A型塞内卡病毒VP2蛋白抗原区的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 10 期2023 年 10 月Vol.45，No.10Oct.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.202209017A型塞内卡病毒VP2蛋白抗原区的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立翟刚1,2覮，顾文源1,3覮，王晶1，刘莹1,2，赵云环1，刘涛1,4，张帅1，左玉柱1,2*，范京惠1,2*(1.河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071001；2.河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001；3.河北省动物疫病预防控制中心，河北 石家庄 050053；4.瑞普(保定)生物药业有限公司，河北 保定 071001)摘要：为建立高效的A型塞内卡病毒(SVA)的血清学检测方法，本研究经PCR扩增SVA VP2基因的优势抗原区域(VP2-1基因)后构建重组质粒pET-32a-VP2-1，将其转化大肠杆菌感受态细胞并经IPTG诱导表达重组VP2蛋白(rVP2)，表达产物经镍柱亲和层析法纯化后利用western blot鉴定，结果显示，在42 ku处出现特异性条带，表明rVP2可以与SVA阳性血清特异性反应。以rVP2为包被抗原，经反应条件的优化，建立了基于SVA VP2抗原区的间接ELISA抗体检测方法。本研究建立的间接ELISA检测方法的最适抗原包被浓度为2 滋g/mL，5%脱脂乳的PBST作为封闭液37 孵育1 h，待检血清的最适稀释度为1颐500，兔抗猪IgG-HRP稀释度为1颐10 000，最佳显色时间为10 min。当检测样品的S/P值0.201时，样品检测结果为阴性；当检测样品的S/P值逸0.201时，结果为阳性。利用该方法检测SVA，猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)等阳性血清，结果显示，除SVA检测为阳性外，其他病毒均为阴性，特异性较强。将SVA阳性血清2倍倍比稀释(1颐50，1颐100，1颐200，1颐400，1颐800，1颐1 600)后经该间接ELISA方法检测，评估其敏感性，结果显示，SVA阳性小鼠血清在1颐800稀释后检测结果仍为阳性，敏感性较高。将同一批次和不同批次纯化的rVP2包被ELISA板，按照该ELISA方法检测8份猪SVA阳性血清，评估该方法的重复性。结果显示，批内、批间重复性试验的变异系数均小于10%，该方法重复性好。利用本实验建立的间接ELISA方法与血清中和试验同时对266份临床血清样品检测，结果显示，本研究建立方法检测的样品阳性率为19.1%，中和试验检测的样品阳性率为19.55%，两种方法检测结果符合率为97.7%。本研究首次基于SVA rVP2建立的间接ELISA方法操作简单、特异性强、敏感性高、重复性好，为SVA的检测和其感染的防控提供了可靠的技术支持。关键词：猪；A型塞内卡病毒；VP2；间接ELISA中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)10-1025-07Prokaryotic expression of VP2 antigen region oftype A Seneca virus and establishment of an indirectELISA antibody detection methodZHAI Gang1,2覮,GU Wen-yuan1,3覮,WANG Jing1,LIU Ying1,2,ZHAO Yun-huan1,LIU Tao1,4,ZHANG Shuai1,ZUO Yu-zhu1,2*,FAN Jing-hui1,2*收稿日期：2022-09-22基金项目：河北省省级科技计划资助(21326611D、19226622D)；河北省农业产业技术体系生猪创新团队(HBCT2023170201、HBCT2023170401)覮 共同第一作者：翟刚(1997-)，男，河北保定人，硕士研究生，主要从事动物传染病防控研究；顾文源(1992-)，女，江苏镇江人，博士，高级兽医师，主要从事动物传染病防控研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding author;覮Equal contributors(1.College of Veterinary Medicine,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;2.Hebei Veterinary Biotechnology InnovationCenter,Hebei Agricultural University,Baoding 071001,China;3.Hebei Center for Animal Disease Prevention and Control,Shijiazhuang050053,China;4.Ringpu(Baoding)Biological Pharmaceutical Co.,Ltd.,Baoding 071001,China)Abstract:To establish an efficient serological detection method for Seneca virus type A(SVA),in this study,a recombinantplasmid pET-32a-VP2-1 was constructed after PCR amplification of the SVA VP2-1 gene,and the recombinant plasmid wastransformed intocompetent cells to induce the expression of recombinant VP2 protein(rVP2).The expression productwas purified by nickel column affinity chromatography and then identified by western blot.The results showed that therecombinant rVP2 protein could react specifically with SVA-positive serum.An indirect ELISA method based on the SVA VP2antigen region was established by optimizing the reaction conditions using recombinant rVP2 protein as the encapsulated antigen.The optimum antigen encapsulating concentration of the indirect ELISA method established in this study was 2滋g/mL,5%skimmed milk in PBST was used as the blocking solution and incubated at 37for 1 hours,the optimum dilution of the serumto be tested was 1:500,and the dilution of rabbit anti-pig IgG-HRP was 1颐10000.The optimum color development time was 10minutes.When the S/P value of the test sample was 0.201,the sample was defined as negative;when the S/P of the test samplewas 逸0.201,the sample was defined as positive.The method was used to detect positive sera for SVA,porcine pseudorabiesvirus(PRV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV),porcine epidemic diarrhea virus(PEDV),and swinefever virus(CSFV).The results showed that,except for the SVA,all the others were negative,with strong specificity.Thesensitivity of this method was then evaluated by dilution of SVA positive sera(1颐50,1颐100,1颐200,1颐400,1颐800,1颐1600),andthe results showed that the serum of SVA-poistive mouse was still positive when diluted at 1颐800,with high sensitivity.Theresults of intra-batch and inter-batch repeat tests showed that the coefficient of variation was less than 10%and the method wasrepeatable.The indirect ELISA method established in this study and serum neutralization test were used to detect 266 clinicalserum samples.The results showed that the compliance rate of the two methods was 97.7%.In conclusion,the indirect ELISAmethod based on recombinant rVP2 protein was established with simple operation,high specificity,high sensitivity and goodrepeatability,which provide reliable technical support for serological diagnosis and prevention of SVA.Key words:swine;Seneca virus A;VP2 protein;indirect ELISA塞内卡病毒病是由A型塞内卡病毒(SenecavirusA，SVA)引起的一种猪原发性水疱病。在SVA感染初期，病猪的主要临床症状为食欲减退、体温升高等，随后鼻、舌和蹄冠等部位出现水泡病变，严重时会蔓延至蹄底部致病猪跛行1。此外，1日龄4日龄的新生仔猪感染SVA后可引起仔猪腹泻及死亡，给我国养猪业造成了巨大隐患。该病与口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)、猪传 染性水疱病(Swine vesicular disease，SVD)、猪 水 疱 性 皮 疹(Vesicular exanthema of swine，VES)、水疱性口炎(Vesicular stomatitis，VS)等疾病的临床症状极为相似1-2，给SVA的诊断与SVA病的防控带来阻碍。SVA最早于2002年被美国研究人员在细胞培养基污染物中发现并分离得到3。随后在2007年，研究人员在患有水疱病的病猪中首次发现SVA4。2014年以来在美国、加拿大和哥伦比亚等多个国家均发现了猪感染SVA5-6。我国于2015年在广东地区首次发现猪感染SVA，随后多个地区也相继发现猪群感染SVA。目前，国内外对SVA的研究较少，国内尚无商品化疫苗以及有效的治疗方法，且SVA的危害程度及对我国养猪业健康发展的影响日趋严重。SVA是小RNA病毒科塞内卡病毒属的成员7。该病毒是一种无囊膜的单股正链RNA病毒，呈二十面体结构8-9，其基因组全长约为7.3 kb，呈典型的L-4-3-4分布10。该病毒的基因组编码含2 181个氨基酸的多聚蛋白，该蛋白可以裂解形成先导蛋白(L)和P1、P2、P3 3个蛋白中间体，P1可进一步裂解成VP1、VP2、VP3和VP4 4种结构蛋白，VP1、VP2、VP3构成病毒外壳11，具有较强的抗原性，可以刺激动物机体产生非特异性免疫应答，其中VP2蛋白含氨基酸的数量最多，并且含SVA的主要中和表位。除此以外，VP2蛋白比VP1和VP3蛋白的免疫原性强12，并且在SVA感染的早期和晚期均能在机体中检测到VP2抗体。Maggioli等在控制宿主SVA病毒血症的过中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1026程中，VP2蛋白产生的中和抗体起重要作用13。VP2特异性IgG抗体一直到感染后35 d才能被检测到，而VP1和VP3的IgG抗体则无法检测到14。但SVA VP2蛋白较大，纯化过程较为复杂。抗原表位(Antigenepitope)又称抗原决定簇(Antigenic determination)，是指抗原分子表面具有刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞并能被其识别的免疫活性区15。基于抗原表位表达的蛋白结构简单、易于纯化，避免了与其他病毒抗体发生交叉反应的可能性。因此，本研究通过以原核表达SVA VP2蛋白的主要抗原区蛋白作为检测 抗 原，初 步 建 立 了 检 测 SVA VP2蛋 白 的 间 接ELISA检测方法，为今后更全面的检测与评价疫苗的免疫效力与保护率以及对SVA感染的临床诊断提供了可靠的技术支持。1材料与方法1.1主要实验材料RNAiso Plus、DNA Marker、pET-32a载体、反转录试剂盒、R I、I，均购自TaKaRa公司；Super GelRedR核酸凝胶染料购自US EverbrightRInc(苏州)；BL21(DE3)感受态细胞由河北农业大学兽医微生物与免疫学实验室保存。采用本实验室分离到的SVA病毒通过免疫SVA抗原抗体均为阴性的仔猪，3周后经间接荧光免疫试验检测为抗体阳性，作为SVA标准阳性血清；35份 SVA 阴 性 血 清、猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 症 病 毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清均由本实验室采集并保存；266份临床血清样品为2019年2020年采自河北省保定市、邯郸市、张家口市及衡水市等地区猪场送检猪。His标签蛋白纯化试剂盒购自 北 京 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司；兔 抗 猪IgG-HRP购自博奥龙生物科技有限公司；DAB显色试剂盒和NC膜购自Solarbio公司；AEC底物显色试剂盒购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；TMB显色液购自美国Sigma公司。1.2引物设计根据GenBank中登录的SVA VP2基因(MN809593)，并选择VP2基因的优势抗原区域(VP2-1)，设 计 一 对 引 物：SVA-F：CGGAATTCGAAGACTCGACCCAATCT(R I)/SVA-R：CCCTCGAGGGAGCTCTGTGTCTGTGC(I)，用于PCR扩增VP2-1基因，目的基因大小为594 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1.3SVA VP2-1基因的PCR扩增及重组VP2-1蛋白(rVP2)的表达提取SVA RNA并经反转录试剂盒反转录为cDNA作为模板，采用引物SVA-F/R，经PCR扩增VP2-1基因，将PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收纯化后，由上海生工生物工程技术服务有限公司 测 序 正 确 后 克 隆 至 pET-32a，构 建 重 组 质 粒pET-32a-rVP2，pET-32a-rVP2经R I、I双酶切鉴定并测序鉴定正确后转化BL21感受态细胞，获得重组表达菌pET-32a-rVP2/BL21。将重组菌200 r/min、37 震荡培养至OD600nm为0.7时以终浓度为1 mmol/LIPTG诱导，同时设pET-32a/BL21菌诱导为对照，经SDS-PAGE分析后利用镍柱亲和层析法对表达rVP2纯化，以SVA阳性血清(1颐500)为一抗，以兔抗猪IgG-HRP(1颐200)作为二抗，对纯化蛋白进行westernblot鉴定。1.4间接ELISA方法最适反应条件的优化将纯化的rVP2利用NanoDrop 2000测量蛋白浓度后，采用方阵滴定法，优化纯化的rVP2抗原包被浓度(0.0005 g/L、0.001 g/L、0.002 g/L、0.003 g/L、0.004 g/L)，4 时包被时间(10 h、12 h和14 h)，封闭试剂(5%脱脂乳、5%胎牛血清、5%新生牛血清、1%BSA)，血清稀释度(1颐50、1颐100、1颐200、1颐400、1颐500、1颐600、1颐800)，兔抗猪IgG-HRP稀释度(1颐2 500、1颐5 000、1颐10 000、1颐20 000)，反应时间(30 min、45 min、60 min)，TMB显色时间(5 min、10 min、15 min、20 min)。同时设置标准的阳性与阴性血清作为对照，每个对照重复3次，采用酶标仪测OD450nm值，计算S/P值，S/P=(待测血清OD450nm值-阴性对照平均OD450nm值)/(阳性对照平均OD450nm值-阴性对照平均OD450nm值)，当S/P最大值时的反应条件作为最优反应条件。1.5临界值的确定按照确定的最佳条件对35份SVA阴性血清进行间接ELISA检测，每个样品重复3次，对得出的S/P值经计算得出平均值()和标准差()。临界值的计算公式为：+3，根据统计学的正态分布原则分析，S/P值+3 为阴性，S/P值逸+3时为阳性。1.6特异性试验按照上述建立的ELISA方法对PRRSV、PEDV、TGEV、CSFV、PCV2、PRV阳性血清样品进行检测，每个样品重复3次，同时以SVA翟刚，等.A 型塞内卡病毒 VP2 蛋白抗原区的原核表达及间接 ELISA 抗体检测方法的建立第 10 期1027阳性血清为阳性对照，SVA阴性血清为阴性对照，评价该方法的特异性。1.7敏感性试验将SVA阳性血清按照1颐50、1颐100、1颐200，1颐400、1颐800、1颐1 600稀释后，采用本研究建立的间接ELISA方法检测，评价该方法的敏感性。1.8重复性试验将同一批次和不同批次纯化的rVP2包被96孔板，采用本研究建立的间接ELISA方法检测8份猪SVA阳性血清，同时设立阴性对照，每份血清重复检测3次，对结果进行统计分析，计算待检SVA血清批内和批间重复试验的变异系数，评价该方法的重复性。1.9临床样品检测采用建立的间接ELISA方法对266份临床猪血清样品进行检测，同时采用中和试验对血清样品进行检测，统计并分析其检测结果，计算SVA的阳性检出率及两种检测结果的符合率，以便进一步了解SVA在河北省的流行情况。2结果2.1目的基因的PCR扩增结果以制备的SVA VP2的cDNA为模板，经PCR扩增，结果显示得到与预期大小相符的目的条带。经测序分析，结果显示目的条带为594 bp(图1A)，与预期一致。表明正确获得了SVA VP2-1基因。将VP2-1基因克隆于pET-32a中，构建重组质粒pET-32a-rVP2，重组质粒经R I、I双酶切鉴定，结果显示，得到了594 bp目的基因片段和5 306 bp的pET-32a载体片段(图1B)，与预期大小相符，表明正确构建重组质粒pET-32a-rVP2。2.2rVP2的表达及鉴定结果将pET-32a-rVP2转化BL21感受态细胞，获得的重组表达菌pET-32a-rVP2/BL21经IPTG诱导后，SDS-PAGE鉴定结果显示，在约42 ku处出现明显的蛋白表达条带(图2A)，大小与预期相符，表明本研究正确表达了重组蛋白rVP2。经Ni柱纯化后经NanoDrop2000测定蛋白浓度为0.544g/L，获得纯度较好的重组蛋白(图2B)。Western blot鉴定结果显示，纯化的rVP2可以与猪SVA阳性血清发生特异性反应(图3)，表明rVP2具有良好的反应原性。2.3间接ELISA检测方法反应条件的优化结果通过矩阵法对ELISA各步骤反应条件的优化结果见表1。2.4临界值的确定采用优化的间接ELISA方法对35份SVA阴性血清进行检测，经计算后结果显示，当检测样品的S/P值0.201时可以判定为阴性，S/P值逸0.201时判定为阳性。2.5特异性试验结果采用建立的ELISA方法检测临床常见病原结果阳性血清，结果显示，除SVA阳性血清对照为阳性外，其它相关病毒阳性血清的检测结果均为阴性(图4)。表明基于rVP2建立的间接ELISA抗体检测方法的特异性较强。M:Pretein Marker;1:rVP2图3rVP2的western blot鉴定结果100ku70ku50ku40ku30kuM1A:M:DL2000 DNA Marker;1:SVA VP2-1 taget gene;B:M:DL5000 DNA Marker;1:Identification of pET-32a-rVP2 byenzyme digestion图1SVA VP2-1基因的扩增(A)以及重组质粒双酶切鉴定(B)结果M1M15000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bp500bp250bp100bp2000bp1000bp750bp500bp250bp100bpABM：蛋白Marker；A：17：pET-32a-rVP2/BL21诱导后1 h7 hB：1：诱导后的pET-32a/BL21；2：纯化后的rVP2M:Protein Marker;A:1-7:1-7 hours after induction ofpET-32a-rVP2/BL21B:1:Induced pET-32a/BL21;2:Punfied rVP2 protein图2rVP2表达(A)及纯化(B)的SDS-PAGE检测结果100ku70ku50ku40ku30ku25ku100ku70ku50ku40ku30ku25kuM1234567M12AB中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年1028表 2间接 ELISA 方法的重复性试验结果血清编号No.123456780.418依0.01271.159依0.03970.987依0.02840.656依0.01341.326依0.05691.266依0.09130.895依0.03690.465依0.0269变异系数Coefficientof variation4.562.563.094.313.014.513.123.560.618依0.03271.269依0.1971.187依0.06840.796依0.03341.356依0.07981.34依0.1131.065依0.1590.735依0.0514变异系数Coefficientof variation7.348.566.545.615.116.549.016.11批内重复性试验Intra batch repeat test批间重复性试验Inter batch repeat test图4间接ELISA方法的特异性试验结果Positive NegativePRRSVPRVCSFVPCV2PEDVTGEV2.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20Serum图5间接ELISA方法的敏感性试验结果1颐160001颐8001颐4001颐2001颐1001颐501.41.21.00.80.60.40.20表 1最佳反应条件的优化结果最佳稀释度 Optimized dilutions最佳反应条件 Reaction conditions抗原包被浓度Antigen coatingconcentration2滋g/mL4 12h5%脱脂牛奶5%skimmed milk37 1h1颐50037 1h1颐1000037 45min显色条件Color reactionconditions25 10min表 3临床样品的间接 ELISA 检测结果保定Baoding邯郸Handan张家口Zhangjiakou衡水Hengshui总计Total送检样品数Number ofsamples sentfor testing118394168266218111050阳性率%Positivity rate%17.8%20.5%26.8%14.7%19.1%翟刚，等.A 型塞内卡病毒 VP2 蛋白抗原区的原核表达及间接 ELISA 抗体检测方法的建立第 10 期10292.6敏感性试验结果利用建立的间接ELISA方法对2倍倍比稀释的SVA阳性血清检测，结果显示，当阳性血清1颐800稀释时，S/P值为0.3(图5)，仍为阳性，表明建立的ELISA方法敏感性较强。2.7重复性试验结果将同批次和不同批次制备的rVP2包被为ELISA板，采用该间接ELISA方法检测8份猪SVA阳性血清，分别进行批内和批间重复性试验，经过SPSS分析，结果显示，批内平均变异系数为3.5%，且均小于5%，批间平均变异系数为7.6%，且均小于9%(表2)，表明该检测方法重复性和稳定性较好。2.8临床样品的检测同时采用本研究建立的间接ELISA方法和血清中和试验对266份血清样品进行检测，结果显示，ELISA方法检测的SVA血清阳性率为19.1%(表3)，中和试验检测的阳性率为19.55%，且两种检测方法共有260份血清样品的检测结果一致，二者符合率为97.7%。检测结果显示张家口市的SVA检出的阳性率最高为26.8%，衡水市的阳性检出率最低为14.7%。表明本研究建立的间接ELISA方法可以用于临床样品的检测。3讨论SVA引起的塞内卡病毒病是猪的一种新发传染优化条件Optimized conditions血清浓度Serum concentration二抗浓度Anti-swine IgG-HRP封闭液Blocking fluidS/P value依S/P value依阳性样品数Number ofpositive samples1234567891011121314病，自2015年以来，SVA已在我国多地检测到16-19。母猪感染该病后，发病率可达90%，产奶量严重下降，进而影响哺乳仔猪的生长，感染SVA的新生仔猪会出现体态瘦弱、嗜睡、食欲不振等临床症状，死亡率可达30%70%20-21。目前国内SVA的研究大多集中在其的致病机制，有研究发现宿主细胞蛋白hnRNP M与SVA基因组存在相互作用，其可通过抑制IRES的翻译活性进一步抑制SVA复制22。而疫苗研究较少，国内外暂无SVA 疫 苗，SVA 病 的 防 控 以 淘 汰 阳 性 猪 为 主，ELISA方法具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的优点，并且可以用于大批量的检测，因此比较适用于基层检测23。目前，针对SVA建立的ELISA方法较多24-27，但均存在散毒、敏感性低等缺点。为了克服以往检测方法的不足，本研究首先选择VP2蛋白的优势抗原区域扩增得到VP2-1基因，将VP2-1基因克隆到原核表达载体中构建pET-32a-rVP2/BL21，经IPTG诱导表达目的蛋白，经纯化获得具有良好生物活性的rVP2，表达出的rVP2蛋白分子结构简单易于纯化，并且不与其它病毒抗体发生交叉反应，将纯化后的rVP2作为包被抗原，通过各反应条件的优化建立了基于rVP2的间接ELISA方法。利用本研究建立的ELISA方法分别对PEDV、PRRSV、PRV、TGEV、CSFV、PCV2阳性血清检测均无交叉反应。抗体稀释倍数是检测间接ELISA方法敏感性的关键指标，其可以直接影响方法的敏感性24，当血清按照1颐800稀释后S/P值仍大于临界值0.201，表明该方法的灵敏度较高。此外，该方法的批内和批间的变异系数均小于10%。表明建立的ELISA方法不仅特异性强、敏感性高，而且重复性好。血清中和试验是检测SVA的金标准23，本研究对河北省各地区猪场的266份血清样品进行抗体检测，结果显示河北各地区血清SVA的平均阳性率达19.1%(50/266)，表明SVA在河北省各地区均存在一定的感染情况。同时利用血清中和试验进行检测，两种检测方法的总符合率为97.7%，符合率较高，表明该间接ELISA方法可以用于临床检测。本研究建立的针对SVA IgG抗体的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、具有良好的稳定性和重复性，为SVA疫苗免疫效果评价、临床检测、流行病学调查提供技术支持，对我国猪塞内卡病毒病的防控具有重要意义。参考文献：SINGK K,CORNER S,CLARK S G,et al.Seneca Valley virusand vesicuar lesions in pig with idiopathic vesicular disease J.J Vet Sci Technol,2012,3(6):1-3.SIMON R.Advances of bioinformatics tools applied in virusepitopes prediction 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