5种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究.pdf

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第 45 卷 第 8 期2023 年 8 月Vol.45，No.8Aug.2023doi院10.3969/j.issn.1008-0589.2022110095种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究赵桂新，付祥，王凤杰，刘万，张志强，张艳英，史秋梅*，吴同垒*(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室，河北 秦皇岛 066004)摘要：为筛选抗牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的中药，本研究选取大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连，测定其对MDBK细胞的最大安全浓度，在此基础上通过计算各药物对病毒的抑制率分析上述中药对IBRV的直接杀伤作用、对IBRV黏附细胞的阻断作用和对IBRV在细胞内的抑制作用，确定上述中药对IBRV的有效抑制率；进一步，利用qPCR方法检测中药与IBRV作用后对MDBK细胞中细胞因子转录水平的影响。结果显示，连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草对MDBK细胞的最大药物安全浓度分别是3.125 mg/mL、3.125 mg/mL、0.780 mg/mL、1.560 mg/mL和0.780 mg/mL；大青叶对IBRV的直接杀伤作用最好，金银花对IBRV黏附细胞的阻断作用和对细胞内IBRV复制的抑制作用最好；鱼腥草可显著提高细胞中TNF-琢、IL-2和IFN-酌的转录水平(0.001)；大青叶可极显著提高细胞中IL-1茁、IL-2、IL-4、TNF-琢和IFN-酌的转录水平(0.001)；黄连可极显著提高细胞中IL-1茁的转录水平(0.001)。结果表明连翘、金银花、黄连、大青叶和鱼腥草均有抗IBRV作用，其抗病毒方式并不相同，本研究为抗IBRV中药的研发奠定基础。关键词：中药；牛传染性鼻气管炎病毒；细胞因子中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：1008-0589(2023)08-0846-07Study on the mode of action of five Chinese herbal medicinesagainst bovine infectious rhinotracheitis virusZHAO Gui-xin,FU Xiang,WANG Feng-jie,LIU Wan,ZHANG Zhi-qiang,ZHANG Yan-ying,SHI Qiu-mei*,WU Tong-lei*(Key Laboratory of Preventive Veterinary Medicine of Hebei Province,Hebei Normal University of Science&Technology,Qinhuangdao 066004,China)Abstract:In order to analyze the anti-bovine infectious rhinotracheitis virus(IBRV)effect of the aqueous extract of Chineseherbal medicine,five Chinese herbal medicines,Da Qing Ye,Jin Yin Hua,Yu Xing Cao,Lian Qiao and Huang Lian,wereselected to determine the maximum safe concentration on MDBK cells,the direct killing effect of these drugs on IBRV,theblocking effect on IBRV adhesion cells and the inhibiting effect on IBRV replication.Cell viability was detected by CCK-8 kit,and the effective inhibition rate of different concentrations of drugs on IBRV was obtained.Further,the effect of Chinese medicineand IBRV on the transcription level of cytokines after acting in MDBK cells was analyzed by qPCR method.The results showedthat the maximum drug safe concentrations of Lian Qiao,Jin Yin Hua,Huang Lian,Da Qing Ye and Yu Xing Cao were3.125mg/mL,3.125mg/mL,0.780mg/mL,1.560mg/mL and 0.780mg/mL on MDBK cells,respectively.Da Qing Ye had the best收稿日期：2022-11-06基金项目：国家自然科学基金(31902310)；河北省农业厅现代农业产业技术体系肉牛疫病防控岗位专家项目(2018NYTRN-1)；河北省重点研发计划(19226628D)作者简介：赵桂新(1995-)，女，河北沧州人，硕士研究生，主要从事微生物学方向研究.*通信作者：E-mail：；*Corresponding authordirect killing effect on IBRV,Jin Yin Hua had the best blocking effect on IBRV adhesion cells and the best inhibiting effect onIBRV replication;Yu Xing Cao significantly increased the transcription level of cellular TNF-琢,IL-2 and IFN-酌(0.001);DaQing Ye significantly increased the transcription level of cellular IL-1茁,IL-2,IL-4,TNF-琢 and IFN-酌(0.001);Huang Liansignificantly increased the transcription level of cellular IL-1茁(0.001),these cytokines play important roles in the antiviral effect.The results showed that all the five herbal medicines above were safe for MDBK cells,and that Lian Qiao,Jin Yin Hua,HuangLian,Da Qing Ye and Yu Xing Cao had different degrees of anti-IBRV effects,which laid a foundation for the development ofanti-IBRV herbal medicines.Key words:traditional Chinese medicine;bovine infectious rhinotracheitis virus;cytokines牛 传 染 性 鼻 气 管 炎(Infectious bovine rhinotra-cheitis，IBR)，又称“红鼻病”，是由牛疱疹病毒1型(BoHV-1)引起的一种急性热性接触性传染的病毒性传染病1，感染后的主要临床表现为呼吸道症状、发热、呼吸困难和粘膜炎等2-3，可导致牛生长缓慢、产奶量减少，还可致孕牛流产，感染牛终身带毒排毒4，并引起免疫抑制，可引发多种病原的混合感染。Madin等在1956年首次分离出病毒并被命名为牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotra-cheitis virus，IBRV)，1964年有学者确认牛鼻气管炎病毒属于疱疹病毒，严重威胁全球养牛业5。世界动物卫生组织(WOAH)已经将IBRV列为必须上报的动物传染病原之一，我国将IBR列为二类动物传染病6-7。目前，我国规模化养牛业迅速发展，为IBR的流行与传播创造了条件，感染率相对较高8。该病的暴发已呈高度蔓延趋势，严重危害我国养牛业发展。中药可以调节畜禽免疫功能，具有抗细菌、抗毒素的作用，不易产生耐药性且毒性小。研究表明，紫玉米的叶、皮和芯中的天然色素-紫玉米花色苷具有良好的抗IBRV的作用9；毛茛树树皮粗提物以及水和乙酸乙酯馏分对病原具有很高的杀伤力和抑制疱疹病毒吸附的能力10；绣线菊提取物在体外以剂量依赖性方式显著抑制牛疱疹病毒1型(Bo-HV-1)的复制11；紫苜蓿提取物能显著抑制MDBK细胞中的BoHV-1复制12。中药在病毒感染方面有良好的潜在应用价值，筛选抗IBRV药物对防治IBR具有重要意义。本研究选用大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连，分析其体外抗IBRV的效果，并初步分析这些中药的抗病毒机制，为抗IBRV感染的中药研发奠定了基础。1材料与方法1.1主要实验材料IBRV临床分离株(TCID50为10-4.46/0.1 mL)和MDBK细胞由河北省预防兽医学重点实验室保存；大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连购自石家庄中医院。1.2主要试剂高糖DMEM培养液、胎牛血清和0.25%胰酶均购自GIBCO公司；利巴韦林和CCK-8试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；荧光定量PCR试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司；细菌RNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司。1.3引物的设计与合成根据GenBank中已登录的序列，设计IL-1茁、TNF-琢、IFN-酌、IL-4、IL-2、IL-6和茁-actin基因用于荧光定量PCR(qPCR)扩增的引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物信息见表1。1.4中药提取液的制备在洁净烧杯中加入中药10 g，并加入100 mL去离子水浸泡1 h；将其放入砂表 1引物信息引物名称Primer nameIL-1茁-FIL-1茁-RIL-2-FIL-2-RIL-4-FIL-4-RIFN-酌-FIFN-酌-RTNF-琢-FTNF-琢-RIL-6-FIL-6-R茁-actin-F茁-actin-R引物序列(5-3)Primer sequences(5-3)TGACCCTAAACAGATGAAGAGCTCACGATGACCGACACCACCACCTCAACTCCTGCCACAATTCCAGCAGCAATGACTTCACGTGTGATATTACCTTAGCACTTCTCAGTTGTGTTCTTATTCAAATTCCGGTGGATGATTCTCTTCCGGCTTTCTGAGGTAACAAGCCGGTAGCCCACGTCTTGATGGCAGACAGGATGGGGAAATCAGGAAAATGTTTCTCCAGCAGGTCAGTGTTCCAAGGCCAACCGTGAGAAGATCCACGTTCCGTGAGGATCTTCA赵桂新，等.5 种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究第 8 期847锅中大火煮至沸后用文火(70)煎煮30 min，滤出药液后再向砂锅中加30 mL去离子水，继续用文火煎煮30 min，滤出滤液；将两次滤液混匀后6 000 r/min离心10 min，取上清液继续煎煮浓缩至10 mL，使中药提取液终浓度为1 g/mL，高压灭菌后用0.22 滋m滤膜过滤，-20 保存备用。1.5药物对MDBK细胞最大安全浓度的测定当96孔细胞培养板中MDBK细胞长成单层时，弃原液后用PBS缓冲液洗2次，将浓度为1 g/mL的中药液稀释5倍至200 mg/mL，该浓度下药液记为原液(下同)，将原液和DMEM培养液按1颐1比例混匀，进行2倍倍比稀释，将5种中药和利巴韦林的稀释液(2 mg/mL、0.2 mg/mL、0.02 mg/mL、0.002 mg/mL)分别加入96孔板中，每孔100 滋L，各稀释度重复8次，于37 5%CO2培养48 h，每天观察细胞的形态变化及生长状况。48 h后用倒置显微镜观察并记录细胞病变情况，其中细胞病变等级可分为4个：“+”代表少量细胞由长梭形皱缩变圆后脱落；“+”代表半数以下细胞皱缩变圆后脱落，出现轻微的蚀斑现象；“+”代表大多数细胞皱缩变圆后脱落，聚集成葡萄串状，在单层细胞上出现较为严重的蚀斑现象；“+”代表几乎所有细胞均皱缩变圆并脱落，聚集成葡萄串样，在单层细胞上形成严重的蚀斑现象。利用CCK-8法测定细胞病变率，用PBS洗96孔板，根据CCK-8试剂盒操作方法向96孔板每孔加入10 滋L CCK-8试剂后将其置于37 5%CO2继续培养4 h，测定每孔细胞OD450nm值，计算细胞病变率，并将细胞病变程度为“+”且细胞病变率最低时的药物浓度判定为药物最大安全浓度，可排除药物本身的毒性作用对细胞的损伤。细胞病变率(%)=(细胞对照组平均OD450nm值-试验加药组平均OD450nm值)/细胞对照组平均OD450nm值伊100%。1.6中药和利巴韦林在不同作用方式下抗IBRV的效果当MDBK细胞密度为70%80%时，选取利巴韦林作为对照，以中药和利巴韦林最大安全浓度为初始浓度2倍倍比稀释(2125)，下同。将各个浓度的药物加入等量的100TCID50IBRV病毒液中，轻轻混匀后置于37 5%CO2培养4 h；以只加病毒原液不加药物的细胞为病毒对照组。取各混合液100 滋L加入96孔细胞板中，记为试验加药组，并设置不加任何药物的细胞对照组，37 孵育2 h，用PBS洗去未吸附的病毒和残余药物，置于温箱中继续培养，每12 h观察并记录细胞病变(CPE)情况。孵育72 h后，用PBS洗96孔板，根据CCK-8试剂盒操作方法向96孔板每孔加入10 滋L CCK-8试剂后将其置于在37 5%CO2继续培养4 h，测定每孔细胞OD450nm值，计算直接杀伤作用下不同浓度药物对IBRV的有效抑制率。药物对病毒的有效抑制率(%)=(试验加药组平均OD450nm值-病毒对照组OD450nm值)/(细胞对照组平均OD450nm值-病毒对照组OD450nm值)伊100%。当96孔细胞板中的MDBK细胞密度为70%80%时，向各个孔中分别加入100 滋L最大安全浓度及2125稀释的各个药物，置于37 5%CO2中孵育4 h，用PBS缓冲液洗板，再向每孔接种100 滋L的100TCID50IBRV病毒液后继续孵育2 h，用PBS缓冲液洗去未吸附病毒，置于温箱中继续培养，每12 h观察并记录CPE情况。孵育72 h后，用PBS洗涤96孔板，方法同1.6.1测定每孔细胞OD450nm值，计算药物对IBRV的有效抑制率。当MDBK细胞密度为70%80%时，向各个孔中加入100 滋L100TCID50病毒液，置于37 5%CO2孵育2 h，用PBS缓冲液洗板，再向每孔中加100 滋L的各个药物浓度梯度稀释液，继续在37 5%CO2培养箱中孵育2 h，用PBS缓冲液洗去残余药物，置于温箱中继续培养，每12 h观察并记录CPE情况。孵育72 h后，用PBS洗96孔板，方法同1.6.1测定每孔细胞OD450nm值，计算药物对IBRV的有效抑制率。1.7药物作用后MDBK细胞中细胞因子转录水平的qPCR检测当6孔细胞培养板中MDBK细胞密度为70%80%时，用PBS缓冲液洗板。预先将药物由最大安全浓度作为初始浓度10倍倍比稀释，稀释度为100102。在细胞对照组孔中加入2 mL 2%胎牛血清DMEM培养液，病毒组孔中加入1 mL 2%胎牛血清DMEM培养液和1 mL病毒液，试验组孔中加入1 mL2%胎牛血清DMEM培养液和1 mL不同浓度的药物与100TCID50IBRV病毒的混合液。在37 恒温箱中培养12 h，吸弃培养液，用细菌RNA快速提取试剂盒提取试验组、细胞对照组和病毒组细胞的总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用SYBR法qPCR测定IL-1茁、TNF-琢、IFN-酌、IL-4、IL-2和IL-6的转录中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年848水平。荧光定量PCR反应体系为25 滋L：SYBR 12.5 滋L、引物各0.5 滋L、cDNA模板1 滋L、ddH2O 10.5 滋L；反应程序：95 10 min，95 15 s、60 1 min、95 15 s共35个循环，60 1 min、95 15 s以及60 15 s。采用2-驻驻Ct法计算目的基因的mRNA水平，用GraphPad Prism8作图。2结果2.1药物对MDBK细胞最大安全浓度的测定结果根据显微镜下观察细胞病变程度发现，用药浓度越高，细胞病变程度越严重(图1)，经CCK-8法检测细胞病变率后，细胞病变程度越轻且细胞病变率越低。结果显示，5种药物对MDBK细胞的最大安全浓度在0.78 mg/mL3.125 mg/mL；其中金银花和连翘的最大安全浓度均为3.125 mg/mL，大青叶最大安全浓度1.56 mg/mL、黄连和鱼腥草的最大安全浓度为0.78 mg/mL，对照组利巴韦林的最大安全浓度为0.002 mg/mL(图1)。表明所选5种药物中金银花和连翘对MDBK细胞安全浓度最高，大青叶次之，黄连和鱼腥草对MDBK细胞安全浓度最低。2.2中药和利巴韦林在不同作用方式下抗IBRV的效果将经5种中药和利巴韦林处理后的病毒液接种细胞后，24 h内会出现一定程度的CPE，48 h后的CPE程度较24 h内CPE的程度更为明显，在显微镜下可以清晰观察到细胞发生皱缩，形态呈圆形，并聚集成葡萄串样，在单层细胞中出现蚀斑现象。根据CCK-8试剂盒说明书标准测定5种中药和利巴韦林对病毒的直接杀伤作用，结果显示，在大青叶、金银花、黄连、连翘、鱼腥草和利巴韦林等药物的最大安全浓度时，中药对病毒抑制率分别为78.7%、76.7%、72.4%、68.3%、52.3%、30.4%；将6种药物最大安全浓度稀释至25倍时，黄连、大青叶、金银花、利巴韦林、鱼腥草和连翘的体外抗IBRV的有效抑制率分别为40.2%、25.4%、23.8%、20.8%、12.5%、11.9%。但随着药物浓度的降低对IBRV的直接杀伤作用减弱(图2)。表明，5种中药在最大安全浓度时对病毒的直接杀伤作用均优于利巴韦林，其中大青叶直接杀伤作用最好；将药物浓度稀释到最大安全浓度的25倍时黄连、大青叶和金银花的直接杀伤作用均优于利巴韦林，但此时鱼腥草与连翘的直接杀伤作用弱于利巴韦林。将不同浓度的5种中药和利巴韦林作用于细胞，再接种病毒液，细胞病变现象同2.2.1。根据CCK-8试剂盒说明书标准测定5种中药和利巴韦林对病毒黏附细胞的阻断作用，结果显示，在利巴韦林、金银花、大青叶、鱼腥草、连翘和黄连等药物的最大安全浓度时对IBRV的有效抑制率分别为64.2%、59.8%、53.6%、49.5%、48.7%、46.7%。将6种药物最大安全浓度稀释至25时，连翘、金银花、黄连、利巴韦林、大青叶和鱼腥草的体外对IBRV的有效抑制率分别为16.7%、12.5%、8.9%、7.1%、7.0%和4.7%。且随着药物浓度的降低，对IBRV有效抑制率也在降低(图3)。表明所选5种中药在最大安全浓度时对病毒15：将药物最大安全浓度2倍倍比稀释到25时的5个不同浓度(2125)，下同。1-5:5 different concentrations when the maximum safe concentrationof the drug is diluted to 25(21-25),the same as below.图2各种药物对IBRV直接杀伤作用的测定结果赵桂新，等.5 种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究第 8 期849金银花Jin Yin Hua黄连Huang Lian连翘Lian Qiao大青叶Da Qing Ye鱼腥草Yu Xing Cao利巴韦林Ribavirin8070605040302010054321图1不同浓度药物作用MDBK细胞48 h后细胞病变率的变化+50454035302520151050图3药物对IBRV黏附细胞的阻断作用粘附细胞的阻断作用均低于利巴韦林，其中金银花的阻断作用优于其他4种中药。先用病毒液作用细胞，再用5种中药和利巴韦林处理细胞，各组细胞出现的CPE现象同2.2.1。根据CCK-8试剂盒说明书标准测定5种中药和利巴韦林对细胞内病毒复制的抑制作用，结果显示，在金银花、大青叶、连翘、黄连、鱼腥草和利巴韦林等药物的最大安全浓度时对IBRV的有效抑制率分别为85.0%、73.5%、65.5%、65.0%、45.2%、42.7%；将6种药物最大安全浓度稀释至25倍时，金银花、大青叶、利巴韦林、黄连、连翘和鱼腥草对IBRV的有效抑制率分 别为20.4%、17.1%、12.3%、8.9%、6.3%、1.1%。且随着药物浓度的降低对IBRV的有效抑制率也在降低(图4)。表明所选5种中药在最大安全浓度时对细胞内病毒复制的抑制作用优于利巴韦林，且金银花的抑制效果最好；将药物最大安全浓度稀释到25时金银花、大青叶对细胞复制的抑制作用均优于利巴韦林。2.3药物作用后MDBK细胞中细胞因子转录水平的qPCR检测结果为在细胞因子水平上揭示上述中药的抗病毒机制，本研究利用qPCR检测各组药物作用后细胞因子转录水平的变化。结果显示，在药物最大安全浓度时，除IL-6转录水平与细胞对照组无显著差异外，其他细胞因子，如IL-1茁、IL-2、IL-4、TNF-琢和IFN-酌的转录水平均不同程度上调(0.05、0.001)。其中，鱼腥草组的TNF-琢、IL-2和IFN-酌的转录水平较细胞对照组显著提高；大青叶组的IL-1茁、IL-2、IL-4、TNF-琢和IFN-酌的转录水平较细胞对照组显著提高；黄连组提高IL-1茁转录水平较为显著；5种中药作用后IL-4转录水平均低于利巴韦林作用后的IL-4转录水平，但较对照组均有提高(图5)。结果表明，中药提取液作用于宿主，通过激活抗病毒细胞因子，尤其是上调炎症相关细胞因子的转录进而抑制IBRV复制，达到抗病毒效果。图4药物对细胞内IBRV复制的抑制作用*:0.001,*:0.001 0.01,*:0.01 0.0513：黄连(100102)；46：鱼腥草(100102)；79：大青叶(100102)；1012：连翘(100102)；1315：金银花(100102)；1618：利巴韦林(100102)；19：病毒组；20：细胞对照组(100102)1-3:Huang Lian(100-102);4-6:Yu Xing Cao(100-102);7-9:Da Qing Ye(100-102);10-12:Lian Qiao(100-102);13-15:Jin Yin Hua(100-102);16-18:Ribavirin(100-102);19:The virus group;20:Cell control group图5细胞因子IL-1茁(A)、IL-2(B)、IL-4(C)、TNF-琢(D)、IFN-酌(E)和IL-6(F)的相对表达量ABCDEF中 国 预 防 兽 医 学 报2023 年8501510502019181716151413121110987654321642020191817161514131211109876543211.00.80.60.40.202019181716151413121110987654321432102019181716151413121110987654321864202019181716151413121110987654321864202019181716151413121110987654321金银花Jin Yin Hua黄连Huang Lian连翘Lian Qiao大青叶Da Qing Ye鱼腥草Yu Xing Cao利巴韦林Ribavirin金银花Jin Yin Hua黄连Huang Lian连翘Lian Qiao大青叶Da Qing Ye鱼腥草Yu Xing Cao利巴韦林Ribavirin70605040302010090807060504030201005432154321123456赵桂新，等.5 种中药体外抗牛传染性鼻气管炎病毒作用方式的研究第 8 期8513讨论国内对IBRV的防治主要采用疫苗接种与抗病毒治疗结合的方式，近年来在大规模禁抗趋势下，抗病毒中药的研究越来越受到关注。大青叶是广谱抗菌药材，具有清热凉血、抗病毒、增强免疫力和保护细胞的作用，其提取液中含有多种抑菌和抗病毒成分。金银花富含绿原酸、木樨草素、多酚、多糖等活性成分，其具有清热解毒、抗炎抑菌、抗氧化和免疫调节等作用13。连翘具有清热解毒、疏散风热、消肿散结等功效14。鱼腥草可抑制病毒侵入细胞。黄连对柯萨奇病毒、流感病毒、风疹病毒、单纯疱疹病毒等具有显著的抗病毒活性15。本研究选取大青叶、金银花、鱼腥草、连翘和黄连等5种中药进行研究，从对IBRV的直接杀伤作用、对IBRV黏附细胞的阻断作用和对IBRV在细胞内复制的抑制作用3个方面进行分析，评价各中药的抗IBRV效果。结果显示，5种中药对IBRV均具有不同程度的抑制病毒作用，从直接杀伤病毒作用和抑制病毒在细胞内复制的作用方面，大青叶和金银花水提液对IBRV的有效抑制率均高于70%，具有较好的抗病毒疗效，金银花具有较好的抑制病毒复制和直接杀灭病毒的作用，与张淼丹等研究发现绿原酸具有直接杀灭病毒，可以有效抑制病毒复制的结果相符16，提示可从中药单体方面进行抗IBRV研究；从阻断病毒黏附细胞方面看，金银花和大青叶水提液抗IBRV效果较好。无论是对病毒直接杀伤、阻断，还是抑制作用方面，IBRV感染的细胞均未出现明显CPE，表明这5种中药对细胞具有保护作用。本研究初步测定了药物的最大安全浓度，为IBRV的药物治疗提供了参考数据，也为探究中药抗病毒作用机理提供了新途径。在3种作用方式中，直接杀伤病毒作用效果最好，可初步推测5种中药可能是通过直接杀灭IBRV而发挥抗病毒作用。中药在安全浓度范围内，能够明显抑制IBRV在MDBK细胞中的增殖，同种中药在不同作用方式下抗IBRV作用效果不同，这些中药的作用机制需要深入研究。IL-1茁和IL-6是重要的炎性因子，参与机体的抗感染免疫；IL-2和IL-4参与免疫应答反应中的调节，分别在机体细胞和体液免疫中发挥重要作用；IFN-酌在防御病毒和胞内菌感染中具有关键作用；TNF-琢主要扩大免疫信号传播，影响T细胞活化、趋化，能够促进机体对病毒感染的免疫防御。中药多糖可以促进细胞因子的表达，进而提高机体的防御能力。张英楠等研究发现刺五加多糖能够不同程度地促进环磷酰胺致免疫抑制雏鸡血液中IFN-酌、IL-2和IL-4等多种细胞因子的转录，从而提高鸡对病原微生物的抵御能力17。为进一步分析选取的5种中药的抗病毒机制，本研究利用其水提取物作用于MDBK细胞，通过qPCR检测关键细胞因子的转录水平，结果 显 示，5 种 中 药 均 能 上 调 IL-1茁、IL-2、IL-4、TNF-琢、IFN-酌基因的转录水平，大青叶、黄连可显著 上 调 IL-1茁 的 转 录 水 平，鱼 腥 草 可 显 著 上 调TNF-琢、IL-2、IFN-酌 的 转 录 水 平。IL-1茁、IL-2、IL-4、TNF-琢和IFN-酌作为广谱抗病毒因子18-20，对某一特定病毒感染并不具有特异性，这也使得以上5种中药可能成为天然广谱型抗病毒药物，在辅助治疗和预防IBRV感染方面起重要作用。各中药对IL-6转录水平的上调不明显，这可能和作用时间、途径以及病毒的免疫逃逸机制等有关系21。5种中药可促进多种细胞因子转录水平上调，揭示其抗IBRV感染的可能机制。本研究分析了金银花、大青叶、连翘、黄连和鱼腥草等5种中药抗IBRV感染的作用效果及其对细胞因子转录水平的影响，为开发抗IBRV中药的研发奠定基础。参考文献：KAHRS R F.Infectious bovine rhinotracheitis:a review and up-date J.J Am Vet Med Assoc,1977,171(10):1055-1064.王承玉，李鑫淼，郑朝朝，等.牛传染性鼻气管炎病毒增殖工艺研究J.中国动物保健，2021，23(11)：113-114.LAUREANA D B,MAURO L,AGUST魱N F,et al.Field evalu-ation of commercial vaccines against infectious bovine Rhinotra-cheitis(Ibr)virus using different immunization protocols J.Vaccines,2021,9(4):408.杨木娇，林俊，张娟，等.牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白在杆状病毒中的表达及抗原性鉴定J.中国预防兽医学报，2022，44(1)：34-40.ISCARO C,CAMBIOTTI V,PETRINI S,et al.Control pro-grams for infectious bovine rhinotracheitis(IBR)in Europeancountries:an overview J.Anim Health Res 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学 报2023 年852