DB32_T 3683-2019 猪链球菌9型PCR检测技术规程(江苏省).pdf

TCS 11.220 B 41 DB32 江苏省抽出ET圃，万标准DB32/T 3683一-2019猪链球菌9型PCR检测技术规程Technical regulation for PCR detecting Streptococcus suis Serotype 9 2019-12-04发布2019-12-25实施江苏省市场监督管理局发布目IJ昌本标准按照GB/T川2009给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出并归口C本标准起草单位:江苏省农业科学院。DB32/T 3683一-2019本标准主要起草人:倪艳秀、何孔旺、周俊明、祝吴丹、吕立新、俞正玉、主丹丹、张雪寒、温立斌、李彬。DB32/T 3683一-2019猪链球菌9型PCR检测技术规程1 范围本标准规定了猪链球菌9型PCR检测技术所用的仪器设备和主要试剂、引物、方法步骤、结果判定、废弃物处理和防止污染的措施等要求O本标准适用于猪链球菌9型的PCR检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范病死及病害动物无害化处理技术规范(农医发(2017)25号)3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 猪链球菌9型Streptococcus suis serotype 9 属于链球菌属的一种细菌，根据其英膜多糖抗原的差异，可分为1-31、33及112共33个血清型。猪链球菌9型是猪链球菌的一个血清型，不仅对猪致病性很强，而且可以感染特定的人群，是一种人兽共患病病原菌。4 仪器设备和主要试剂4.1 仪器设备高速离心机、水浴锅、PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统。4.2 主要试剂生理盐水、超纯水、蛋白酶K、2xPCRMix、琼脂糖(电泳级人DNA分子量标准(DL2000 Marker)0 5 引物5.1 上游引物5-GGCTACATATAATGGAAGCCC-3。5.2 下游引物5-CCGAAGTATCTGGGCTACTG-3。6 方法步骤6.1 样品处理6.1.1 病料样品处理DB32/T 3683一-2019采用差速离心法，取约5g病料(月干或肺或脑组织、)，剪碎研磨，用5mL生理盐水混悬，先2000r1min离心2min，去除大组织块，取上清液，后10000 r1min离心5min，弃上j青液，沉淀以200L超纯水重悬，备用。6.1.2 待检培养物样品处理耳又持检液体培养物(纯培养物或混合培养物)1 mL 10000 r/min离心5min，弃上洁，沉淀以200L超纯水重悬，备用O阴性对照THB培养基。阳性对照:猪链球菌9型标准菌株(22083)的THB培养物。阴性、阳性对照也同样处理，对每个样品进行编号标记。6.2 DNAt.lU 取6.1获得的样品及对照，每200L加入3L蛋白酶K(20 mg/mU,42 oc作用1h，煮沸5min,10 000 r/min离心5min，上请作为模板DNAo6.3 PCR扩增6.3.1 反应条件按25L体系进行，2x PCR Mix 12.5队，上游引物(10pmo1/U 1.0队，下游引物(10pmol/U 1.0队，模板DNA2.0L，超纯水8.5L。按如下条件进行PCR反应。950C5川n，然后进入循环94oC 30 sec,55 oC 30 sec,72 oC 30 sec,35个循环，于72oC延伸10min,40C保存。6.3.2 电泳将PCR反应产物于1.2%琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120V，时间30mino 6.3.3 结果观察用胶成像系统观察结果，并进行拍照。7 结果判定7.1 检测结果成立条件阳性对照的PCR产物电泳后在389bp的位置上出现一条特异性条带，阴性对照PCR产物电泳后没有条带(见附录A)，检测结果成立;否则，结果不成立。7.2 结果判定7.2.1 在检测结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在389bp的位置上出现一条特异性条带，判为阳性，即该样品为猪链球菌9型核酸阳性。7工2在检测结果成立的前提下，如果检测样品中PCR产物电泳后在389bp的位置上未出现一条特异性条带，判为阴性，即该样品为猪链球菌9型核酸阴性。7工3如果阳性对照、无相应的目的条带，可能是存在操作失误，该检测需要重复进行;如果阴性对照有相应的目的条带，可能是阴性对照存在污染或是操作失误，该检测需要重复进行。8 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，应做好无害化处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录Bo2 2000bp一一一一一一一一M一-DNA分子量标准(DL2000 Marker)1 阳性对照;2 阴性对照。附录A(资料性附录)猪链球菌9型PCR产物电泳图M 2 389bp 图A.l猪链球菌9型PCR产物电泳图DB32/T 3683一-20193 DB32/T 3683一-2019附录B(规范性附录)检测过程中防止交叉污染的措施B.1 抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，121 oC,15 min20 min灭菌，一套清洁工具限于一个样品使用C存放样品的容器应该经过清洗、灭菌，或为一次性灭菌容器。B.2 检测过程B.2.1 PCR实验室应分为样品制备区、前PCR区、PCR区、后PCR区。将模板提取、PCR反应液配制、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从净区到脏区单方向进行。B工2实验过程中，应穿实验服和戴手套，于套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。B工3各区所有的试剂、器材(尤其是移液器)、仪器都应专用，不得带出该区。B工4所有溶液、水、耗材和器具要121oC,15日ln20日ln灭菌，避免核酸和(或)核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和超纯水。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。B工5装有DNA模板:eX;号|物的离，心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。B.2.6 前PCR区中，在PCR操作箱中加人PCR反应各组分。B.2.7 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNAo4