4563642 7693784262 0761 2656272841 0864234852 0265805613 6211 404332502893902130244177512121521 9141 1221 1083 072BCDEG0 根比茎的差异基因G1 根比皮的差异基因G2 根比老叶的差异基因G3 老叶比茎的差异基因G4 老叶比皮的差异基因G5 老叶比幼叶的差异基因G6 皮比茎的差异基因G7 幼叶比根的差异基因G8 幼叶比茎的差异基因G9 幼叶比皮的差异基因G2G3G3G4G4G6G7G8G9G9G1G5G5G6G8 G2不同颜色代表不同组织间的差异基因，重叠区域代表不同比较间具有共同调控模式的差异基因。图2花榈木 5 个组织中的差异基因韦恩图Figure2VenndiagramofdifferentialgenesinfiveorgansofO.henryi974浙江农林大学学报2023 年 10 月 20 日13 个差异表达的 TPSs 和 OSCs 可能是导致花榈木 5 个组织部位萜类化合物组成差异的重要候选基因。其中，MEturquoise 模块中共有 2 个 TPSs 和 4 个 OSCs 基因；MEblue 模块有 2 个 TPSs 和 3 个 OSCs 基因。MEturquoise 和 MEbrown 与三萜类化合物的相关性较强(相关性系数0.90)，而 MEblue、MEblack和 MEpink 模块与倍半萜化合物有相关性，其中 MEblue 模块也与二萜和单萜具有相关性。二氢丹参酮这个二萜化合物与 MEyellow 和 MEgrey2 个模块都具有正相关性。这些正相关的模块表明：这些基因在调节花榈木萜类化合物的生物合成中具有潜在的作用。上述模块的分析结果表明：MEturquoise 模块富集了最多的 TPSs 和 OSCs，并且该模块与乌苏酸和甘草次酸呈正相关，相关性分别为 0.95 和 0.93(图 5)；MEblue 也富集到了较多的 TPSs 和 OSCs 基因，并且与一些倍半萜和二萜成正相关，所以对这 2 个模块开展进一步的分析。在 MEturquoise 模块中发现：基因主要富集在次生代谢和信号转导通路，共检测到 105 个转录因子可能参与 TPSs 的调控(图 6A和图 6B)：bHLH、WRKY 和 MYB 家族数量最多，分别有 10、9 和 8 个，此外 C2H2、mTERF、FAR1 和 bZIP 家族数量也达到了 67 个。通过对 MEblue 模块基因进行 KEGG 分析，发现基因主要富集在 DNA 复制、同源重组和修复通路，并检测到 152 个转录因子，数量最多的是 bHLH 和 MYB 家族转录因子(图 7A 和图 7B)。为了进一步研究 MEturquoise 模块中转录因子与相应 TPSs 和 OSCs 基因的关使用“scale”函数将数据按行归一化。深红色和深蓝色表示基因的相对表达量从高到低。Mevalonic acid(MVA)MKMVAPPMKMVAPPMVDIPPIPPIc68943.graph_c2c73242.graph_c0c57495.graph_c0c70166.graph_c1c68938.graph_c1c70988.graph_c0c71400.graph_c0c76163.graph_c2Pyruvate+G3PDXSDXPDXRMEPMCTCDP-MECMKCDP-ME2PMDSMEcPPHDSHMBPPDMAPPHDRc62607.graph_c0c70494.graph_c2c75298.graph_c5c75577.graph_c0c71705.graph_c2c73279.graph_c4c62387.graph_c0c56719.graph_c0c29394.graph_c0c70095.graph_c0GPPGGPPFPPGGPPS二萜生物合成倍半萜和三萜生物合成单萜生物合成c31804.graph_c0c89450.graph_c0c36059.graph_c0c76294.graph_c1c55157.graph_c0c71336.graph_c0c65845.graph_c2c63610.graph_c0c69470.graph_c0GPPSFPPS1.00.80.60.40.20根 茎 老叶皮 幼叶相对表达量Acetyl-CoAAACTHMGSHMGRAcAc-CoAHMG-CoAc86328.graph_c0c75342.graph_c0图3花榈木萜类骨架生物合成途径Figure3TerpeneskeletonbiosynthesispathwayofO.henryi第 40 卷第 5 期王佳琦等：基于代谢与转录水平的花榈木萜类合成候选基因分析975系，构建了一个共表达的网络图，选择了与 MEturquoise 模块中 TPSs 和 OSCs 基因相关性较强的 34 个转录因子(边缘权重0.4)，包括 MYB、WRKY、bHLH、C3H、DBB、HB-HD-ZIP 和一些其他家族的转录因子(图 8)。最终利用 Cytoscape 插件 CytoHubba 的 Degree 算法分析识别到了 6 个转录因子，即 HB-HD-ZIP(c64527.graph_c1)、GRF(c76195.graph_c0)、DBB(c66970.graph_c2)、DBB(c75593.graph_c0)、HB-HD-ZIP(c63393.graph_c0)和 C3H(c70385.graph_c1)。这些转录因子在花榈木中可能与萜类化合物的合成基因有着密切的关系。3讨论目前，天然植物次生代谢物已被广泛应用于抗癌药和治疗感染性疾病的药物23。根据合成起始分子不同，植物次生代谢物可以分为生物碱、萜类、苯丙烷类三大类化合物24。萜类一直是天然产物中重要的药用化合物，具有多种药理活性，如紫杉醇可以抗肿瘤，青蒿素属于抗疟疾特效药物，雷公藤内酯能够抗炎等2526，但药用木本植物花榈木中的萜类还没有过报道。本研究利用代谢组学技术分析了花榈木中萜类物质在不同部位的积累情况，共检测出比较确定的 15 种萜类化合物，并发现了甘草次酸、齐墩果、芳樟醇和二氢丹参酮等具有抗氧化、抗炎免疫调节和镇定等药用活性的萜类化合物27。通过对花榈木不同组织部位的萜类代谢物热图分析发现，萜类化合物积累具有明显组织特异性，主要积累在幼叶c70182.graph c0VvTPS01VvTPS02AtTPS21AtTPS29AtTPS18AtTPS19AtTPS17AtTPS22AtTPS25AtTPS30AtTPS20AtTPS6AtTPS11AtTPS12AtTPS13AtTPS1AtTPS5AtTPS28AtTPS16AtTPS8AtTPS15AtTPS26AtTPS7AtTPS9AtTPS4LjTPS7c64128.graph c1AtEKSCfTPS14IrKSL5VacTPS4LjTPS5MvEKSIrKSL3IrKSl6OmTPS5VacTPS2VacTPS6LjTPS6AtTPS27AtTPS23AtTPS24AtTPS10AtTPS3AtTPS2c70917.graph c0c72335.graph c1VvTPS63VvTPS58c63712.graph c0AtTPS14SsLPPSOmTPS1MvCPS3LjTPS4IrCPS1CfTPS1MvCPS1LjTPS3LlTPS1VacTPS1MsTPS1VacTPS3LjTPS2 partialVacTPS5IrCPS4LjTPS1c73567.graph c1AtCPSPpCPS/KSSsSSOmTPS4OmTPS3LlTPS4IrCPS2CfTPS16CfTPS2以鉴定的差异表达 TPS 基因的蛋白序列和已报道的 TPS 基因的蛋白序列构建系统发育树。TPS-a、TPS-b、TPS-c、TPS-g、TPS-e 和 TPS-f 家族被浅绿色、蓝色、红色、紫色、黄色和灰色覆盖。TPS-aTPS-eTPS-bTPS-gTPS-cTPS-f图4花榈木 TPS 基因家族分析Figure4AnalysisofTPSgenefamilyofO.henryi976浙江农林大学学报2023 年 10 月 20 日和老叶中，其他部位中积累较少，可能为了保护叶片免遭危害28。今后在提取和分析花榈木药用物质时应该更多利用它的叶片。近些年来，RNA-Seq高通量测序技术被越来越多地应用于药用植物基因信息解读、新基因发掘与基因功能研究中。人们已对药用植物连翘Forsythia suspense、银杏Ginkgo biloba、款冬Tussilago farfara 等进行了转录组的研究，获得了大量有用的基因信息2930。这使得阐明药用植物中活性物质的合成及积累规律成为可能，为增加次生代谢物积累、改善药用植物品质提供更多途径。本研究采用 RNA-Seq 对花榈木 5 个不同组织部位进行无参转录组分析，共获得 96302 个，在经过与数据库比对后共注释了47809 条转录本。利用 FPKM 值对基因表达量进行分析比较，共获得显著差异基因 13840 个。韦恩图分析发现大量基因表达具有组织特异性，并通过注释信息在差异显著的基因中共鉴定出 49 个与萜类化合物生物合成相关的基因，包括 29 个萜类骨架生物合成途径的酶基因，6 个单帖、倍半萜和二萜生物合成酶基因，8 个三萜生物合成酶基因以及 6 个可能参与萜类生物合成调控的转录因子，对花榈木的萜类合成有了初步的认识，为后续研究提供了信息资源。先前的研究表明：MVA 途径在许多植物的三萜生物合成中起主导作用，如人参 Panax ginseng、三七 P.notoginseng 和茶树 Camellia sinensis 等植物3132，MEP 途径通常有助于单萜类化合物和二萜类化合物的生物合成33。但是本研究利用热图对萜类生物合成基因的表达分析发现：MVA 途径相关酶基因大024MEturquoiseMEbrownMEyellowMEmagentaMEr