清蛋溶菌酶的研究--毕业设计.doc

太原工业学院毕业论文1 前言1.1 溶菌酶溶菌酶(Lysozyme, EC) 又称细胞壁溶解酶（Muramidase）是一种细胞非特异性免疫蛋白，是由英国细菌学家弗莱明 (Fleming)在 1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。广泛存在于生物体的体液和组织液中，包括植物汁液、动物分泌液、人的眼泪、唾液、乳汁、禽蛋及部分细菌中。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。它是一种作用于微生物细胞壁的胞壁质水解酶，根据作用的微生物的种类不同，可分为细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。根据作用位点不同，细菌细胞壁溶菌酶可分为：水解肽聚糖主链的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡糖胺之间 -1, 4 糖苷键的胞壁质酶作用于肽聚糖侧链酰胺键的酰胺酶，和作用于肽链尾端的内肽酶，具体见图 1-1。根据来源不同可分为：T4 噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶、微生物溶菌酶和动物溶菌酶，其中动物溶菌酶又细分为：C 型(chicken-lysozyme type)、G 型(goose-type)和 I 型(invertebrate-type)溶菌酶。人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。本文中选取来源于鸡蛋清中的溶菌酶即 C 型溶菌酶。图 1-1 胞壁质水解酶的类型及其水解位点Fig 1-1 Types of Murein hydrolases and their catalytic sites on peptide.1.1.1鸡蛋清溶菌酶的物理化学性质鸡蛋清中约含有0.3%的溶菌酶，可分解溶壁小球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌基本上不起作用。当有EDTA存在时，某些革兰氏阴性菌也可以被该酶分解。鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。此酶为白色、无臭结晶粉末 ,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的 3.4%3.5%，由 18 种 129 个氨基酸残基组成，分子量为 14.4 kDa，等电点为 11.1，最适温度为 50 ，最适 pH 值为 67，其化学性质非常稳定，在 pH1.211.3 范围内剧烈变化时，结构仍稳定不变。遇热也比较稳定，在 pH47、100 处理 1 min 后活性基本不变，是一种稳定的碱性蛋白质，但在碱性条件下热稳定性较差。1.1.2蛋清溶菌酶的结构和功能蛋清溶菌酶的构象比较复杂，-螺旋仅占 25%，同时存在着伸展的 -片层结构，其分子是由 129 个氨基酸残基排列构成的单一肽链，溶菌酶的分子结构见图 1-2。图 1-2 溶菌酶的分子结构示意图Figure 1-2 Molecule structure of Lysozyme. 它具有 4 对二硫键(6Cys127Cys, 30Cys115Cys, 64Cys80Cys 和 76Cys94Cys)，这几对二硫键在经变性剂或热处理后均能保持稳定，但是很容易被还原剂破坏溶菌酶的活性位点为 35 位的谷氨酸(Glu35)和 52 位的天冬氨酸(Asp52)。一般认为蛋清溶菌酶具有胞壁质酶活性，即通过活性中心 Glu35 和 Asp52 的作用，催化水解 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 -1, 4 糖苷键。Glu35 作为糖苷键的质子供体，剪切底物的 C-O-C 键，Asp52 处在一个明显的极性环境中，参与生成糖基酶中间体，然后与水分子发生反应，水解生成产物。溶菌酶通过此胞壁质酶活性，破坏细胞壁的肽聚糖，导致细菌细胞壁的逐渐瓦解，内容物外流，从而最终导致菌体死亡。1.2溶菌酶的应用1.2.1 溶菌酶在食品工业上的应用溶菌酶用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜溶菌酶可作为鱼丸等水产类熟制品和香肠、红肠等肉类熟制品的防腐剂。只要将一定浓度（通常为0.05%）的溶菌酶溶液喷洒在水产品或肉类上，就可起到防腐、保鲜的作用。用于新鲜海产品和水产品的保鲜一些新鲜海产品和水产品在0.05%的溶菌酶和3%的食盐溶液中浸渍5min后，沥去水分，进行常温或冷藏贮存，均可延长其贮存时间。在糕点和饮料上的应用在糕点中加入溶菌酶，可防止微生物的繁殖，特别是含奶油的糕点容易腐败，在其中加入溶菌酶也可起到一定的防腐作用。在pH值6.07.5的饮料和果汁中加入一定量的溶菌酶具有较好的防腐作用。在保健食品添加剂上的应用溶菌酶是高盐基蛋白质，具有一定的保健作用；有抗感染及抗生素效力增强作用，有血液凝固和止血作用，有组织再生和形成促进作用等。1.2.2 溶菌酶在生物工程上的应用溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理革兰氏阳性细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取。只要把对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段，就可以得到无细胞提取液，进一步精制，可以得到所需菌体物质。因此，生物工业的发展对溶菌酶制剂的需求量将与日俱增。1.2.3 溶菌酶在发酵工业上的应用酵母膏是发酵工业中用量最多的一类培养基成分。 它的制备目前大多是采用酵母自溶法或酵解酵母的办法制成的。如果改用溶菌酶制备酵母膏，则不仅可以提高浸膏量的收率，还可以大大缩短酵母膏的制备时间。此外，溶菌酶还可用于菌体内含物质的提取。将对溶菌酶敏感的菌体悬液在适当缓冲液中用溶菌酶处理，再结合使用超声波、冷冻离心等手段，就可以得到无细胞提取液，进一步精制，可得所需的菌体物质。1.2.4 溶菌酶在医学上的应用血清和尿液中的溶菌酶对一些疾病诊断是有帮助的，或者可以在疾病过程中作为一个标志性的物质。血清溶菌酶水平对白血病的诊断起到辅助性作用。在尿中，正常情况下只发现了少量溶菌酶，因此，测量尿中溶菌酶，对患有肾病的病人，特别是那些与肾病有关的肾小管功能障碍疾病的评价是有帮助的。此外，尿中的溶菌酶含量的变化有助于移植排斥、烧伤严重程度的判断，因为烧伤病人分泌的溶菌酶明显增多。角膜结膜炎干燥引起的泪腺退化不仅导致眼泪的减少，而且也降低了眼泪中溶菌酶的浓度。脑脊髓液中溶菌酶的增加被称为是炎症和中枢神经系统疾病的敏感信号。1.2.5 溶菌酶在科学研究中的应用由于溶菌酶具有能够专一性地分解细胞壁的能力, 除了在实际生产中的应用外, 溶菌酶更广泛地应用于科学研究中。 如利用溶菌酶专一性地水解细胞壁的特点, 了解微生物细胞壁的构造，分解细胞壁后制备原生质体，从而用于微生物育种以及微生物分类等学术研究的领域。在环境污染日趋严重的当今世界，在倡导绿色食品的今天，溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。另外，由于人溶菌酶在参与机体的防御机制，在抗感染、抗肿瘤和免疫调节等方面的作用具有其他来源的溶菌酶无法比拟的优势，具有可观潜在的临床应用价值。因此，有关人溶菌酶的应用研究以及如何实现工业化生产已引起广泛重视。采用当前的基因工程技术，利用原核或真核生物作为寄主细胞，从而为实现大规模生产人溶菌酶提供了可行性途径，这必将把溶菌酶的研究利用推入一个崭新的阶段。1.3 溶菌酶与细菌相互作用的研究进展1.3.1细菌细胞壁结构细胞壁是存在于原核细胞、真菌藻类、植物细胞外层的一道屏障。细胞壁可抵抗渗透压，保持细胞的完整性。根据革兰氏染色反应，可将细菌分为两类：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。它们的细胞壁组成不同。革兰氏阳性菌细胞壁仅由肽聚糖层构成，肽聚糖的层数较多，厚度约为 2030 nm，且交联度高，并含有少量的磷壁酸，所以常用溶菌酶水解革兰氏阳性菌的细胞壁，从而获得原生质体。革兰氏阴性菌细胞壁分为内外两层(图 1-3)，即外层脂多糖层和内层肽聚糖层。图 1-3 革兰氏阴性菌细胞壁Fig.1-3 The cell wall of gram-negative bacteria大肠杆菌(Escherichia coli)是一种典型的革兰氏阴性菌，脂多糖分布在它的细胞壁最外侧。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁外侧特有的结构和功能分子，由三部分组成，伸展在最外面的是由重复性糖单元构成的亲水性的 O-抗原(部分菌没有)，中间为核心多糖，最内侧为疏水性的类脂 A。脂多糖和磷脂单分子层构成了细胞的外膜。在细胞外膜之内是一层很薄的肽聚糖层，由于肽聚糖处于细胞壁的内层，溶菌酶必须越过细胞外膜才能作用肽聚糖层，所以溶菌酶对革兰氏阴性菌作用效果不是很明显。1.3.2 溶菌酶对细菌的抗菌作用溶菌酶一方面具有胞壁质酶活性，即能水解肽聚糖中的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 -1, 4 糖苷键，引起细胞裂解。另一方面，近年来的研究发现，溶菌酶具有阳离子抗菌肽活性，它独立于胞壁质酶活性而存在，主要与溶菌酶的结构，电荷分布，表面疏水性有关。Ibrahim 在 2001 年研究发现了鸡蛋清溶菌酶(HEWL)的抗菌活性独立于它的胞壁质酶性质的遗传学证据。通过将蛋清溶菌酶的关键催化残基 Asp52定点突变成 Ser，构建胞壁质酶性质失活的溶菌酶 D52S-Lz，来说明溶菌酶的胞壁质酶性质对革兰氏阳性菌的抗菌作用。结果显示，突变溶菌酶 D52S-Lz 与野生型的溶菌酶并没有结构上的差异，它失去了溶菌酶的胞壁质酶活性，但抗菌活性与野生型的相同。随后，Ibrahim 通过水解溶菌酶得到一种具有抗菌活性的短肽，它存在于蛋清溶菌酶中的helix-loop-helix (HLH)基序结构区域中，此区域位于活性位点裂缝上游，这进一步说明溶菌酶还具有抗菌肽活性，此抗菌肽活性与它的结构有关。1.3.3 细菌对溶菌酶的抵抗作用虽然大多数的革兰氏阳性菌对溶菌酶比较敏感，但是一些致病菌的特定菌株，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC35556、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)Scott A却对溶菌酶产生了抗性，而有些革兰氏阴性菌反而对溶菌酶敏感，如Serratiamarcescens ATCC 8100。图 1-4 蛋清溶菌酶和葡萄球菌肽聚糖联结位点相互作用假定Fig. 1-4 Proposed interaction of the binding groove of the egg-white lysozyme and staphylococcal peptidoglycan近年来的研究发现，细菌抵抗溶菌酶作用的机制大体可分为两类：一类是细菌细胞壁自身成分的修饰；另一类是细胞壁中存在溶菌酶抑制剂。细菌的成分修饰主要体现在一些革兰氏阳性菌中的肽聚糖修饰，主要包括O-乙酰化修饰和磷壁酸修饰。O-乙酰化修饰通过O-乙酰转移酶A对N-乙酰胞壁酸的C-6残基进行O-乙酰化修饰，从而对溶菌酶活性位点形成空间位阻。磷壁酸修饰通过dlt操纵子操纵形成的产物对细胞壁的磷壁酸进行D-丙氨酸酯化和N-乙酰葡糖胺残基修饰，修饰后的磷壁酸与胞壁酸的C-6残基相连。如图1-4示。溶菌酶抑制剂主要存在于部分革兰氏阴性菌中，它们能与溶菌酶结合而对溶菌酶的水解活性有抑制作用。2001 年，Monchois 首次发现 E. coli 中存在的 lvy 基因编码产物对C-型溶菌酶有很强的抑制作用，接着人们对它的功能进行了一定的研究。随后在 Shigella flexneri，Yersinia enterocolitica 和 Pseudomonas aeruginosa中也发现了Ivy 编码的溶菌酶抑制蛋白。Callewaert 在 2008 年通过亲和层析处理 SalmonellaTyphimurium 的周质萃取物，分离得到一种溶菌酶抑制剂，称为周质空间 C-型溶菌酶抑制剂 PliC (periplasmic lysozyme inhibitor of c-type lysozyme)，后来在 E. coli 和 P.aeruginosa 中又发现了一种针对 C-型溶菌酶的膜结合溶菌酶抑制剂 Mlic (membranebound lysozyme inhibitor of c-type lysozyme)。MliC 和 PliC 属于同一族，这些抑制剂与lvy 基因不相关，但是都显示出有效的溶菌酶抑制剂活性。1.4立题背景与意义目前饲料与食品安全问题是全球的饲料行业和养殖企业都面临的挑战。抗生素的大量滥用以及药物残留、农药的污染等一系列问题令人寝食难安。抗生素的使用长久以来以改善动物的营养状况和抗菌促生长为目的，从而对能有效抗菌，促生长、可应用、无残留、无污染的饲用抗生素的替代物的研究备受关注。溶菌酶作为动物自身的一种非特异性免疫因子，以其广谱高效的杀菌、无残留、无污染的特性吸引众多研究者的视线。随着产品市场的竞争的日趋激烈，发展绿色、安全、优质、高效的畜产品将是畜牧业发展的必然趋势，绿色的畜产品的生产备受社会的关注和人们的青睐。鉴于饲用抗生素对人类健康与环境造成的危害，许多的国家特别是经济发达的国家已经或准备禁止饲用抗生素的使用。抗生素的替代问题已迫在眉睫，溶菌酶无疑成为首选。目前实际应用的也已商品化的是鸡蛋清溶菌酶。采用蛋厂鸡蛋壳中残留的蛋清为原料生产溶菌酶为白色、无臭结晶粉末，味甜。近年来，人们正研究用微生物发酵法生产溶菌酶，同时还采用酶修饰法,先后合成了溶菌酶-环糊精和溶菌酶-半乳甘露聚糖，经过修饰后的溶菌酶不仅抗菌活性稳定，而且具有良好的乳化性能。此外，由于溶菌酶抗菌谱较窄，只对G+细菌起作用，为了加强其溶菌作用，人们常与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐等物质配合使用，以增强对G-细菌的溶菌作用。 蛋清溶菌酶来源于鸡蛋清，无毒、无害、安全性很高，具有一定的溶菌作用，因此可用作食品防腐剂。添加溶菌酶可以杀菌防腐，由于不用加热，避免了高温杀菌对食品风味的破坏作用，尤其对热敏感的物质更具有重要意义。虽然当前很多学者已对超高温杀菌、高压杀菌、辐射杀菌等新兴杀菌方法进行了大量研究，但都不是最理想的杀菌方法，采用冷杀菌无需加热，因而不仅保持了部分食品原有的风味，而且保证了食品的安全性和贮藏性。鉴于溶菌酶对人体安全、无毒、无害，且具有一定的保健作用，因而加入食品中进行防腐保鲜不仅起到防腐作用，而且强化了营养价值。溶菌酶的研究和应用尚处于起步阶段，开发新的溶菌酶资源，降低生产成本，才能促使溶菌酶在实践中的应用。可喜的是，酶工程的发展进步，使人类可以合成酶，开发合成杀菌谱广、成本低、安全性高的溶菌酶。可以预见，溶菌酶在21世纪将发挥越来越大的作用。2 阳离子交换树脂法提取蛋清溶菌酶关于溶菌酶的分离和纯化的方法主要有结晶法、离子交换法和色谱法等。亲和色谱法分离溶菌酶也是一种有效的手段，由于亲和色谱法分离具有较高的选择性，可以从蛋清中分离出溶菌酶。但由于亲和柱造价高，制作困难等缺点使其应用受到限制。离子交换法是制备高纯度溶菌酶最常用的方法，由于该方法不需要加热以及改变pH值，溶菌酶不易变性失活，制得溶曲酶活性较高。此外离子交换法还具有简便、高效、成本低、可以自动化连续操作的优点，提纯后的蛋清不受破坏，可以进行再利用。离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间的离子交换而进行的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质，可采用阳离子交换树脂。根据弱酸性阳离子交换树脂亲和力顺序，相同条件下弱酸性阳离子交换树脂对H+的亲和力比Na+大，目前国内外可用离子交换树脂主要有732型弱酸性阳离子交换树脂，D903、D201人孔离子交换树脂，CM-纤维素、磷酸纤维素、Duolite C-464树脂等。蛋清中溶菌酶含量一定，当用氢型树脂和钠型树脂分别进行交换时，由丁树脂对H+的亲和力比Na+大而使得溶菌酶与Na型树脂交换更彻底，故本实验采用Na型树脂。溶菌酶的纯度、收率和活性除了受到离子交换树脂类型的影响外，洗脱液的类型和浓度、蛋清的pH值、提纯温度、均质条件、稀释倍数等也对其影响很大。2.1实验材料2.1.1 材料与药品表2.1.1材料与药品实验材料来源氯化钠盐酸氢氧化钠硫酸铵丙酮新鲜鸡蛋D113离子交换树脂NaClHClNaOH(NH4)2SO4分析纯北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京益利精细化学品有限公司北京益利精细化学品有限公司市场南开大学化工厂2.1.2 主要实验仪器表2.1.2主要实验仪器介绍实验器材型号出产地恒温水浴锅磁力搅拌器恒温干燥箱离心机电子天平电冰箱紫外可见分光光度HHS216型85-2DL102J2-21AY220型752N型上海跃进医疗器械厂常州国华电器有限公司天津市实验仪器厂美国 BECKMAN 公司日本岛津制作所海尔公司上海精密科学仪器有限公司2.2 实验方法2.2.1离子交换树脂的预处理称取 100g 离子交换树脂，用 1mol/L 盐酸 1000ml 浸泡 12 小时，倾出上清液，用清水冲洗至 pH 值为 6 左右，再用 80热水 800ml 浸泡 4 小时，过滤，用 1 mol/L氢氧化钠溶液浸泡 12 小时，倾出上清液，用清水冲洗至 pH 值为 9 左右。用水浸泡备用。2.2.2 离子交换法提取蛋清溶菌酶(1) 预处理：将鸡蛋两边敲洞，取新鲜蛋清，用 3 层纱布过滤，除去杂物。用磁力搅拌器搅拌 10 分钟，均质，速度以不引起蛋清起泡为宜。(2) 吸附：将蛋清冰浴冷却至 5左右，搅拌下加入 25%已处理好的 D113离子交换树脂，使树脂全部悬浮在蛋清中。保温搅拌吸附 6 小时。然后静置分层，弃去上层清液，下层树脂用清水反复洗三次，以除去杂蛋白，最后滤干树脂。(3) 洗脱：在上述树脂中加入等体积浓度为 10%的硫酸铵溶液，搅拌洗脱60 分钟，滤出洗脱液，重复洗脱树脂 3 次，合并滤出的洗脱液。(4) 沉淀：按洗脱液体积加入固体硫酸铵粉末使其最终浓度达到 32%，搅拌使其完全溶解，在冰箱中放置过夜，弃去上清液，用离心机分出沉淀物。(5) 干燥：将沉淀的盐析物倒入丙酮中，不断搅拌，放置 2 小时左右，滤除丙酮，放入恒温干燥箱 40下干燥，得成品，称重，用比浊法测定溶菌酶的比酶活。(6) 丙酮沉淀法：将上述（3）所得洗脱液，用冰浴降温到 4,搅拌下将预冷-10的 1.5倍体积的丙酮逐滴加入，放置 10 分钟，然后离心，得沉淀，用丙酮洗涤，真空干燥，测酶活。一般流程为: 鲜蛋预处理搅拌吸附洗脱等电点沉淀干燥丙酮沉淀真空成品。2.3测定指标由中国农大余海芬所绘制的标准曲线为参考，其试验采用的方法为：准确称取溶菌酶标样0.50009，溶解于10%(w/w)的硫酸铵溶液中，配制成浓度为 0.5mg/mL的溶菌酶标准溶液。准确吸取溶菌酶标准溶液 1.0mL、 2.0mL、3.0mL、 4.0mL、 5.0mL，分别置于试管中，然后加入10%的硫酸铵溶液达至10mL，摇匀后静置 5min。用 1cm比色皿，以10%的硫酸铵溶液为参比溶液，在紫外分光光度计上于248- 340nm范围内扫描。在最大吸收波长下，依次测定各标准溶液的吸光度，以吸光度(A)对溶菌酶浓度(c)绘制标准曲线。图2.3 溶菌酶的吸收光谱注:此图摘自参考文献(余海芬，2010)。图2.4溶菌酶溶液的标准曲线注:此图摘自参考文献(余海芬，2010)由实验结果可知，溶菌酶的最大吸收波长位于281nm处。吸光度A与洗脱液中溶菌酶浓度c的为线性回归方程。根据这一变化规律判断实验各因素对实验的影响，从而找出最适条件。3 蛋清溶菌酶的抑菌活性测定溶菌酶（Lysozyme, LZM）又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，可以水解细菌细胞壁肽聚糖的-1,4糖苷键，导致细菌自容死亡，并且耐酸、耐热性强，在含盐、糖等的溶液中稳定存在，故而非常适合于各种食品的防腐。不同溶菌酶的抑菌谱不同，一般地革兰氏阳性菌的抑菌效果最为显著，目前，研究最为透彻、应用最广泛的溶菌酶是从蛋清中提取得到的蛋清溶菌酶。蛋清溶菌酶对大多数革兰氏阳性菌都有作用，对革兰氏阴性菌基本没有作用；对白色念珠菌有作用，但是对黑曲霉没有作用。蛋清溶菌酶抗菌谱还不广泛，单独能分解溶壁微球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，但对革兰氏阴性菌的抑制作用并不明显。由于每一种类型的溶菌酶都有其最适的反应条件，而且作用特异性强，只对特定的微生物有充分的溶解作用，通常对革兰氏阳性菌的溶菌作用有效，对革兰氏阴性菌则无效或效果不是很好。因此，迫切需要深入了解溶菌酶对革兰氏阴性菌的杀菌抗菌机制，以提出更有针对性的高效的杀菌策略。本文选取食品中2种常见的致病菌为抑菌对象，确定其最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC），从而考察溶菌酶对这两种致病菌的抑菌效果和抑菌机理。为溶菌酶在食品保鲜方面的应用提供一定的理论依据。3.1实验材料和仪器设备3.1.1材料与试剂表3.1.1实验材料实验材料来源大肠杆菌金黄色葡萄球菌琼脂蛋白胨牛肉膏氯化钠从土壤中分离纯化从土壤中分离纯化北京化工厂北京化工厂北京化工厂北京化工厂3.1.2主要设备与仪器表3.1.2主要设备与仪器实验器材型号来源恒温培养箱电子天平高压蒸汽灭菌锅无菌操作台打孔器移液枪BPX52型AY220型SWC1LED上海博讯实业有限公司医疗设备厂日本岛津制作所上海博讯实业有限公司医疗设备厂3.2实验方法3.2.1培养基配置营养肉汤培养基：称取营养肉汤培养基干粉18 g溶于1000 ml蒸馏水中，分装于锥形瓶中，121灭菌30 min，备用。营养琼脂培养基：称取营养琼脂培养基干粉35 g溶于1000 ml蒸馏水中，微火加热，分装于锥形瓶中，121灭菌30 min，备用。葡萄糖酚红肉汤培养基：称取牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，葡萄糖0.5g，磷酸氢二钾0.1g，氯化钠0.5 g，酚红0.1 g，加入100 ml蒸馏水中，加热溶解，121灭菌30 min，备用。牛肉膏蛋白胨培养基：称取牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，121灭菌30 min，备用。3.2.2 菌种的获得（1）采土样选择较肥沃的土壤，铲去表土层，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤数10g，装入灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，做好编号记录，携回实验室供分离用。（2）制备土壤稀释液称取1g花园土，无菌操作倒入99mL无菌生理盐水中,置摇床中震荡20 分钟,使微生物细胞分散，静置2030s，即成10-2稀释液；再用lmL移液管，吸取10-2稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成10-3稀释液；再换一支移液管吸取10-3稀释液lmL，移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，即成10-4稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液（如图3.2.2）。图3.2.2稀释分离过程示意图（3）涂布用移液枪吸取10-5、10-6、10-7等一系列稀释菌液各0.2mL对应接种在已编号的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用无菌玻璃涂棒在培养基表面涂布均匀。（4）培养将平板倒置于37恒温培养箱中培养48h。（5）挑菌将培养后生长出的单个菌落挑取接种到上述培养基的斜面上，置于37培养，待菌苔出后，检查菌苔是否单纯，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。3.2.3菌株活化培养将各菌株接种到营养肉汤培养基中，37摇床培养24 h，连续接种23次，使菌株恢复活性。3.2.4溶菌酶样品液的制备将制得的溶菌酶干酶粉，配制成20mg/ml的溶菌酶储备液，依次稀释成10mg/ml、5mg/ml、2.5 mg/ml、1.25 mg/ml、0.625 mgml的浓度梯度备用。3.2.5蛋清溶菌酶滤纸片扩散法抑菌实验（1）将各供试菌活化后，取一小环菌落接入营养肉汤过夜培养，用营养肉汤将菌液调制106CFU/mL。（2）用移液管分别取0.1mL菌液于营养琼脂平板培养基中涂布均匀。（3）用打孔器打出直径5mm滤纸圆片，高压灭菌，备用。（4）将滤纸圆片分别放入不同浓度的蛋清溶菌酶中浸泡30min。（5）用无菌镊子夹取已在溶菌酶溶液中浸渍30min滤纸片，放在上述培养皿中，每皿五片。（6）静置30min后置于37恒温培养箱中培养24h，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径。3.2.6蛋清溶菌酶最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）的测定（1）采用液体倍比稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)取灭菌试管10支，1-10号依次编号，于无菌操作台上。取无菌葡萄糖酚红肉汤培养基2 ml依次加入各管。然后向第1管中加入2 ml浓度为20 mgml的溶菌酶样品液，充分混匀后，吸出2ml加入第2管中混匀，按此法依次重复稀释至第8管，第8管混匀后吸出2 ml混合液弃去。再分别向1-8管中加入测试菌液0.1 ml，第9管中加入01 ml测试菌液作阳性对照，第10管中加入2 ml浓度为20 mgml溶菌酶样品液后混匀，吸出2 ml混合液弃去，不加菌液作生长对照。将10支试管置于37恒温培养箱中培养24 h，取出，观察结果，以无菌生长管所含最小稀释度的溶菌酶浓度作为MIC。（2）最低杀菌浓度(MBC)的测定从无细细菌生长的各管取少量菌液划线接种于固体营养琼脂培养基上，于37培养48 h，观察结果，以营养琼脂培养基上菌落数少于5个的平板所含最小稀释度的溶菌酶浓度作为MBC。4 结果与讨论蛋清溶菌酶具有胞壁质酶活性，能够通过其活性中心 Glu35 和 Asp52 作用于 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰葡萄糖胺之间的 -1 ,4 糖苷键，从而破坏革兰氏阳性细菌表面的肽聚糖层，导致细菌瓦解。但是革兰氏阴性细菌的肽聚糖位于细胞壁结构的内层，其外侧受到外层脂多糖层的保护，溶菌酶很难直接作用于肽聚糖，但是它对于一些革兰氏阴性细菌同样具有杀菌作用。因此最近的研究提出溶菌酶也存在着独立于水解酶活性的抗菌活性。此种抗菌活性是基于溶菌酶被水解酶消化水解后形成的更小分子的多肽段，此时的水解活性几近消失，但是却仍然具有抗菌活性，通过观察多肽段的结构、电荷分布等研究提出，溶菌酶具有部分阳离子抗菌肽活性。不同浓度的蛋清溶菌酶对大肠杆菌以及金黄色葡萄球菌的抗菌活性。4.1结果4.1.1溶菌酶对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抗菌活性不同浓度溶菌酶对大肠杆菌及金黄色葡萄球的抑菌效果见图4.1.由图可以看出，溶菌酶对两种常见致病菌均有不同程度的抑制作用，并且随溶菌酶浓度增加，抑菌圈明显增大，抑菌效果增强。其中溶菌酶对大肠杆菌较为敏感，抑菌圈明显大于金黄色葡萄球菌。在较低浓度下，溶菌酶即可对大肠杆菌产牛抑制作用。图4.1 蛋清溶菌酶对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的抑制表4.2为溶菌酶对不同菌株的抑菌圈结果汇总表。由表4.2可知，溶菌酶对两种菌株的抑菌圈直径与溶菌酶浓度呈正相关。其中，大肠杆菌对溶菌酶最为敏感，当溶菌酶浓度为0625 mg/ml时对大肠杆菌产生的抑菌圈仍很大。溶菌酶对金黄色葡萄球菌的抑制效果很微弱，浓度为0625 mgml时抑菌圈不明显，浓度为10 mgml时抑菌圈直径约为另外两种菌的一半。由此可得出，溶菌酶对大肠杆菌有良好的抑制效果，在浓度稍高时，对金黄色葡萄球菌也起一定抑制作用。表4-2溶菌酶对不同菌株抑菌结果表菌株不同浓度对致病菌抑菌圈大小(mm)0.625mg/ml1.25mg/ml2.5mg/ml5.0mg/ml10.0mg/ml大肠杆菌14.8518.8921.6523.7826.14金黄色葡萄球菌9.9211.1813.0614.124.1.2溶菌酶的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)液体倍比稀释法测得溶菌酶对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，结果见表4.3。可知，溶菌酶对两种供试菌株的MIC和MBC分别是：大肠杆菌为0.313mg/ml和0625 mg/ml，金黄色葡萄球菌为1.25mg/ml和5.0 mg/ml。表4.3 溶菌酶对不同供试菌株的MIC和MBC菌株溶菌酶对不同供试菌株的MIC和MBC(mg/ml)MICMBC大肠杆菌0.3130.625金黄色葡萄球菌1.2554.2讨论革兰氏阴性菌的细胞壁外层覆盖着大量的脂多糖，细胞表面结构的复杂性决定了细胞表面特性的差异性，如表面电荷、表面疏水性以及外膜通透性等，同时也决定了细菌对抑菌剂的敏感程度。溶菌酶主要作用于细菌的肽聚糖层，由于革兰氏阴性菌的外膜脂多糖的阻碍，溶菌酶较难与肽聚糖相结合，从而使得溶菌酶的抑菌效果不明显。但是仍然有一些革兰氏阴性菌对溶菌酶敏感，说明溶菌酶对革兰氏阴性菌的作用效果受到细胞的一些其他特性的影响，这反映出溶菌酶抑菌机制的复杂性。存在问题：由于各类溶菌酶的作用特性强，只对特定的微生物有充份的溶解作用，因此需要充分掌握溶菌酶的酶学特性在最大程度发挥溶菌酶的活力。目前溶菌酶的产量普遍较低，成本较高，导致溶菌酶的价格比较高，难以得到普遍的推广与应用，下一步应着重研究摸索出利用国产廉价原料分离纯化工艺并获得廉价纯化的溶菌酶。国内企业生产的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶，然而从生物材料提取溶菌酶有其固有缺陷：受生物材料来源限制，生物材料由于取自不同生物体，保险程度不一，难以保证不受病毒和其他有害物质污染，这会造成产品质量不稳定。由于革兰氏阳性菌的肽聚糖层位于细胞壁外层，因此溶菌酶对大多数革兰氏阳性菌都有较好的抑菌效果；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层位于细胞膜的中间层，其外部还有细胞外膜物质脂多糖的阻挡，使得溶菌酶难以作用于中间的肽聚糖层，因此溶菌酶对大多数革兰氏阴性菌的抑菌效果并不理想。为了提高溶菌酶对不同细菌的抑菌能力，国外已经做了一些相关研究：第一，通过改变溶菌酶的构象，使处理后的溶菌酶易于穿透细胞壁进入细胞而发挥抑菌活性，如对溶菌酶进行部分热变性处理，利用还原剂还原溶菌酶的二硫键，或将溶菌酶水解成小分子多肽段；第二，在利用溶菌酶抑菌的同时，结合物理方法如高压、超高压匀质处理细胞，使细胞形态发生变化，减小外膜阻碍力，便于溶菌酶进入肽聚糖层；第三，添加其他化学物质与溶菌酶协同作用，也会不同程度地提高溶菌酶的抑菌活性。随着人们对食品安全的关注度越来越高，溶菌酶作为一种天然防腐剂，受到了研究人员的广泛关注。为了提高它的广谱性和抗菌活性，研究它与其他抗菌剂协同作用是非常必要的。可以预见，如果提高了溶菌酶的广谱抗菌活性，它在食品添加剂领域的应用前景将十分广阔。参考文献1. 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