2015年-2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第45卷 第9期2023年9月Vol.45，No.9Sep.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.2022110362015年2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析程亚豪1，胡灵子1，刘雅琦1，周莹珊1，杜静1，周兴东1，王晓杜1，吴瑗2*，董婉玉1*(1.浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院，浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室/动物医学与健康管理浙江省国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室，浙江 杭州 311300；2.金华职业技术学院 农学院，浙江 金华 321007)摘要：为了解2015年2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行特征和遗传变异规律，本研究利用RT-PCR扩增2015年2017年11株分离自浙江地区PEDV流行株的S1基因序列，并与GenBank中我国东部地区(上海、江苏、山东、河南和安徽)的86株PEDV流行株的S1基因序列通过MEGA 7.0软件比较分析S1基因的遗传进化关系，采用CLC Sequence Viewer 8软件分析比对S1蛋白氨基酸序列的变异。PEDV S1基因遗传进化分析结果显示，97株PEDV中有92%的流行株属于G2型，与疫苗株CV777同源性较低(90.4%96.1%)，山东地区2017年2018年间的部分流行株与疫苗株CV777等属于G1型；G2型中，33%的流行株属于G2a型，67%的流行株属于G2b亚型，其中2019年2021年的流行株有15%流行株属于G2a亚型，85%的流行株属于G2b亚型。S1蛋白关键表位的变异分析结果显示，与经典株CV777相比，中和表位COE(CO-26K equivalent epitope)发生8个氨基酸位点(A517S、S523G、V527I、T549S、G594S、A605E/D、L612F/Y、I635V)的突变，SS2区域无氨基酸变异，SS6发生1个氨基酸位点(Y766S)的突变，2018年后出现新的突变位点(T636I和S749G)。不同地区S1蛋白关键表位的变异分析结果显示，aa501变异在河南地区(L501P)和江苏地区(L501W)存在明显的差异；aa536突变(F536L)多集中于河南、山东地区的流行株，aa542突变(D542E)集中于江苏、上海地区。本研究首次系统分析了我国东部地区PEDV流行株S1基因及其氨基酸的遗传变异规律，为我国该地区PEDV变异株疫苗选择、生物安全防控方案制定提供了参考依据。关键词：猪流行性腹泻病毒；S1基因；遗传变异；序列分析中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)09-0968-05Variation analysis of epitopes for S1 protein of porcine epidemicdiarrhea virus in Eastern China from 2015 to 2021CHENG Ya-hao1,HU Ling-zi1,LIU Ya-qi1,ZHOU Ying-shan1,DU Jing1,ZHOU Xing-dong1,WANG Xiao-du1,WU Yuan2*,DONG Wan-yu1*(1.College of Animal Science and Technology&College of Veterinary Medicine,Zhejiang A&F University,Applied Technology onGreen-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province,Provincial Engineering Research Center for Animal Health Diagnostics&AdvancedTechnology,Zhejiang International Science and Technology Cooperation Base for Veterinary Medicine and Health Management,China Australia Joint Laboratory for Animal Health Big Data Analytics,Hangzhou 311300,China;收稿日期：2022-11-17基金项目：国家自然科学基金(31972656)；浙江省农业重大技术协同推广项目(2021XTTGXM02-05)；浙江省三农六方项目(2021SNLF023)；杭州市农业与社会发展科研项目(20201203B61)；金华市农业重点研发项目(2022-2-022）；浙江农林大学科研训练项目(S202210341099)作者简介：程亚豪(1996-)，女，河南漯河人，硕士研究生，主要从事动物疫病防控及分子病毒学研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author2.Faculty of Agriculture,Jinhua Polytechnic,Jinhua 321007,China)Abstract:In order to analyse the epidemic characteristics and the genetic variation of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)in Eastern region of China from 2015 to 2021,the S1 gene sequence of 11 PEDV epidemic strains in Zhejiang during 2015-2017were obtained by RT-PCR and the resulting sequences were used to compared with another S1 gene sequences of 86 PEDV stainsin Eastern region of China(Shanghai,Jiangsu,Shandong,Henan and Anhui Provinces)available in GenBank.MEGA 7.0 softwarewas used for analysis of the genetic evolution relationship among S1 gene above.CLC Sequence Viewer 8 software was used forthe amino acid sequence of S1 protein.The results of genetic evolution analysis for the S1 gene showed that 92%of the epidemicstrains belonged to the G2 group and revealed low levels of sequence homology with vaccine strains CV777 sequences(90.4%-96.1%).Some of the epidemic strains during 2017-2018 in Shandong Province and vaccine strains CV777 belonged to the G1group.In the G2 group,33%of the epidemic strains belonged to the G2a subgroup,67%of the epidemic strains belonged to theG2b subgroup.15%of the epidemic strains in 2019-2021 belonged to the G2a subgroup,and 85%belonged to the G2b subgroup.Analysis of variation for the key epitopes of the S1 protein showed that compared with the classical strain CV777,8 amino acidmutations(A517S,S523G,V527I,T549S,G594S,A605E/D,L612F/Y,I635V)in the neutralization epitope COE(CO-26K equivalent epitope)were mutated.The SS6 epitope showed 1 amino acid site mutations(Y766S).And new mutation sites emerged since 2018(T636I andS749G).The variation analysis of key epitopes of S1 protein in different regions showed that the variation of amino acid 501 wassignificantly different between Henan(L501P)and Jiangsu(L501W).The amino acid mutation at site 536(F536L)was concentrated inthe endemic strains in Henan and Shandong,and the amino acid mutation at site 542(D542E)was concentrated in Jiangsu andShanghai.This study is the first time to analyze systematically the genetic variation of S1 gene and protein levels of PEDVepidemic strains in Eastern region of China,and provided a basis for vaccine selection and biosecurity prevention and control plansfor variant strains in this region of China.Key words:porcine epidemic diarrhea virus;S1 gene;genetic variation;evolutionary analysis猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是一种由PED病毒(PEDV)引起仔猪的急性水样腹泻、呕吐甚至脱水死亡等症状的高致病性肠道传染病1。该病最初发现于欧洲，后扩散至养猪业发达的亚洲东部地区。在亚洲地区造成的危害比原发地欧洲更加严重2。目前，PEDV可分为两个独立的基因型，G1型(经曲)和G2型(变异)，再细分为5个亚型(G1a、G1b、G2a、G2b和G2c)。PEDV是具有囊膜结构的单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，编码4种结构蛋白包括刺突(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白以及一个辅助蛋白ORF33。PEDV S蛋白在病毒吸附及侵入宿主细胞、诱导宿主产生中和抗体、病毒复制以及病毒毒力等方面均发挥着重要作用4-6。S蛋白可分为S1亚基和S2亚基7。S1的N端区可与宿主细胞受体结合，介导病毒的侵入。与S1亚基相比，S2亚基更为保守。值得注意的是，PEDV的S1基因在整个PEDV基因组中包含的变异区域最多，在所有基因中多样性程度最高，因此常被用来研究不同时间、不同地区流行的PEDV遗传演化关系。自2010年我国以S基因变异为主要特征的高毒力PEDV变异株出现以来，各地PEDV检出率居高不下，尤其是作为生猪养殖的主要大区，东部地区近年来PEDV流行趋势持续上升，各地养殖企业受损严重。为此本研究对东部地区2015年2021年PEDV流行株S1基因序列进行遗传进化关系分析，并分析其蛋白氨基酸序列及关键抗原表位的变异，为了解我国东部地区PEDV流行株遗传变异规律以及为PED的防控和新型疫苗研发提供借鉴。1材料与方法1.1样品与主要试剂来自浙江11个地区猪场共11份检测为PEDV阳性的肠道组织样品由本实验室保存。KOD ONETMPCR Master Mix试剂盒、高效率反转录试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；UNlQ-10柱式TRIzol总RNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。程亚豪，等.2015年2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析第9期969荫：本研究PDEV分离株 荫:PDEV isolates in this study图22015年2021年我国东部地区PEDV S1基因的系统进化树1.2肠道组织样品PEDV S1基因的PCR扩增参照GenBank登录的不同PEDV S1基因，利用SnapGene设计扩增引物(S1-F：5-AGCAAGTTCAATTGTAAGCAT-3/S1-R：5-CAACACAGAAAGAACTAAAC-3)。选取1.1中11份肠道组织样品，剪取适量加入无菌PBS，研磨后离心取上清液，采用TRIzol提取样品总RNA，反转录为cDNA为模板，采用上述引物经PCR扩增PDEV S1片段，PCR产物经纯化回收后由杭州有康生物科技有限公司测序。11份阳性样品中的PEDV根据地区分别命名为YJH、FH、XT、WF、TQ、HY、ZJC、LP、HG、HH、FY。1.3PEDV S1基因的遗传演化及其蛋白氨基酸序列的变异分析测序后的S1基因序列利用DNAStar软件拼接，从GenBank中下载2015年2021年东部地区86株PEDV流行株S1基因，通过MEGA 7.0软件构建S1基因系统进化树。利用CLC Sequence Viewer8软件比对分析PEDV S1蛋白氨基酸序列的变异。2结果与讨论2.1PEDV S1基因的PCR扩增及测序结果采用PCR对11份PEDV阳性样品的S1基因进行扩增，结果显示，扩增出大小约2 100 bp的目的基因片段(图1)，与预期S1基因大小一致。将该扩增的片段纯化回收后测序并拼接，得到S1基因序列。2.2PEDV S1基因的遗传进化分析为分析我国东部地区PEDV流行株的遗传进化关系，本研究对97株PEDV(包括11株浙江地区分离株和86株参考株)S1基因序列比对分析S1基因的同源性和遗传进化特征。结果显示，11株分离株S1基因序列之间的同源性为95.8%99.9%，与G1型疫苗株CV777的S1基因序列同源性为93.9%94.3%，与G2型流行株的同源性为94.7%98.9%。97株PEDV可为两大基因型即G1型和G2型。山东地区2017年2018年间部分流行株与疫苗株CV777等共同组成G1型，其他92%的流行株属于G2型，与疫苗株CV777同源性较低(90.4%96.1%)。在G2型中，33%的流行株属于G2a亚型，67%的流行株属于G2b亚型，其中2019年2021年的PEDV属于G2a亚型流行株的占比为15%，属于G2b亚型流行株的占比则达85%(图2)。2019年2021年间G2b亚型流行株占比的升高可能是由于2018年后PEDV变异株疫苗的使用使得病毒迫于免疫压力从而发生从G2a亚型向G2b亚型的进化；G2c亚 型 由 河 南 省2016年 部 分 流 行 株 与 浙 江 株ZJ16LX1共同组成。此外，浙江省2017年分离的PEDV FY、XT和ZJC株与2020年河南省、山东省的流行株位于同一分支，从时间节点上推测，河南省与山东省2020年流行株可能来源于浙江省2017年变异株8-9。本研究通过S1基因的遗传进化分析表明，目前东部地区PEDV流行株的主要基因型为G2b亚型，且具有遗传多样性特征。2.3PEDV S1 蛋 白 关 键 中 和 表 位 变 异 的 分 析PEDV S1蛋 白 包 含3个 中 和 表 位 区COE(aa499aa638)、SS2(aa748aa755)和SS6(aa764aa771)10。2015年2021年东部地区流行株S1蛋白氨基酸比对中 国 预 防 兽 医 学 报2023年970M:DL15000 DNA Marker;1-11:PEDV positive samples S1 genesfrom FH,FY,HG,HH,HY,LP,TQ,WF,XT,YJH,ZJC,respectively图111份PEDV阳性样品S1基因的PCR扩增结果15000bp10000bp7500bp5000bp2500bp1000bp250bpM1234567891011分析结果显示，相比于疫苗株CV777，COE区域存在8个一致的突变位点(A517S、S523G、V527I、T549S、G594S、A605E/D、L612F/Y、I635V)；SS2区域无氨基酸变异；SS6区域在aa766发生相同的氨基酸变异(Y766S)(图3)。这些规律性的突变位点与当前国内流行变异株突变位点基本一致9,11。S蛋白氨基酸的高变性导致其的多样性，S蛋白多个中和抗原表位的位点突变可能致使病毒出现免疫逃逸，提示造成我国东部地区猪场使用的PEDV传统疫苗CV777对猪的免疫保护效果较差的原因是PEDV发生了变异，且病毒仍在持续变异，病毒发生变异的极大可能是由于S蛋白S1亚基的变异所致。此外，S1蛋白多个氨基酸位点在2018年之前发生较为频繁的突变(I496T/S、T500A、D542E、R544S、K563N/T、G609V/S)，而在2018年以后这些位点基本无变异；aa521(L521H/Y/R)在2018年后的变异逐渐趋于稳定性(L521H)，aa636和aa749是2018年后出现的新突变位点(T636I和S749G)(图3)，推测上述中和表位变异特征可能与2018年后PEDV变异株疫苗的推广使用相关。图32015年2021年我国东部地区PEDV S1蛋白氨基酸序列中和表位的变异分析程亚豪，等.2015年2021年我国东部地区猪流行性腹泻病毒S1蛋白关键表位的变异分析第9期9712.4不同地区PEDV S1蛋白关键中和表位变异的分析值得注意的是，S1蛋白aa501变异在河南地区(L501P)和江苏地区(L501W)存在明显的差异；aa536突变(F536L)多集中于河南、山东地区的流行株，aa542突变(D542E)集中于江苏、上海地区，表明不同地区PEDV之间呈遗传多样性，且存在相同位点突变差异的原因可能是受地理位置和环境气候等因素的影响12。总之，相较于传统株，PEDV变异株氨基酸序列在中和表位区域的突变是否改变东部地区流行株的抗原性和致病性，是否为影响PEDV疫苗免疫效率的关键突变等问题仍有待进一步的深入研究。此外，自2019年开始，东部地区各地不同流行SS2SS6COE株之间的变异特征逐渐趋于相似性和稳定性，这可能与我国为有效应对非洲猪瘟、猪病毒性腹泻等重大动物疫病的流行传播，推行重大动物疫病五大区分区防控政策有关。分区防控之前，全国各地之间频繁的跨区域农畜产品贸易活动尤其是生猪调运为PED的传播提供了机会，自2019年开始实行限制生猪区外调运的措施以来，PEDV S1蛋白氨基酸变异特征表现出一致性。因此，进一步加强生猪及生猪产品调运监管，切实加强动物疫病区域化管理，有效降低动物疫病跨区域传播风险是减少疫病传播的关键。与此同时，开发基于PEDV流行变异株的新型疫苗以及猪场定期更新疫苗株以确保对新型变异株具有足够免疫效果仍然具有迫切性和必要性。本研究首次对我国东部地区开展了PEDV流行株S1基因和氨基酸序列的遗传变异分析，并归纳了部分区域变异规律，为该地区PEDV变异株疫苗的选择及生物安全防控方案的制定提供参考依据。参考文献：LIN HUI-XING,CHEN LEI,GAO LU,et al.Epidemic strainYC2014 of porcine epidemic diarrhea virus could provide pigletsagainst homologous challenge J.Virol J,2016,13:68-80.ZHAO PENG-WEI,WANG SONG,CHEN ZHI,et al.Succes-sive passage in vitro led to lower virulence and higher titer of avariant porcine epidemic diarrhea virus 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